2018, Vol. 20
2. 福建农业职业技术学院 生物技术学院，福州 350119;
3. 海南师范大学 化学与化工学院，海口 571158;
4. 华南农业大学 农学院，广州 510642
2. College of Biotechnology, Fujian Vocational College of Agriculture, Fuzhou 350119, China;
3. College of Chemistry and Chemical Engineering, Hainan Normal University, Haikou 571158, China;
4. College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
植物源农药具有残留低、选择性高和对非靶标生物相对安全等优点，已成为近年来开发利用的热点[1-2]。山蒟Piper hancei Maxim.又名山蒌，为胡椒科 (Piperaceae) 多年生常绿木质藤本植物，分布于中国南部各省区，民间用于治疗风湿痛、关节痛和气喘等[3-4]。目前，对山蒟的研究主要集中在其种类的鉴别分类[3]、医学上提取物抗血小板聚集和降低动脉粥样硬化作用[5-6]。迄今为止，前人已从山蒟中分到新木脂素[7-10]、巴豆环氧素[8]、β-谷甾醇[8]、脂肪链酰胺[4, 10-13]、马兜铃内酰胺[11-12]、香草酸[11]、黎芦酸[11]和胡萝卜苷[11]等化合物及精油成分[14]，并发现新木脂素是血小板活化因子 (platelet activating factor) 受体拮抗活性的主要成分[7, 9]。笔者在前期的研究中发现，山蒟甲醇提取物对家蝇、致倦库蚊、白纹伊蚊、椰心叶甲、斜纹夜蛾和香蕉花蓟马等具有一定的杀虫活性，并配制了其提取物的微乳剂[15-18]。为了进一步研究山蒟中的主要杀虫活性成分，笔者对山蒟整株甲醇提取物的石油醚和氯仿萃取相进行了分离，采用核磁共振和质谱检测等手段，对其化学结构进行了鉴定，并进一步测定了其杀虫活性。
1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 植物样品山蒟Piper hancei Maxim.全株采自福建省光泽县乌君山，由华南农业大学李秉滔教授鉴定，标本保存在华南农业大学林学院标本馆。
1.1.2 供试昆虫白纹伊蚊Aedes albopictus和致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus均由广东省卫生防疫站提供，参考文献方法[15]饲养。
1.1.3 主要仪器与试剂EYELA (N-1100) 旋转蒸发仪 (日本东京理化器械株式会社)；Heidolph Laborota 20 control旋转蒸发仪 (德国Heidolph公司)；ESI源质谱仪API2000 LC/MS (美国应用生物系统公司)；Nexus 470 FT-IR型红外光谱仪 (KBr压片法，美国Nicolet公司)；RY-1G熔点仪 (天津市新天光仪器公司)；AV-600核磁共振仪 (瑞士Bruker公司)；FED400烘箱 (德国Binder公司)；TOLEDO ME104型电子天平 (瑞士Mettler公司)。柱色谱硅胶及GF254硅胶薄层板 (青岛海洋化工)；Heathcare凝胶Sephdex LH-20 (美国GE公司)。试剂均为分析纯 (广州化学试剂厂)；对照药剂为98%鱼藤酮原药 (Aladdin试剂公司)。
1.2 试验方法 1.2.1 山蒟甲醇冷浸提和萃取采用冷浸提取法。将采集的山蒟根、茎和叶阴干，于65 ℃下烘干3 h，合并粉碎。称取粉碎后的样品58.25 kg，用150 L甲醇浸泡3 d后提取，反复提取3次。滤液在60 ℃下减压蒸馏浓缩，得到甲醇提取浸膏。合并3次浸提膏，最终得到8.94 kg浸膏，置于4 ℃冰箱内保存，备用。
分别取200 g浸提膏，用2 L去离子水溶解后倒入5 L分液漏斗中，用2 L石油醚萃取，水相再依次用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别得到石油醚相1.75 kg、氯仿相415.33 g、乙酸乙酯相138.00 g、正丁醇相563.21 g和水相5.43 kg。
1.2.2 化合物的分离通过预试验发现，山蒟中主要活性成分分布在石油醚相和氯仿相，故对这两相进一步分离。
1.2.2.1 石油醚相中活性成分的分离采用100~200目硅胶柱层析，用V (石油醚) : V (丙酮) = 12:0~12:10梯度洗脱 (12:0表示洗脱剂为纯石油醚，每次极性调整，高极性溶剂梯度增加1个单位，下同)，得到178个馏分，薄层层析检验，合并相同组分。通过3次柱层析 (300~400目硅胶)，洗脱系统分别为V (石油醚) : V (丙酮) = 12:0~12:7、V (石油醚) : V (乙酸乙酯) = 12:0~12:10和V (石油醚) : V (氯仿) = 12:0~12:12，之后再用凝胶Sephadex LH-20柱分离，用丙酮洗脱，得到化合物C1 (329 mg) 和C2 (5 108 mg)。
1.2.2.2 氯仿相中活性成分的分离采用100~200目硅胶柱层析，先用V (石油醚) : V (氯仿) = 10:0~10:10进行梯度洗脱，再用V (氯仿) : V (甲醇) = 20:0~20:5继续洗脱，收集到83个馏分，经薄层层析检验合并相同组分，得到A~D 4组。A组：采用200~300目硅胶柱层析，先用V (石油醚) : V (丙酮) = 10:2~10:4进行梯度洗脱，再用Sephadex LH-20凝胶柱分离，丙酮洗脱，得到化合物C3 (160 mg)。B组：采用200~300目硅胶柱层析，V (石油醚) : V (氯仿) = 17:0~17:3梯度洗脱，得到 B1~B4 4组，其中B1组，采用200~300目硅胶柱层析，V (氯仿) : V (甲醇) = 20:0~20:5梯度洗脱，再用Sephadex LH-20凝胶柱分离，甲醇洗脱，得到化合物C4 (242 mg)。C组：采用200~300目硅胶柱层析，先用V (氯仿) : V (甲醇) = 20:0~20:2梯度洗脱，再用V (乙酸乙酯) : V (甲醇) = 90:0~90:40梯度洗脱，最后经凝胶sephadex LH-20柱分离，甲醇洗脱，得到化合物C5 (1 072 mg) 和C6 (447 mg)。
1.2.3 结构鉴定通过 1H NMR、13C NMR、无畸变激化转移增益谱 (DEPT) 和二维谱对所分离化合物的结构进行表征。以氘代丙酮 (Acetone-d6)、氘代甲醇 (CD3OD) 为溶剂，四甲基硅烷 (TMS) 为内标。根据质谱图分析推断出化合物的相对分子质量。
1.2.4 杀虫活性测定称取各化合物0.004 g，用1 mL丙酮溶解并定容至2 mL，超声波处理10 min，得到2 000 mg/L的化合物母液。取2 mL母液，用自来水 (阳光下放置12 h脱氯) 稀释并定容至200 mL，得到最终质量浓度为20 mg/L的供试药液。对照为2 mL丙酮以水定容至200 mL。
采用幼虫浸液法[19]测定化合物对白纹伊蚊和致倦库蚊的杀虫活性。将50 mL供试药液转移入50 mL烧杯中，吸取发育一致的4龄幼虫30只，转移到微型过滤网上，过滤掉多余水分，然后迅速转移入烧杯内，每处理重复3次。以含同量丙酮的脱氯水作为对照。试验在温度25 ℃ ± 1 ℃、相对湿度60%~80%的温室内进行，12 h后检查死虫数。计算平均校正死亡率。
分别选取杀虫活性较好的化合物进行毒力测定 (LC50值)。先以丙酮为溶剂配制母液 (白纹伊蚊2 500 mg/L，致倦库蚊2 000 mg/L)，再用丙酮等比稀释，最后用脱氯自来水稀释成系列浓度供试药液 (白纹伊蚊：25.00、12.50、6.25、3.125和1.562 5 mg/L；致倦库蚊：20.00、10.00、5.00、2.50和1.25 mg/L)。以鱼藤酮原粉为药剂对照，以质量分数为1%的丙酮水溶液为溶剂对照。按照幼虫浸液法[19]测定各浓度下的杀虫活性。利用DPS 9.50版软件计算毒力回归方程、LC50值及95%置信限。用Duncan氏新复极差法 (DMRT) 进行处理间差异显著性分析。
2 结果与分析 2.1 化合物结构鉴定C1：浅黄色油状物 (丙酮)，结构鉴定数据与文献数据[20]一致，故鉴定为chingchengenamide A。
C2：白色片状结晶 (丙酮)，熔点87.5~88.5 ℃，结构鉴定数据与文献数据[10]一致，故鉴定为N-异丁基-反-2-反-4-癸二烯酰胺 (N-isobutyldeca-trans-2-trans-4-dienamide)。
C3：白色针状晶体 (丙酮)，熔点127~128 ℃，结构鉴定数据与文献数据[21]一致，故鉴定为假荜拨酰胺A (retrofractamide A)。
C4：白色结晶 (丙酮)，熔点165~166 ℃，结构鉴定数据与文献数据[22]一致，故鉴定为荜茇宁 (piperlonguminine)。
C5：白色粉末 (甲醇)，熔点240.0~241 ℃，结构鉴定数据与文献数据[23]一致，故鉴定为N-p-香豆酰酪胺 (N-p-coumaroyltyramine)。
C6：白色粉末 (丙酮)，熔点138~140 ℃，结构鉴定数据与文献数据[24]一致，故可推断为N-反式-阿魏酰酪胺 (N-trans-feruloyltyramine)。
化合物C1~C6的结构式见图式 1。
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图式1 从山蒟分离到的系列脂肪链酰胺类化合物 Scheme1 Aliphatic chain amides sepatated from Piper hancei |
2.2 杀虫活性
测定结果 (表1和表2) 表明：在20 mg/L下，化合物C1、C2、C3和C4对致倦库蚊4龄幼虫12 h的校正死亡率分别为100%、88.5%、100%和100%，LC50值分别为1.03、9.68、3.08和2.87 mg/L，杀虫活性均优于或接近对照药剂物鱼藤酮 (LC50值3.17 mg/L)；而对于白纹伊蚊，只有化合物C1表现出很强的杀虫活性，20 mg/L下12 h校正死亡率为100%，LC50值为5.37 mg/L，优于鱼藤酮 (21.5 mg/L)。此外，在试验中还观察到，用上述化合物处理3 h就会表现明显的致死效果，表明化合物具有速效性。
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表 1 化合物在20 mg/L下对致倦库蚊和白纹伊蚊4龄幼虫12 h杀虫活性 Table 1 Toxicity of compounds isolated from P. hancei against the 4th instar larvae of Culex pipiens quinquefasciatus and Aedes albopictus after 12 hour at 20 mg/L |
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表 2 高活性化合物对致倦库蚊和白纹伊蚊12 h的LC50值 Table 2 The LC50 value of highly active compounds against the 4th instar larvae of A. albopictus and C. pipiens quinquefasciatus after 12 hour |
3 结论与讨论
本研究从山蒟中分离鉴定出6个已知化合物，分别为chingchengenamide A(C1)、N-异丁基-反-2-反-4-癸二烯酰胺(C2)、假荜拨酰胺A(C3)、荜茇宁(C4)、N-p-香豆酰酪胺(C5)和N-反式-阿魏酰酪胺(C6)，其中化合物C1、C2、C3和C4是山蒟中的主要杀虫活性成分。C1为笔者首次从山蒟中分离得到，且对2种供试蚊4龄幼虫均表现出较好的杀虫活性，可以考虑作为农药的先导化合物。
Parmar等曾报道，从Piper falconeri中分离到的化合物C1对家蝇和埃及伊蚊具有一定杀虫活性[25]。Park报道，从黑胡椒中分离到的化合物C2和C3对淡色库蚊和埃及伊蚊成虫具有杀虫活性[26]。Kubo等的研究表明，荜茇宁对棉红铃虫Pectinophora gossypiella、烟芽夜蛾Heliothis virescens和草地贪夜蛾 Spdoptera frugiperda的生长具有抑制作用，对尖音库蚊Culex pipiens3龄幼虫和南美钉螺Biomphalaria glabratus具有毒杀效果[27]。
异丁基酰胺作为杀虫活性基团已有相关报道[28]。本研究结果表明，所分离得到的4个异丁基酰胺类化合物C1~C4对致倦库蚊和白纹伊蚊具有一定杀虫活性，且分子中均含有2E, 4E-二烯结构单元，而另外2个化合物N-p-香豆酰酪胺和N-反式-阿魏酰酪胺对该虫均无活性，表明异丁基酰胺基团及2E, 4E-二烯结构单元可能是杀虫活性必需基团，具体尚需进一步研究。此外，在化合物C1~C4中，含有芳香环的3个化合物 (C1、C3和C4) 对致倦库蚊的活性明显高于含直链脂肪链 的化合物(C2)，芳香环对这类化合物的活性是否有增强作用，有待进一步验证。
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