2018, Vol. 20
榛子除了可被食用外，其提取制剂还有消炎、防腐和扩张血管等作用，同时对高血压亦有良好的治疗效果[1-2]。榛子壳含有丰富的半纤维素和纤维素，是发酵制备木糖醇的天然碳源[3]。然而榛树在生长过程中容易感染各种病虫害[4]，农药的使用在所难免。苯醚甲环唑和丙环唑常用于防治榛树白粉病，啶虫脒和噻虫嗪常用来防治榛实象甲和蒙古灰象甲等害虫。日本制定了苯醚甲环唑、丙环唑、噻虫嗪和啶虫脒在坚果中的最大残留限量 (MRLs) 值分别为0.03、0.05、0.02和0.1 mg/kg[5]，中国制定了苯醚甲环唑和丙环唑在坚果中的MRLs值分别为0.03 mg/kg和0.02 mg/kg[6]，但尚未制定啶虫脒和噻虫嗪在坚果中的MRLs值。
高效液相色谱-质谱联用 (HPLC-MS/MS) 技术已广泛用于坚果中农药多残留的分析，如：董亚蕾等[7]采用QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法研究了花生、杏仁、腰果和核桃等坚果中38 种农药的残留；杨巍等[8]采用高效液相色谱-串联质谱法测定了核桃、杏仁和花生等坚果中 62 种农药残留，但均未涉及对榛子中农药多残留分析方法的研究，且缺乏苯醚甲环唑和丙环唑在坚果上的残留分析方法。QuEChERS前处理方法因操作简单、快速及高效，已被广泛用于农药残留测定[9-11]，常用乙腈作为提取剂，加入MgSO4和NaCl等盐包，通过N-丙基乙二胺 (PSA)、石墨化碳黑 (GCB) 等净化剂去除杂质[12] 。高尧华等[13]利用QuEChERS-气相色谱串联质谱法研究了大豆、花生及粮油中56 种农药的残留检测，平均回收率为62%～116%；王坦等[14]利用QuEChERS- HPLC-MS/MS法测定油料作物中苯磺隆的残留量，平均回收率87%～111%；Lopes等[15]将乙酸乙酯和乙腈混合液作为提取剂，采用改进的QuEChERS样品前处理方法和超高效液相色谱-串联质谱 (UPLC-MS/MS) 分析了花生中 113 种农药的残留。以上研究充分证明，QuEChERS法对含油量高的物质有很好的应用前景。
鉴于此，本研究选择4种在榛树中应用较多的农药，采用QuEChERS-高效液相色谱-质谱联用，建立一种快速、高效的残留检测方法，用于测定榛子上的农药残留，同时也为其他坚果类样品多农药残留检测提供借鉴。
1 材料与方法 1.1 药剂、试剂与仪器99.30%苯醚甲环唑 (difenoconazole)、99.40%丙环唑 (propiconazole)、98.80%噻虫嗪 (thiamethoxam) 和98.80%啶虫脒 (acetamiprid) 标准品，均由德国Dr.Ehrenstorfer公司生产；色谱纯乙腈和甲酸，分析纯乙腈、甲醇、正己烷、无水硫酸镁和氯化钠，弗罗里硅土、N-丙基乙二胺 (PSA)(40 μm) 和石墨化碳黑 (GCB) (40 μm)，均购自天津博纳艾杰尔科技有限公司。
Agilent1290-6460液相色谱串联三重四极杆质谱仪和MassHunter工作站软件 (美国Agilent公司)；超纯水仪 (美国Millipore公司)；万分之一天平 (德国Sartorius公司)；涡旋振荡器 (美国Scientific Industries公司)；SL-200型高速多功能粉碎机 (浙江省永康市松青五金厂)；高速冷冻离心机 (日本HITACHI公司)。
1.2 样品前处理榛仁富含油脂，脂肪含量在53.8%～63.3%[16]。以乙腈作为提取剂时，油脂容易被提取，不仅对检测结果产生影响，而且会缩短色谱柱的使用寿命，增加试验成本[17-18]。供试4种农药在丙酮、乙醇和甲醇中的溶解度均较高[19]，但由于丙酮挥发性较高，故在提取过程中出现的误差较大。鉴于榛壳中油脂的含量较少，故本研究选择榛子为研究对象，考察了甲醇、乙腈及经正己烷饱和的乙腈[20]3种提取剂对4种农药的提取效果。由于榛子含水量低，故选择以3 g无水硫酸镁和2 g氯化钠为盐包。在QuEChERS前处理方法中，净化剂的种类主要有C18、GCB、PSA和弗罗里硅土等[21]，其中：C18和GCB在净化过程中对叶绿素及其极性小分子干扰物有良好的吸附效果；PSA主要用于去除极性有机酸、糖类及脂类等杂质；弗罗里硅土主要吸附基质中的油脂。鉴于榛仁中富含油脂，故选用弗罗里硅土作为榛仁的净化剂[22]；同时考虑榛壳中存在少量的杂质和色素，故考察了GCB、PSA这2种净化剂对榛壳的净化效果及回收率的影响。设添加水平为0.1 mg/kg。试验设置3个重复，回收率根据基质标样以单点对照的方式计算。
将榛子的榛壳和榛仁分开，分别用高速粉碎机粉碎。
棒仁：准确称取5 g榛仁粉末到50 mL离心管中，加入5 mL超纯水，涡旋1 min，加入5 mL正己烷饱和的乙腈，涡旋3 min；依次加入2 g氯化钠和3 g无水硫酸镁，摇匀后涡旋1 min，于5 000 r/min下离心5 min。取1.5 mL样品提取液加入含有净化剂 (50 mg弗罗里硅土 + 150 mg无水硫酸镁) 的2 mL离心管中，涡旋1 min，于5 000 r/min下离心5 min。取上清液，过0.22 μm有机滤膜，待HPLC-MS/MS分析。
棒壳：准确称取5 g榛壳粉末到50 mL的离心管中，加入5 mL超纯水，涡旋1 min，加入5 mL分析纯乙腈，涡旋3 min。依次加入2 g氯化钠和3 g无水硫酸镁，摇匀后涡旋1 min，于5 000 r/min下离心5 min。取1.5 mL样品提取液加入含有净化剂 (30 mg GCB + 20 mg PSA + 150 mg无水硫酸镁) 的2 mL离心管中，涡旋1 min，于5 000 r/min下离心5 min。取上清液，过0.22 μm有机滤膜，待HPLC-MS/MS分析。
1.3 标准溶液配制及标准曲线的绘制标准储备溶液: 分别称取0.01 g (精确至0.000 1 g) 苯醚甲环唑、丙环唑、噻虫嗪和啶虫脒标准品，用色谱纯乙腈溶解并定容至100 mL，配制成100 mg/L的混合标准储备液。分别用色谱纯乙腈和基质 (榛仁、榛壳) 空白对照液逐级稀释，配成0.01、0.05、0.1、0.5、1和2 mg/L的系列混合标准工作溶液和基质匹配标准工作溶液。现用现配，所有溶液均于4 ℃下避光保存。
基质效应 (ME) 会对目标化合物的响应值产生影响。本研究中按公式 (1) 计算ME。当ME > 0时为基质增强效应，当 ME < 0时为基质减弱效应 [23]。
| ${M_{\rm E}}/{\text\%} = \left(\frac{{S_{\rm m}}}{{S_{\rm s}} }- 1 \right) \times 100$ | (1) |
式中：ME为基质效应；Sm为基质匹配标准溶液曲线斜率；Ss为溶剂标准溶液曲线斜率。
外标法定量，分别以4种化合物基质标准溶液的质量浓度为横坐标，监测定量离子对的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。
1.4 检测条件色谱条件：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱 (50 mm × 2.1 mm，1.8 μm)；柱温40 ℃；进样体积1 μL；流动相A相为乙腈，B相为体积分数为0.2%的甲酸水溶液，梯度洗脱程序起始流动相为10% A，> 1.0～3.5 min为65% A，> 3.5～5 min为10% A，流速为0.4 mL/min。用80%甲醇水溶液洗针。
质谱条件：电喷雾离子源 (ESI+)，正离子扫描多反应监测模式 (MRM)，雾化气为99.95%氮气；碰撞气和干燥气为99.999%氮气；干燥气温度325 ℃；流速8.0 L/min；鞘气温度350 ℃；流速10.0 L/min；毛细管电压4.5 kV；喷嘴电压500 V。其他质谱条件见表1。
|
表 1 四种化合物的质谱参数 Table 1 Mass spectrometric parameters for the detection of 4 compounds |
2 结果与讨论 2.1 色谱条件的优化
选用C18色谱柱 (50 mm × 2.1 mm，1.8 μm)，设定流速为0.4 mL/min，分别考察了以乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.2%甲酸水溶液和甲醇-0.2%甲酸水溶液为流动相时对4种化合物检测结果的影响，梯度洗脱程序同1.4节。结果表明：选用乙腈-0.2%甲酸水为流动相时，4种化合物分离效果较好，能获得更高的响应值和更好的峰形 (图1)。
|
A：苯醚甲环唑；B:丙环唑；C：噻虫嗪；D：啶虫脒 A: difenoconazole; B: propiconazole; C: thiamethoxam; D: acetamiprid 图 1 四种化合物的HPLC-MS/MS MRM典型色谱图 (0.1 mg/kg) Fig. 1 Typical HPLC-MS/MS MRM chromatograms of 4 Compounds (0.1 mg/kg) |
2.2 质谱条件的优化
以乙腈-0.2%甲酸水溶液作为流动相，梯度洗脱程序同1.4节。取0.1 mg/L的4种化合物的标准溶液进行正离子模式全扫描，4种化合物均能获得稳定的母离子，且响应值较高；然后在扫描离子检测 (SIM) 模式下扫描，进一步优化裂解电压值；子离子扫描，每种化合物选择2个响应值高的子离子分别为定性离子和定量离子；最后在多反应监测模式 (MRM) 下优化碰撞能、驻留时间等质谱参数 (表1)，在最佳条件下对4种化合物进行检测。
2.3 前处理方法的优化 2.3.1 提取溶剂的选择比较了甲醇、乙腈及经正己烷饱和的乙腈3种提取溶剂对榛仁的提取效果。混合标准工作溶液添加水平为0.1 mg/kg，提取溶剂用量为5 mL。结果表明：以甲醇作为提取溶剂时，油脂被大量提取出，容易污染仪器，干扰测定；以乙腈作为提取溶剂时，上清液中仍残存少量的油脂，且上清液量较少，丙环唑的平均回收率仅为70%，不符合农药残留分析标准[24]；以正己烷饱和的乙腈作为提取溶剂时，上清液几乎澄清，且4种化合物的平均回收率在81%～116%，提取效果良好。鉴于此，本研究选用经正己烷饱和的乙腈作为榛仁的提取溶剂。
比较了甲醇和乙腈2种提取溶剂对榛壳的提取效果。混合标准工作溶液添加水平为0.1 mg/kg，提取溶剂用量5 mL。结果表明：以甲醇作为提取溶剂时，上清液不足以后续试验需求；以乙腈作为提取溶剂时，提取效果良好，4种化合物的平均回收率在73%～104%。故采用乙腈作为榛壳的提取溶剂。
2.3.2 净化剂的选择及优化比较了30、50、100及150 mg弗罗里硅土 + 150 mg无水硫酸镁对榛仁的净化效果。结果表明：以 50 mg弗罗里硅土 + 150 mg无水硫酸镁为净化剂时，净化效果良好，平均回收率在75%～113%之间。
比较了PSA和GCB对榛壳的净化效果。结果 (表2) 表明：单一使用PSA为净化剂时，4种化合物在榛壳中的回收率在79%～95%之间，虽符合国家标准，但净化效果不理想，且榛壳中的色素没有除尽，容易导致管路堵塞[17]；单一使用GCB时，净化效果较好，但回收率较低，笔者认为可能是过量的GCB对药剂有吸附作用[21]；选用30 mg GCB + 20 mg PSA和40 mg GCB + 20 mg PSA为净化剂时，4种化合物在榛壳中的回收率均在73%～104%之间，净化效果良好。从经济角度出发，最终选用30 mg GCB + 20 mg PSA + 150 mg无水硫酸镁为榛壳的净化剂。
|
|
表 2 不同净化剂对4种化合物在榛壳中回收率的影响 Table 2 Effect of different sorbents on the recovery of 4 compounds in the hazelnut shell |
与前人研究结果[7, 13]相比，本研究中的提取溶剂和净化剂用量少，耗时短，样品前处理方法简单、快速、高效。
2.4 方法的确证 2.4.1 方法的线性范围及基质效应结果 (表3) 表明：在0.01～2 mg/kg范围内，4种化合物在榛仁和榛壳中的质量浓度与对应的响应值间呈良好的线性关系，决定系数 (R2) > 0.990 2。从 表3可以看出，丙环唑在榛仁和榛壳中均为基质增强效应 (ME分别为22%和4%)，苯醚甲环唑在榛壳中为基质增强效应 (6%) 在榛仁中为基质减弱效应 (–20%)，噻虫嗪和啶虫脒在榛仁、榛壳中均为基质减弱效应 (–15%～ –36%)。从上述数据看出基质效应是不可避免的。本研究采用外标法基质匹配标准曲线定量消除基质效应，此法效果良好，廉价、操作简便[25]、结果准确。
|
|
表 3 四种化合物在榛子中的线性范围、定量限及基质效应(线性范围：0.01~2 mg/kg) Table 3 The linear ranges, quantitative limits and matrix effects of 4 compounds in hazelnut (linear range: 0.01-2 mg/kg) |
2.4.2 方法的准确度和精密度
添加回收试验结果 (表4) 表明：在0.01、0.1和1 mg/kg 3个添加水平下，4种化合物在榛子中的日内平均回收率为79%～111%，相对标准偏差 (RSDs)(n = 5) 为0.6%～6.9%；日间平均回收率为81%～110%，RSDs(n = 15) 为1.0%～8.5%。数据表明，该分析方法准确性和稳定性满足农药残留分析的要求[24]。
|
|
表 4 四种化合物在榛子中的平均添加回收率和相对标准偏差 Table 4 The recoveries and relative standard deviations of 4 compounds in hazelnut |
2.5 实际样品的分析
选择辽宁省铁岭市与开原市2地市售的榛子作为检测对象，应用本研究所建立的方法测定4种农药的残留情况。结果表明：2地榛仁和榛壳中，苯醚甲环唑、噻虫嗪、啶虫脒和丙环唑的残留量均小于0.01 mg/kg。
3 结论试验选择了东北地区代表性坚果榛子 (榛仁、榛壳) 为研究对象，建立了QuEChERS样品前处理方法结合高效液相色谱-串联质谱测定榛子、中苯醚甲环唑、噻虫嗪、啶虫脒和丙环唑4种农药残留的检测方法。样品以经正己烷饱和的乙腈溶液作为榛仁的提取溶剂，以乙腈作为榛壳的提取溶剂；选用弗罗里硅土 + 150 mg无水硫酸镁作为榛仁的净化剂，30 mg GCB + 20 mg PSA + 150 mg无水硫酸镁作为榛壳的净化剂，试验过程简单、快捷，减少了有机溶剂用量，降低了试验成本。本方法尝试用于榛子中4种农药的多残留分析，检测2组榛子样品，结果显示4种农药的残留量均小于0.01 mg/kg。
| [1] |
侯智霞, 原牡丹, 刘雪梅, 等. 我国榛子生产研究概况[J]. 经济林研究, 2008, 26(2): 123-126. HOU Z X, YUAN M D, LIU X M, et al. Survey of production and researches on hazelnut in China[J]. Nonw Forest Res, 2008, 26(2): 123-126. DOI:10.3969/j.issn.1003-8981.2008.02.027 |
| [2] |
李宁, 苏淑钗, 景淼, 等. 榛子的国内外研究概况[J]. 山东林业科技, 2011, 41(1): 96-98. LI N, SU S C, JING M, et al. Research survey at home and abroad of hazel[J]. Shandong Forestry Sci Technol, 2011, 41(1): 96-98. DOI:10.3969/j.issn.1002-2724.2011.01.031 |
| [3] |
孙也婷. 榛子壳水解液发酵制备木糖醇的工艺研究[D]. 沈阳: 沈阳农业大学, 2016. SUN Y T. Study on producing xylitol by biological fermentation with the hydrolysate from hazelnut shell[D]. Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2016. |
| [4] |
马瑞峰. 榛树主要病虫害发生规律及其防治[J]. 黑龙江农业科学, 2016(4): 53-56. MA R F. Survey on major pests and diseases of Corylus heterophlla fisch [J]. Heilongjiang Agric Sci, 2016(4): 53-56. |
| [5] |
The Japan Food Chemical Research Foundation. Maximum residue limits (MRLs) list of agricultural chemicals in foods[DB/OL].(2018-2-1)[2018-10-6] http://www.m5.ws001.squarestart.ne.jp/foundation/search.html
|
| [6] |
食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量: GB 2763—2016[S]. 北京: 中国标准出版社, 2017. National food safety standard-maximum residue limits for pesticides in food: GB 2763—2016[S]. Beijing: Standards Press of China, 2017. |
| [7] |
董亚蕾, 刘文婧, 曹进, 等. QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定坚果中38种农药残留[J]. 分析化学, 2017, 45(9): 1397-1404. DONG Y L, LIU W J, CAO J, et al. Determination of 38 kinds of pesticide residues in nuts by QuEChERS-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chin J Anal Chem, 2017, 45(9): 1397-1404. |
| [8] |
杨巍, 粟有志, 李芳, 等. 固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定坚果中62种农药残留[J]. 分析科学学报, 2015, 31(6): 825-831. YANG W, LI Y Z, LI F, et al. Determination of 62 pesticide residues in nuts by solid-phase extraction-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Anal Sci, 2015, 31(6): 825-831. |
| [9] |
KOESUKWIWAT U, LEHOTAY S J, MASTOVSKA K, et al. Extension of the QuEChERS method for pesticide residues in cereals to flaxseeds, peanuts, and doughs[J]. J Agric Food Chem, 2010, 58(10): 5950-5958. DOI:10.1021/jf902988b |
| [10] |
HERRMANN S S, POULSEN M E. Clean-up of cereal extracts for gas chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry pesticide residues analysis using primary secondary amine and C18[J]. J Chromatogr A, 2015, 1423: 47-53. DOI:10.1016/j.chroma.2015.10.086 |
| [11] |
CUNHA S C, LEHOTAY S J, MASTOVSKA K, et al. Evaluation of the QuEChERS sample preparation approach for the analysis of pesticide residues in olives[J]. J Sep Sci, 2007, 30(4): 620-632. DOI:10.1002/(ISSN)1615-9314 |
| [12] |
刘亚伟, 董一威, 孙宝利, 等. QuEChERS在食品中农药多残留检测的应用研究进展[J]. 食品科学, 2009, 30(9): 285-289. LIU Y W, DONG Y W, SUN B L, et al. Summary of application of QuEChERS method in multi-residue determination of pesticides in food[J]. Food Sci, 2009, 30(9): 285-289. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2009.09.067 |
| [13] |
高尧华, 滕爽, 宋卫得, 等. 大豆、花生及粮油中56种农药残留量的检测方法[J]. 大豆科学, 2018, 37(2): 284-294. GAO Y H, TENG S, SONG W D, et al. Detection methods of 56 pesticide residues in soybean, peanut and grain oil[J]. Soyb Sci, 2018, 37(2): 284-294. |
| [14] |
王坦, 董茂锋, 宋卫国, 等. QuEChERS-高效液相色谱串联质谱法测定油料作物中苯磺隆残留量[J]. 农药, 2017, 56(4): 269-272. WANG T, DONG M F, SONG W G, et al. Determination of tribenuron-methyl residues in oil crops by QuEChERS-HPLC/MS/MS[J]. Agrochemicals, 2017, 56(4): 269-272. |
| [15] |
LOPES R P, OLIVEIRA F A S, MADUREIRA F D, et al. Multiresidue analysis of pesticides in peanuts using modified QuEChERS sample preparation and liquid chromatography-mass spectrometry detection[J]. Anal Meth, 2015, 7(11): 4734-4739. DOI:10.1039/C5AY00331H |
| [16] |
田文翰, 梁丽松, 王贵禧. 不同品种榛子种仁营养成分含量分析[J]. 食品科学, 2012, 33(8): 265-269. TIAN W H, LIANG L S, WANG G X. Nutrient composition analysis of hazelnut kernel from different varieties[J]. Food Sci, 2012, 33(8): 265-269. |
| [17] |
LEHOTAY S J, SAPOZHNIKOVA Y, HAN L J, et al. Analysis of nitrosamines in cooked bacon by QuEChERS sample preparation and gas chromatography-tandem mass spectrometry with backflushing[J]. J Agric Food Chem, 2015, 63(47): 10341-10351. DOI:10.1021/acs.jafc.5b04527 |
| [18] |
MORRIS B D, SCHRINER R B. Development of an automated column solid-phase extraction cleanup of QuEChERS extracts, using a zirconia-based sorbent, for pesticide residue analyses by LC-MS/MS[J]. J Agric Food Chem, 2015, 63(21): 5107-5119. DOI:10.1021/jf505539e |
| [19] |
PPDB: pesticide properties database[EB/OL].(2018-04-07)[2018-06-06]. http://sitem.herts.ac.uk/aeru/ppdb/en/index.htm
|
| [20] |
GUARDIA-RUBIO M, FERNÁNDEZ-DE CÓRDOVA M L, AYORA-CAÑADA M J, et al. Simplified pesticide multiresidue analysis in virgin olive oil by gas chromatography with thermoionic specific, electron-capture and mass spectrometric detection[J]. J Chromatogr A, 2006, 1108(2): 231-239. DOI:10.1016/j.chroma.2006.01.006 |
| [21] |
黄运瑞, 周庆祥. 固相萃取吸附剂的研究进展[J]. 冶金分析, 2012, 32(12): 22-28. HUANG Y R, ZHOU Q X. Research progress of solid phase extraction adsorbent[J]. Metall Anal, 2012, 32(12): 22-28. DOI:10.3969/j.issn.1000-7571.2012.12.004 |
| [22] |
李月. 表面活性剂合成改性弗罗里硅土及其在农药分析中的应用[D]. 沈阳: 东北大学, 2008. LI Y. Florisil synthesizing and additive altering and applying it to pesticide analysis[D]. Shenyang: Northeastern University, 2008. |
| [23] |
KMELLÁR B, FODOR P, PAREJA L, et al. Validation and uncertainty study of a comprehensive list of 160 pesticide residues in multi-class vegetables by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Chromatogr A, 2008, 1215(1-2): 37-50. DOI:10.1016/j.chroma.2008.10.121 |
| [24] |
农药残留试验准则: NY/T 788—2004[S]. 北京: 中国农业出版社, 2004. Guideline on pesticide residue trials: NY/T 788—2004[S]. Beijing: China Agriculture Press, 2004. |
| [25] |
KWON H, LEHOTAY S J, GEIS-ASTEGGIANTE L. Variability of matrix effects in liquid and gas chromatography-mass spectrometry analysis of pesticide residues after QuEChERS sample preparation of different food crops[J]. J Chromatogr A, 2012, 1270: 235-245. DOI:10.1016/j.chroma.2012.10.059 |