2. 华南农业大学 农学院,广州 510642
2. College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
家蚕Bombyx moriL. 原产于中国,是一种具有很高经济价值的泌丝昆虫,人工驯化已有5 000多年历史。由于长期的自然选择和人工选择,同时经过长期室内饲养,家蚕对野外生存条件、特别是对农药等外源化合物的适应能力很弱[1]。在中国,由于农桑混植比较普遍,农田使用药剂发生飘移以及桑园病虫害防治用药不当都可能会导致桑叶污染,从而引起家蚕农药中毒,影响其生长发育过程及桑蚕养殖业经济[1-2],每年因农药残留造成的家蚕中毒事件可导致中国蚕茧产量损失在30%以上[3]。因此,在中国农药登记与环境安全评价中,农药对家蚕的急性毒性是一项必不可少的指标[4]。此外,随着环境生态保护意识的增强,研究农药对家蚕的慢性毒性也越来越受到重视,但目前关于杀菌剂对家蚕影响的研究报道并不多。现有研究显示,一些杀菌剂可影响家蚕正常的生长发育和生理代谢,造成眠蚕质量下降、眠起不齐及发育历期延长等问题,进而影响家蚕的全茧量、茧层量和茧层率等[2, 5],给养蚕业造成较大的经济损失。因此,重视农药污染对家蚕的慢性毒性同样具有重要意义。
苯醚甲环唑 (difenoconazole) 属三唑类脱甲基抑制剂,具有内吸性和治疗作用,防病谱广[6]。嘧菌酯 (azoxystrobin) 属甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂,具有保护、治疗、铲除和抗产孢作用[7]。目前上述2种杀菌剂均已被广泛应用于柑橘、葡萄、花卉等果树及其他农作物病害的防治中[8],但有关其对家蚕的相关研究均主要集中在急性毒性和风险评估方面[9-12]。鉴于此,本研究采用食下毒叶法测定了苯醚甲环唑和嘧菌酯常用剂型对家蚕的急性毒性和生长发育毒性,以期为上述杀菌剂对家蚕生态风险的全面评估及其合理使用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 供试家蚕家蚕Bombyx moriL. 品种为P50,由浙江省杭州市蚕桑所提供。用常规方法催青、自主孵化和饲养。饲养条件:恒温箱温度 (26 ± 2)℃,相对湿度75%~85%,光照16 h : 8 h。急性毒性和生长发育毒性均采用健康、生长一致的2龄起蚕供试。
1.2 药剂有效成分质量分数为10%的苯醚甲环唑水分散粒剂 (10% difenoconazole WG),其田间推荐最高剂量为450倍液 (有效成分220 mg/L);有效成分质量浓度为250 g/L的嘧菌酯悬浮剂 (250 g/L azoxystrobin SC),田间推荐最高剂量为750倍液 (有效成分200 mg/L)。上述药剂均由先正达 (苏州) 作物保护有限公司生产。
1.3 试验方法急性毒性试验采用文献推荐的浸叶法[4]连续喂食染毒桑叶,生长发育毒性试验参考池艳艳等的方法[8]。
1.3.1 急性毒性测定根据预试验所确定的浓度范围,按一定比例设置5个梯度质量浓度 (有效成分,以下同) (嘧菌酯125、250、500、1 000及2 000 mg/L,苯醚甲环唑100、200、400、800及1 600 mg/L),并设1个空白对照。每处理3次重复,每重复20头2龄起蚕。采用浸叶法染毒,选取桑树顶端新鲜有光泽的嫩叶,以20 mL不同浓度药液均匀浸渍5 g桑叶,浸渍10 s后于通风处晾干。以清水浸渍桑叶为空白对照。将处理后桑叶移入12 cm培养皿中,接入健康、有活力的2龄起蚕,置于 (26 ± 2)℃恒温培养箱内,按常规方法饲养,连续喂食染毒桑叶96 h,分别观察记录24、48、72及96 h的累积死亡数、存活家蚕头数及中毒症状。对照组死亡率小于10%的试验为有效试验。计算累积死亡率和校正死亡率,并运用SPSS 19.0软件进行统计分析,得出2种杀菌剂制剂对家蚕的96h-LC50值及其95%置信限。
1.3.2 生长发育毒性试验通过急性毒性试验,观察2种农药不同浓度处理组家蚕的生长发育和蜕皮情况,并参照急性试验浓度,以农药的田间最高推荐剂量按比例稀释后进行家蚕生长发育毒性试验。按一定比例分别设3个质量浓度处理组 (嘧菌酯250、125及62.5 mg/L,苯醚甲环唑200、100及50 mg/L) 及1个空白对照组,每组3个重复,每重复20头2龄起蚕。给药及空白对照组桑叶处理同1.3.1节。记录家蚕各龄期的发育历期、眠蚕体重和平均每雌产卵量;于结茧8 d后剪开蚕茧,称量茧层量及全茧量,计算结茧率、茧层率、化蛹率和死笼率;待羽化后记录羽化虫数,计算羽化率[8]。
1.4 数据分析试验数据采用Excel 2013和SPSS 19.0软件进行统计分析。
2 结果与分析 2.1 家蚕中毒症状观察
经2种杀菌剂处理后,家蚕的中毒症状具有一定相似性,如体缩、吐液、僵直、体色发黑、呈“C”形或“S”形以及拒食等 (表2),详情见附加材料1补充图 (SFig. 1)。此外,经同种药剂不同浓度处理后,家蚕的中毒症状存在一定差异,通常高浓度处理组中毒症状更明显。
2.2 供试2种杀菌剂对家蚕的急性毒性
从2种杀菌剂对家蚕的96 h-LC50值 (表3) 可知,10%苯醚甲环唑WG和250 g/L嘧菌酯SC对家蚕的毒性等级均为低毒,其风险性等级为低风险性[4]。
2.3 供试2种杀菌剂对家蚕的生长发育毒性 2.3.1 对家蚕发育历期的影响
结果见表4。10%苯醚甲环唑WG于2~3龄期给药,各处理组受试家蚕2龄和3龄的发育历期均与对照差异显著 (P < 0.05);4龄时,100和200 mg/L浓度组与对照差异显著 ( P < 0.05);各浓度组5龄家蚕的发育历期均与对照无显著差异 ( P < 0.05)。
250 g/L嘧菌酯SC 62.5 mg/L浓度组对2龄家蚕发育历期的影响与对照无显著差异 (P < 0.05),125和250 mg/L浓度组则与对照差异显著 ( P < 0.05);3龄时,62.5 和250 mg/L浓度组与对照均差异显著 ( P < 0.05),且250 mg/L浓度组入眠家蚕几近于无;对4龄和5龄家蚕而言,则62.5和125 mg/L浓度组的发育历期与对照无显著差异 ( P < 0.05)。
总之,于2~3龄期给药,2种杀菌剂在一定程度上均会影响受试家蚕的发育历期,尤其是经250 g/L嘧菌酯SC处理后,总体发育历期与对照相比显著延长了1~5 d (P < 0.05),且其发育历期随药剂质量浓度的增大而延长。经10%苯醚甲环唑WG处理2~3龄期的家蚕幼虫后,其总体发育历期与对照相比差距不超过10 h,差异不显著 ( P < 0.05)。且随着试虫龄期增大,2种杀菌剂各浓度组与对照的差异均趋于不显著。
2.3.2 对家蚕眠蚕和熟蚕体重的影响结果 (表5) 显示:10%苯醚甲环唑WG于家蚕2~3龄期给药,随着药剂质量浓度升高,眠蚕体重均显著降低,且呈现剂量-效应关系,其中4眠时,50 mg/L处理组与对照存在显著差异 (P <0.05);其余各浓度处理组熟蚕体重与对照则均无显著差异 (P < 0.05)。
250 g/L嘧菌酯SC于家蚕2~3龄期给药,各浓度组2龄眠蚕体重与对照相比均有显著差异 (P < 0.05);3龄之后,250 mg/L处理组家蚕由于发育差异太大,入眠时间相差严重,从第7天开始出现大量家蚕死亡,至第21天死亡率高达95%~100%,因此无法测得眠蚕体重;此外,125和62.5 mg/L组对4龄眠蚕和熟蚕体重的影响与对照差异显著 ( P < 0.05),且死亡率分别为25%和0,而这2个处理组对3龄眠蚕体重的影响与对照却无显著差异 ( P < 0.05)。
总之,于2~3龄期给药,供试2种农药均会在一定程度上影响受试家蚕眠蚕体重。经10%苯醚甲环唑WG处理后,4眠时50 mg/L组与对照存在显著差异 (P < 0.05);250 g/L嘧菌酯SC处理后,其各龄期眠蚕体重与对照相比均有显著差异 ( P < 0.05)。
2.3.3 对家蚕经济学性状的影响结果 (表6) 显示:于家蚕2~3龄期给药,随着苯醚甲环唑质量浓度升高,茧层量显著降低,且存在显著的剂量-效应关系 (P < 0.05);各浓度处理组家蚕的结茧率也均受到显著影响 ( P < 0.05);而各浓度组全茧量、茧层率、化蛹率、死笼率及羽化率则均与对照无显著差异 ( P < 0.05)。
于家蚕2~3龄期给药,随嘧菌酯质量浓度升高,茧层量逐渐下降至0,且存在明显的剂量-效应关系 (P < 0.05);其最高剂量 (250 mg/L) 处理组家蚕存活率仅为5%,且基本无蚕茧收获,严重影响其经济学特性各相关指标,与对照差异显著 ( P < 0.05);125 mg/L组除茧层量之外的其他指标均与对照无显著差异 ( P < 0.05)。
总之,于2~3龄期给药,2种农药均会影响受试家蚕的经济学性状,其中主要影响结茧率和茧层量2个指标。
2.3.4 对家蚕繁殖能力的影响结果见图1A。10%苯醚甲环唑WG于家蚕2~3龄期给药,各浓度组家蚕的平均每雌产卵量与对照相比差异均不显著 (P < 0.05),表明在试验浓度范围内,10%苯醚甲环唑WG对家蚕产卵影响不大。
由图1B可见,250 g/L嘧菌酯SC各浓度处理组家蚕的产卵量与对照相比均差异显著 (P < 0.05),且随着药剂质量浓度升高,每雌产卵量呈显著下降趋势,高剂量 (250 mg/L) 组由于均未结茧化蛹,产卵量为0。
3 结论与讨论
笔者通过急性毒性和慢性生长发育毒性试验,研究了广泛使用的2种杀菌剂制剂——10%苯醚甲环唑WG和250 g/L嘧菌酯SC对家蚕的影响。结果表明:虽然2种杀菌剂对家蚕的急性毒性皆表现为低毒和低风险性,但其中10%苯醚甲环唑WG对家蚕的经济学性状指标具有一定影响,且会显著影响家蚕的发育历期和眠蚕体重 (P < 0.05);250 g/L嘧菌酯SC也会严重影响家蚕的经济学性状指标 ( P < 0.05),且在最高田间推荐剂量下会严重影响家蚕的繁殖。此外,经2种杀菌剂处理后,从第7天开始出现死亡幼虫,同时有未结茧蛹、未结茧死亡家蚕及死笼家蚕等现象;在熟蚕上簇时,仍有少数家蚕吐出少许浮丝,且出现不结茧就死亡的现象 [详情见附加材料2 (SFig. 2)]。
本研究中,10%苯醚甲环唑WG的96 h-LC50 值为353.58 mg/L,与池艳艳等[9]报道的苯醚甲环唑原药的96 h-LC50值 (713.40 mg/L) 相比差异较大,推测可能制剂中的其他成分产生了增毒作用,但按照家蚕急毒性评价标准[4],仍为低风险性。此外,本研究结果还远远低于俞瑞鲜等[10]采用食下毒叶法测定的苯醚甲环唑微乳剂 (ME) 对家蚕的96 h-LC50值 (46.5 mg/L);与吕铭潇等[11]采用浸叶法测得的400 g/L苯醚甲环唑SC的96 h-LC50值 (6.68 mg/L) 差异更大。表明不同剂型及来自不同厂家的苯醚甲环唑药剂对家蚕的急性毒性存在较大差异。本研究中,250 g/L嘧菌酯SC的96 h-LC50值 (498.66 mg/L) 与池艳艳等[13]报道的96%嘧菌酯原药的96 h-LC50值 (795.57 mg/L) 相比差异也较大,同样有可能是由于制剂中的其他成分产生了增毒作用;而与吕铭潇等[11]采用浸叶法测得的50%嘧菌酯WG的96 h-LC50值 (883.79 mg/L) 相比差异也较大,表明嘧菌酯对家蚕的急性毒性同样与剂型、有效成分含量及生产厂家等因素相关。
Vassarmidaki等[14]报道,25%噻嗪酮可湿性粉剂 (buprofezin 25% WP) 对家蚕全茧量和茧层量的影响与给药浓度呈负相关。谢道燕等[15]报道,8种农药在喷施桑树3~30 d后采摘,仍会对家蚕的发育历期、眠蚕体重及其他主要经济学性状等指标产生不同程度的影响;同时他们还发现东莨菪內酯原药不仅会延长家蚕发育历期,而且会造成全茧量、茧层量、化蛹率和蛹重等指标显著下降[16]。此外,有研究发现,2种典型微生物农药苏云金芽孢杆菌以及球孢白僵菌原药对家蚕的结茧率和死笼率均具有显著影响[17]。上述报道均是关于杀虫剂对家蚕慢性毒性的研究,而有关杀菌剂对家蚕生长发育毒性,尤其是田间推荐剂量下杀菌剂对家蚕生长发育影响的相关报道还很少。谢道燕等[2]发现,7种常用杀菌剂按不同剂量喷施桑树后,家蚕取食桑叶,对眠蚕质量、发育历期以及全茧量和茧层量均有不同程度的影响。本研究中参考田间推荐剂量处理2龄起家蚕,发现10%苯醚甲环唑WG处理组出现幼虫发育历期延长、眠蚕体重增加及熟蚕吐浮丝不结茧等中毒症状,且其眠蚕体重在2、3眠时呈现先升高后降低的趋势;经250 g/L嘧菌酯SC处理后,家蚕幼虫发育历期与对照组相比显著延长,同时出现发育严重不齐、眠蚕体重降低、熟蚕吐浮丝或不吐丝死亡,以及未结茧即化蛹等中毒现象。
生产中在使用对家蚕急性毒性为剧毒和高毒的农药时,通常会注意避开桑园和正常养蚕时期,但对低毒农药却往往容易忽视。根据本研究结果,10%苯醚甲环唑WG和250 g/L嘧菌酯SC对家蚕的急性毒性虽为低毒,但其对家蚕的发育历期、眠蚕体重、繁殖力及其他主要经济学性状等指标均会产生不同程度的影响,因此,在田间使用这2种药剂时也应注意有效规避桑园和养蚕时期,以免给蚕业经济造成损失。
致谢:感谢浙江省杭州市蚕桑所馈赠供试家蚕,同时感谢许光治老师给予的帮助。
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