灰葡萄孢Botrytis cinerea可为害近600属1 000余种植物，引起灰霉病，严重影响田间及大棚设施蔬菜、水果等的产量和品质^[1]。在植物病原真菌危害评估中，灰葡萄孢排在第2位，仅次于稻瘟病菌^[2]。以草莓为例，中国草莓的年产量和栽培面积均超过世界总量的1/3，稳居世界第一位，浙江省则是草莓的主产区之一，其中建德市还创新性地建起了“草莓小镇”。灰霉病可造成草莓花及果实腐烂，低温、高湿天气发病更为严重，一般可减产30%左右，严重时可达60%以上^[3]。

化学防治是目前防治灰霉病的主要措施，以啶酰菌胺 (boscalid) 为代表的琥珀酸脱氢酶抑制剂类 (SDHIs) 杀菌剂是近10年来生产上广泛应用的主要药剂类型之一。啶酰菌胺由德国巴斯夫公司于1992年发现其具有杀菌活性并申请专利，现已在50多个国家获准登记，用于防治100多种作物上包括灰霉病在内的80多种病害^[4-5]。灰葡萄孢具有繁殖和遗传变异快、再侵染频繁等特点，很容易产生抗药性，属于具有高抗药性风险的病原菌之一^[6]。本研究以笔者等于啶酰菌胺在中国灰霉病防治上大面积应用之前所建立的敏感性基线为依据^[7]，采用菌丝生长速率法，连续监测了浙江省果蔬上灰葡萄孢对啶酰菌胺的敏感性变化，并分析了相应的抗性分子机制，以期为生产中灰葡萄孢对啶酰菌胺的抗性研究和治理提供科学依据。

95%啶酰菌胺 (boscalid) 原药，由浙江来益生物技术有限公司提供，用丙酮配制成4 × 10⁴ mg/L的母液，4 ℃下保存。

从浙江省杭州市、宁波市、嘉兴市及建德市等10个地区的草莓、番茄、黄瓜和葡萄栽培大棚中随机采集已感染灰霉病的病果，参考文献方法对灰葡萄孢Botrytis cinerea进行分离、鉴定和保存^[7]。来源于每一病果的病原菌保留1株，每个采样大棚保留5～7株。所有菌株均在4 ℃下保存于马铃薯葡萄糖琼酯 (PDA) 斜面上。

采用菌丝生长速率法^[7-8]。各菌株先在PDA平板上于23 ℃下活化培养3 d，然后制取直径5 mm的菌丝块并接种到含系列浓度药剂的PDA平板中央，以不含药剂者为对照 (CK)，每处理重复2次。药剂处理具体系列浓度根据不同菌株对啶酰菌胺的敏感性来确定。23 ℃下培养3 d后测量各处理的菌落直径 (cm)，取平均值计算抑制率 (%)。利用DPS软件，通过浓度对数值 (x)-抑制率几率值 (y) 之间的线性回归关系，求出毒力回归方程和有效抑制中浓度 (EC₅₀)。以2004—2006年采集的果蔬灰葡萄孢对啶酰菌胺的敏感性基线[(1.07 ± 0.11) mg/L]^[7]为依据，计算抗性倍数 (RF) 值 (RF = 菌株EC₅₀值/敏感性基线)。根据RF值，参考赵建江等的方法^[9]确定各菌株的敏感性类型：RF < 10为敏感菌株 (S)；10 ≤ RF < 50为低水平抗药性菌株 (LR)；50 ≤ RF < 100为中等水平抗药性菌株 (MR)；RF ≥ 100为高水平抗药性菌株 (HR)。

随机选择啶酰菌胺抗性菌株和敏感菌株各5株，参考文献[8]的方法分别测定各菌株的生长速率、产孢量、产菌核数和致病力。各菌株分别在PDA平板上于23 ℃预培养3 d，打取直径为5 mm的菌块，接种于PDA平板中央，每株菌接种9个平板。23 ℃培养3 d后采用十字交叉法随机测量其中3个平板的菌落直径，用其平均值代表生长能力；7 d后向其中3个平板各加入10 mL无菌水，制成孢子悬浮液，在血球计数板上统计各菌株的孢子悬浮液浓度，以其平均值代表产孢能力；15 d后统计剩余3个平板上的产菌核数量。整个试验重复3次。

各菌株于23 ℃培养箱中培养3 d后打取5 mm菌块，接种至2叶期黄瓜叶片中央，每张叶片接种1个菌块，每株菌接种5张叶片，于23 ℃培养箱中保湿培养3 d后，统计各叶片上病斑直径，以其平均值代表致病能力。试验重复3次。

根据敏感性测定结果，随机选取敏感性不同的部分菌株，以其DNA为模板，运用4 对引物 (表1) 分别扩增琥珀酸脱氢酶 (SDH) 的SDH A、SDH B、SDH C和SDH D 4 个亚基的DNA片段，并对其进行测序，结果采用BIOXM软件，与NCBI中的BLAST进行序列比对分析及数据处理。

表 1 (Table 1)

表 1 PCR扩增所用引物 Table 1 Primers used for PCR reaction 基因名称 Gene name 引物名称 Primer 序列 Sequence (5′→3′) 序列长度 Size/bp 退火温度 Annealing temperature/℃ SDH A LzsSdhA-F ATTTGGAAACGCCCTTGGAC 3 065 54 LzsSdhA-R CATTACCGAACAATCCCGCA SDH B LzsSdhB-F ACCTACTCGCCCTATCCAAT 1 077 54 LzsSdhB-R AGACTTAGCAATAACCGCCC SDH C LzsSdhC-F GCCAGATTTCCTTAGTCAG 1 208 52 LzsSdhC-R GCTGGACTCTGAATGTGAT SDH D LzsSdhD-F AGCCAATCAAATCCGTTCCG 854 56 LzsSdhD-R CAAACTCCTCCCTGCCCTCT

表 1 PCR扩增所用引物 Table 1 Primers used for PCR reaction

2004—2006年于浙江、江苏等地采集的果蔬灰葡萄孢对啶酰菌胺的敏感性基线EC₅₀值为 (1.07 ± 0.11) mg/L^[7]。2012—2013年和2017—2018年分别采集、检测了236和240株果蔬灰葡萄孢，结果表明，浙江省果蔬灰葡萄孢对啶酰菌胺的敏感性呈现明显降低的趋势 (表2)。其中2012—2013年的EC₅₀值在0.11～32.05 mg/L之间，平均EC₅₀值为 (5.23 ± 7.79) mg/L，是敏感性基线的4.9倍；2017—2018的EC₅₀值在0.11～679.56 mg/L之间，平均EC₅₀值为 (24.30 ± 49.33) mg/L，是敏感性基线的22.7倍。从抗药性菌株发生频率看，2012—2013年总的抗性频率为15.3%，且均为低水平抗性 (LR) 菌株；而2017—2018年总的抗药性菌株频率上升至53.2%，且其中包括了7.5%的中等水平抗性 (MR) 菌株和1.3%的高水平抗性 (HR) 菌株。

表 2 (Table 2)

表 2 浙江省果蔬灰葡萄孢对啶酰菌胺的敏感性变化 Table 2 Shift of sensitivity to boscalid in B. cinea collected from fruits and vegetables in Zhejiang Province 采样年份 Sampled year EC50 值范围 EC50 range/(mg/L) 平均 EC50 值 Mean EC50 value/(mg/L) 敏感性表型 Sensitive phenotype 敏感 S 低水平抗性 LR 中等水平抗性 MR 高水平抗性 HR 2004—2006 0.09~3.69 1.07 ± 0.11 228 (100.0%) * 0 (0.0%) 0 (0.0%) 0 (0.0%) 2012—2013 0.11~32.05 5.23 ± 7.79 200 (84.7%) 36 (15.3%) 0 (0.0%) 0 (0.0%) 2017—2018 0.11~679.56 24.30 ± 49.33 112 (46.7%) 107 (44.6%) 18 (7.5%) 3 (1.3%) 注：*菌株数 (频率)。Note：*No. of isolates (Frequency).

表 2 浙江省果蔬灰葡萄孢对啶酰菌胺的敏感性变化 Table 2 Shift of sensitivity to boscalid in B. cinea collected from fruits and vegetables in Zhejiang Province

结果 (表3) 表明，5株抗药性菌株及5株敏感菌株间菌丝生长速率、产孢量、产菌核数及致病力差异与其对啶酰菌胺的敏感性之间并无明显联系，表明抗药性菌株的适合度未出现明显下降。

表 3 (Table 3)

表 3 灰葡萄孢对啶酰菌胺抗性和敏感菌株菌丝生长速率、产孢量、产菌核数及致病力比较 Table 3 Comparison in growth rate, sporulation, sclerotial production and pathogencity between boscalid resistant and sensitive isolates of B. cinerea 菌株 Isolate EC50/(mg/L) 表型 Phenotype 菌落直径 Colony diameters/cm 产孢量 (×106)/(个/mL) Sporulation capacity (×106)/(spore/mL) 产菌核数 No. of sclerotial 病斑直径 Scab diameters/cm X12-1 31.84 R 6.60 c 2.43 ab 57 e 3.47 e X12-4 12.51 R 5.87 b 2.67 ab 59 e 3.27 de Z13-8 12.05 R 5.53 a 2.50 ab 38 a 3.07 bcde ZJ12-6 27.64 R 6.43 c 2.53 ab 47 d 2.97 cd JD13-2 34.79 R 5.67 ab 2.57 ab 43 c 2.47 a X13-2 0.45 S 5.57 ab 2.57 ab 58 e 3.13 bcde B13-6 0.83 S 5.57 ab 2.37 a 39 ab 2.83 abc Z12-1 0.98 S 5.87 b 2.37 a 46 d 3.37 de BQ12-3 0.40 S 5.43 a 2.73 b 42 bc 3.33 de GS13-6 1.13 S 6.30 c 2.70 b 57 e 2.77 ab 注：数据为平均值 (n = 3)，同列数据后不同字母表示不同处理间差异显著 (Turkey氏多重比较，P < 0.05)。Note：Difference was analyzed among the three treatments of each site and different letters indicate significant differences among different treatments (Turkey’s multiple comparison, P < 0.05).

表 3 灰葡萄孢对啶酰菌胺抗性和敏感菌株菌丝生长速率、产孢量、产菌核数及致病力比较 Table 3 Comparison in growth rate, sporulation, sclerotial production and pathogencity between boscalid resistant and sensitive isolates of B. cinerea

对随机选取的38株灰葡萄孢 (含12株S、16株LR、8株MR和2株HR) SDH 4个亚基的序列进行了分析，结果 (表4) 表明：敏感 (S) 菌株除X17-22外，其余菌株的SDH B均未发生突变。而啶酰菌胺不同抗性水平菌株的SDH B均发生了点突变，包括：272 位由组氨酸 (His) 突变为精氨酸 (Arg)，即H272R；225 位由脯氨酸 (Pro) 突变为苯丙氨酸 (Phe)，即P225F；230位由天冬氨酸 (Asn) 突变为异亮氨酸 (Ile)，即N230I。其中H272R型突变占绝大多数，共23株，P225F和N230I型突变分别有1株和2株。所有菌株的SDH A和SDH D均未发现突变。在SDH C亚基序列分析中，抗、感菌株均有在85、93、158和168位同时发生4点突变的情况 (G85A + I93V + M158V + V168I)，即同时在85 位由甘氨酸 (Gly) 突变为丙氨酸 (Ala)，93 位由异亮氨酸 (Ile) 突变为缬氨酸 (Val)，158 位由甲硫氨酸 (Met) 突变为缬氨酸 (Val)，以及168 位由缬氨酸 (Val) 突变为异亮氨酸 (Ile)；而其中在SDH C亚基80位发生I80H点突变的菌株 [即由异亮氨酸 (Ile) 变为组氨酸 (His)] 均为抗性菌株。

表 4 (Table 4)

表 4 啶酰菌胺抗性及敏感菌株中SDH上4个亚基序列比对分析 Table 4 Comparison of boscalid-sensitive and resistant isolates of B. cinerea in four subunits of SDH，including SDH A, SDH B, SDH C and SDH D 菌株 Isolate 啶酰菌胺敏感性 Sensitivity to boscalid SDH 突变情况 Mutations in SDH EC50/(mg/L) 表型 Phenotype SDH A SDH B SDH C SDH D XB17-05 78.29 MR ‒ P225F ‒ ‒ LB17-04 34.83 LR ‒ N230I ‒ ‒ LB12-17 67.76 MR ‒ N230I ‒ ‒ XB17-01 1.232 S ‒ ‒ ‒ ‒ LB17-22 0.616 S ‒ ‒ ‒ ‒ LB17-06 1.247 S ‒ ‒ ‒ ‒ AB17-01 3.187 S ‒ ‒ ‒ ‒ LB13-07 2.062 S ‒ ‒ ‒ ‒ LB17-18 1.784 S ‒ ‒ ‒ ‒ SB17-26 0.112 S ‒ ‒ ‒ ‒ AB13-08 0.392 S ‒ ‒ ‒ ‒ JB17-19 1.534 S ‒ ‒ ‒ ‒ JB17-38 41.07 LR ‒ H272R ‒ ‒ SB12-18 43.84 LR ‒ H272R ‒ ‒ XB17-02 45.65 LR ‒ H272R ‒ ‒ SB17-31 26.49 LR ‒ H272R ‒ ‒ LB17-19 50.13 LR H272R I80H ‒ LB13-36 48.34 LR ‒ H272R I80H ‒ LB17-40 65.28 MR ‒ H272R I80H ‒ QB12-37 26.64 LR ‒ H272R ‒ ‒ HB17-39 69.63 MR ‒ H272R ‒ ‒ B17-07 233.7 HR ‒ H272R ‒ ‒ QB13-22 22.83 LR ‒ H272R ‒ ‒ B17-10 59.10 MR ‒ H272R ‒ ‒ SB12-14 80.13 MR ‒ H272R ‒ ‒ B17-29 31.51 LR ‒ H272R ‒ ‒ X17-03 57.42 MR ‒ H272R ‒ ‒ QB13-01 17.99 LR H272R G85A，I93V，M158V，V168I ‒ X17-22 1.752 S ‒ H272R G85A，I93V，M158V，V168I ‒ SB12-17 97.38 MR ‒ H272R G85A，I93V，M158V，V168I ‒ JB17-30 679.56 HR ‒ H272R G85A，I93V，M158V，V168I ‒ SB12-02 30.37 LR ‒ H272R G85A，I93V，M158V，V168I ‒ B17-03 47.38 LR ‒ H272R G85A，I93V，M158V，V168I ‒ SB13-10 32.66 LR ‒ H272R G85A，I93V，M158V，V168I ‒ SB17-11 20.99 LR ‒ H272R G85A，I93V，M158V，V168I ‒ JB12-08 53.45 LR ‒ H272R G85A，I93V，M158V，V168I ‒ PB17-01 0.684 S ‒ ‒ G85A，I93V，M158V，V168I ‒ TB13-09 0.758 S ‒ ‒ G85A，I93V，M158V，V168I ‒ 注：‒ 表示未发生突变。Note：‒ mean that none mutation was found.

表 4 啶酰菌胺抗性及敏感菌株中SDH上4个亚基序列比对分析 Table 4 Comparison of boscalid-sensitive and resistant isolates of B. cinerea in four subunits of SDH，including SDH A, SDH B, SDH C and SDH D

近几年的研究发现，生产中灰葡萄孢对啶酰菌胺已产生不同程度的抗性^[9-11]。本研究在前期建立的灰葡萄孢对啶酰菌胺的敏感性基线^[7]基础上，连续监测了病原菌群体对啶酰菌胺的敏感性变化。结果表明：浙江省果蔬灰葡萄孢对啶酰菌胺的抗性发展迅速，与2004—2006年相比，其抗药性频率于2012—2013年上升至15.3%，2017—2018年高达53.2%，抗性菌株已成为优势群体；不过大多数抗性菌株为低水平抗性 (LR)，中等 (MR)及高水平抗性 (HR) 菌株发展相对较慢，2012—2013年发生频率为0，2017—2018年为8.8%。说明在加大施药剂量的前提下，啶酰菌胺在果蔬灰霉病防治上还有一定的应用价值。但是，生产上必须重视灰葡萄孢对啶酰菌胺抗性的延缓与治理，因此实际应用时最好在明确抗药性现状的基础上有针对性地用药。目前关于灰葡萄孢对多菌灵 (carbendazim)、嘧菌酯 (azoxystrobin) 等药剂抗性的快速检测技术已有报道^{[1, 12]}，而对于主要药剂之一啶酰菌胺抗性的现场快速检测技术还有待进一步研究开发。

另外，本研究依据RF值，参考赵建江等的方法^[9]来确定菌株是否具有抗药性，该方法根据FAO推荐的常规抗药性检测方法，以RF ≥ 10作为抗药性菌株的判定标准^[13]。除了RF值，国内外也有研究采用区分剂量法来检测灰葡萄孢对啶酰菌胺的抗性^[14]。

已有研究表明，灰葡萄孢对啶酰菌胺的抗性是由琥珀酸脱氢酶B亚基的突变引起的，但相关的突变类型较多，其中以P225L/F/T和H272Y/R/L较为常见^[15]。本研究未发现SDH A、SDH C和SDH D亚基存在和对啶酰菌胺抗性相关的突变，而抗药性菌株的SDH B则均发生了点突变，包括H272R、P225F和N230I 3 种类型，其中H272R型突变占88.5%。但也存在个别例外情况，如敏感菌株X17-22的SDH B亚基虽然也发生了H272R突变，却依然对啶酰菌胺敏感，其具体调控机制还有待进一步研究。

本研究表明，在浙江省果蔬田间，目前可考虑通过检测H272R突变实现对大多数啶酰菌胺抗性灰葡萄孢菌株的快速检测，以指导灰霉病的科学合理防治，但同时还需密切关注其他突变类型的发生及发展情况，以保证检测结果的科学性和准确性。