农药学学报  2018, Vol. 20 Issue (5): 587-594   PDF    
引用本文
袁建军, 谢嘉华, 张猛, 陈细香, 余向阳. 草甘膦铵盐对3种滩涂动物抗氧化酶、丙二醛及大弹涂鱼红细胞微核的影响[J]. 农药学学报, 2018, 20(5): 587-594,doi: 10.16801/j.issn.1008-7303.2018.0075   
YUAN Jianjun, XIE Jiahua, ZHANG Meng, CHEN Xixiang, YU Xiangyang. Effects of glyphosate ammonium on antioxidant enzyme and malondialdehyde in three kinds of mudflat animals and on the micronuclei in erythrocyte of Boleophthalmus pectinirostris [J]. Chinese Journal of Pesticide Science, 2018, 20(5): 587-594, doi:10.16801/j.issn.1008-7303.2018.0075   
草甘膦铵盐对3种滩涂动物抗氧化酶、丙二醛及大弹涂鱼红细胞微核的影响
袁建军1, 谢嘉华1, 张猛2, 陈细香1, 余向阳1,2     
1. 泉州师范学院 海洋与食品学院/近海资源生物技术福建省高校重点实验室，福建 泉州 362000;
2. 江苏省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所/江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，南京 210014
收稿日期: 2018-02-27    录用日期: 2018-08-01
基金项目: 福建省教育厅A类科技项目 (JA08211)；江苏省重点研发计划项目 (BE2016367)
作者简介: 袁建军，男，硕士，教授，主要从事环境工程微生物与环境病原微生物学研究，E-mail：yuanjianjun2005@qztc.edu.cn.
摘要: 为评价草甘膦对河口及滩涂水域生物的影响，采用室内人工染毒法，研究了草甘膦铵盐对可口革囊星虫Phascolosoma esculenta、缢蛏Sinonovacula constricta Lamark和大弹涂鱼Boleophthalmus pectinirostris 3种滩涂动物超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、丙二醛 (MDA) 及大弹涂鱼红细胞微核的影响。结果表明：经低浓度 (63.5 mg/L) 草甘膦短时间 (2 d) 染毒后，可口革囊星虫肠组织的SOD、CAT活性值及MDA含量分别为231.54、1.719 U/mg pro. 和0.60 nmol/mg pro.，3种指标均显著或极显著高于相应对照值 (204.88、1.521 U/mg pro. 和0.54 nmol/mg pro.)，且随着药剂处理浓度增加，SOD、CAT活性及MDA含量均升高；但当染毒时间延长至8 d时，可口革囊星虫肠组织的SOD、CAT活性值及MDA含量均明显降低，分别为155.67、1.403 U/mg pro. 和0.53 nmol/mg pro.，显著低于对照，且随药剂处理浓度进一步增加，酶活性及MDA含量值降低更显著。草甘膦对缢蛏内脏团及大弹涂鱼肝脏SOD、CAT活性及MDA含量的影响表现出类似规律。此外，经低浓度 (53.5 mg/L) 草甘膦染毒8 d后，大弹涂鱼红细胞微核率及核异常率分别为17.00‰ 和21.33‰，均极显著高于相应对照值 (13.67‰ 和13.33‰)，且随着草甘膦浓度增大，其红细胞微核率及核异常率均显著升高，表明大弹涂鱼对草甘膦有较高的敏感性。所得研究结果可为评价草甘膦对河口及滩涂水域生物的影响提供参考依据。
关键词: 草甘膦     环境毒性     可口革囊星虫     缢蛏     大弹涂鱼     抗氧化酶     丙二醛     红细胞微核    
Effects of glyphosate ammonium on antioxidant enzyme and malondialdehyde in three kinds of mudflat animals and on the micronuclei in erythrocyte of Boleophthalmus pectinirostris
YUAN Jianjun1, XIE Jiahua1, ZHANG Meng2, CHEN Xixiang1, YU Xiangyang1,2     
1. College of Oceanology and Food Science, Quanzhou Normal University/Key Laboratory of Inshore Resources Biotechnology, Quanzhou 362000, Fujian Province, China;
2. Institute of Food Safety and Nutrition, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Food Quality and Safety-State Key Laboratory Cultivation Base, Ministry of Science and Technology, Nanjing 210014, China
Abstract: In order to evaluate the effects of glyphosate on aquatic organisms in estuary and mudflat, the effects of ammonium glyphone on the superoxidase dismutase (SOD), catalase (CAT) and malondialdehyde (MDA) of Sinonovacula constricta Lamark, Phascolosoma esculenta, and Boleophthalmus pectinirostris were measured using artificial poisoning methods. Furthermore, the effects of glyphone ammonium on the micronuclei in the erythrocyte of B. pectinirostris were also tested using the same method. The results showed that, after exposure under glyphosate of low concentration (63.5 mg/L) for a short period (2 days), the enzyme activities of intestine SOD and CAT and the MDA content of P. esculenta were 231.54, 1.719 U/mg pro. and 0.60 nmol/mg pro., respectively. All the above indexs were significantly or extremely significantly higher than those of the corresponding reference values (204.88, 1.521 U/mg pro. and 0.54 nmol/mg pro.). And with the increase of the treatment concentration of glyphosate, the enzyme activities of SOD and CAT and the MDA content increased. However, 8 days after exposure, the enzyme activities of intestine SOD and CAT and the MDA content of P. esculenta became 155.67, 1.403 U/mg pro. and 0.53 nmol/mg pro., which were significantly lower than those of the control. With the increase of the concentration of glyphosate, the enzyme activities and the MDA content reduced significantly. The effects of glyphosate on the activities of SOD and CAT and the MDA content in the visceral mass of S. constricta and the liver of B. pectinirostris were similar. In addition, the rate of micronuclei and nuclear anomalies in erythrocyte of B. pectinirostris were 17.00‰ and 21.33‰ after 8 days with the treatment of glyphosate in low concentration (53.5 mg/L), which were significantly higher than those of the corresponding control (13.67‰ and 13.33‰). With the increase of the concentration of glyphosate, the ratio of micronuclei and nuclear anomalies in erythrocyte were significantly increased, which demonstrated that B. pectinirostris is sensitive to glyphosate. All results above will contribute to the evaluation of the effects of glyphosate on aquatic organisms in the estuary and mudflat.
Key words: glyphosate      environmental toxicity      Phascolosoma esculenta      Sinonovacula constricta      Boleophthalmus pectinirostris      antioxidant enzyme      malondialdehyde      erythrocyte micronucleus     

草甘膦 (glyphosate) 是目前世界上用量最大、应用最广的内吸传导型广谱灭生性除草剂，对防治多年生杂草效果显著。尽管土壤对草甘膦具有很强的吸附能力，但其仍可能会随灌溉水在深层土壤发生移动和淋溶，并对地下水构成潜在风险[1-3]。此外，其在沿海滩涂的大量渗入会在一定程度上破坏滩涂动物的生存环境，威胁滩涂动物的生存[4-5]，同时其通过生物富集也会间接影响人类健康[6]。

可口革囊星虫Phascolosoma esculenta、缢蛏Sinonovacula constrictaLamark和大弹涂鱼Boleophthalmus pectinirostris是生活在河口及内湾滩涂的3种常见药、食两用经济生物，在人工条件下可常年繁殖[7-9]。由于它们对环境变化反应敏感，可以较好地反映其生活环境水质和底质的污染状况, 因此被广泛运用于海洋、湿地、湖泊及河流等环境污染的研究[10-12]。已有研究表明，草甘膦对水生动物有一定的遗传毒性、急性毒性及发育毒性[13-16]，并会对部分水生生物肝脏的抗氧化酶活性产生一定影响[17-18]。目前关于草甘膦对上述3种生物影响的研究仅限于其急性毒性方面[4-5]，有关草甘膦对其抗氧化酶活性及遗传毒性的研究报道较少。本研究拟通过测定上述3种滩涂生物在草甘膦胁迫下其体内超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD) 和过氧化氢酶 (catalase，CAT) 等抗氧化酶活性、脂质过氧化物丙二醛 (malondialdehyde，MDA) 浓度以及大弹涂鱼红细胞微核率的变化，探讨将以上指标用于评价河口及沿海滩涂水域环境中草甘膦污染的可行性，以期为农业生产上合理、安全使用草甘膦，预防和治理其环境污染，保护生态环境及促进滩涂生物健康养殖等提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 供试动物

可口革囊星虫Phascolosoma esculenta采自福建省泉州湾洛阳红树林滩涂，简单冲洗后选取健康无损伤、大小相近的个体，体长 (不包括吻) (4.47 ± 1.02) cm，质量 (2.05 ± 0.95) g，置于直径30 cm、高11 cm的塑料盆中，以质量分数为1.3%的氯化钠水溶液暂养3 d，暂养结束后选取健康个体进行染毒试验。

缢蛏Sinonovacula constrictaLamark采自福建省泉州市东海湾，新鲜捕捞，简单冲洗后选取健康无损伤、大小相近的个体，体长 (4.62 ± 0.37) cm，置于直径30 cm、高11 cm的塑料盆中，以质量分数为2.0%的氯化钠水溶液暂养1 d，暂养结束后选取健康个体供试。

大弹涂鱼Boleophthalmus pectinirostris成鱼购自福建省泉州市新门菜市场，简单冲洗后选取健康无损伤、大小相近的个体，体长 (14.5 ± 0.3) cm，质量 (28.7 ± 2.5) g，置于90 cm × 60 cm × 45 cm的塑料水簇箱中 (底部放置一些略露出水面的石头)，以质量分数为1.5%的氯化钠水溶液暂养3 d，暂养结束后选取健康个体供试。

1.1.2 试剂与主要仪器

33%草甘膦铵盐水剂 (glyphosate ammonium WC) (镇江江南化工有限公司，其中草甘膦有效成分质量分数为30%)，将该高浓度水剂加入到氯化钠水溶液中，按有效成分配制至试验所需浓度。Orion AquaMate 8000 UV-VIS Spectrophotometer分光光度计[国鼎环科 (北京) 技术有限公司]。

1.2 试验方法 1.2.1 供试动物的饲养管理

试验用水为曝气3 d以上的自来水与海水晶配制而成，自然光照，水温 (18 ± 2) ℃。试验期间缢蛏和大弹涂鱼每24 h换水1次，可口革囊星虫96 h换水1次。

1.2.2 染毒试验

试验共进行8 d，每组设4个处理浓度。根据急性毒性试验结果[2]，确定正式染毒试验中可口革囊星虫组草甘膦质量浓度分别为0、63.5、127.0和254.0 mg/L，缢蛏组分别为0、12.0、24.0和48.0 mg/L，大弹涂鱼组分别为0、53.5、107.0和214.0 mg/L。3组试验中每浓度均设A和B两组平行，共用革囊星虫480只，缢蛏640只，大弹涂鱼160条。

1.2.3 酶液制备

分别于暴露开始后第2、4、8天取样。可口革囊星虫组随机分别从每浓度各取6个样本 (每2~3只为1个样本)，在冰盘上快速解剖取肠组织；缢蛏组随机从每浓度各取6个样本 (每4只为1个样本)，在冰盘上快速解剖取内脏团；大弹涂鱼组随机从每浓度分别取6条鱼，在冰盘上快速解剖取肝脏组织；以上各组织样品均置于 –80 ℃冰箱保存，备用。将各组织样品称重，按10倍体积 (g/mL) 加入pH 7.0、6.7 × 10–3 mol/L预冷的磷酸缓冲液，在冰水浴中匀浆，于4 ℃、4 000 r/min下离心20 min，取上清液即得粗酶液，置于 –20 ℃冰箱中保存，待测。

1.2.4 超氧化物歧化酶 (SOD) 活性测定

粗酶液中蛋白质浓度测定采用考马斯亮蓝染色法[19]。SOD活性测定参照国家标准中的邻苯三酚自氧化法[20]，其酶活力单位定义为：以25 ℃下抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需的SOD量为1个酶活力单位，采用U/mg pro. 表示。

1.2.5 过氧化氢酶 (CAT) 活性测定

CAT活性测定采用徐镜波等[21]的紫外分光光度法，其酶活力单位定义为：在25 ℃下、100 s内使H2O2分解50%时所消耗的酶蛋白量，采用U/mg pro. 表示。

1.2.6 丙二醛 (MDA) 含量测定

MDA含量测定采用南京建成生物研究所生产的丙二醛测定试剂盒 (货号：A003-1)，按照其所附说明书方法进行。

1.2.7 红细胞微核及核异常情况观察

大弹涂鱼血涂片采用断尾法[22]取血，按常规方法制作。从每个大弹涂鱼样本中挑选3张染色效果较好的血涂片，每张随机观察500个红细胞，分别记录下每张血涂片中观察到的微核数、微核细胞数、双核数、多核数、无核数以及其他核异常数和总核异常数。其中：微核为圆形或椭圆形，其直径小于主核的1/3，体积为主核的1/4~1/2；其他核异常包括核质外凸、内凹、碎裂以及核位置明显异常等；总核异常数包括微核数及双核数、多核数、无核数和其他核异常数。根据观察结果计算微核率[式 (1)] 和核异常率[ 式(2)]，两者均以千分率表示。

$A/{\text{‰}} = m/n \times 1\;000$ (1)
$B/{\text{‰}}= m'/n \times 1\;000$ (2)

式 (1) 中：A为微核率，‰；m为细胞中微核的总数，个；n为观察细胞总数，个。式 (2) 中：B为核异常率，‰；m' 为具有异常核 (除微核外) 的细胞总数，个；n为观察细胞总数，个。

1.3 数据处理

所得数据采用SPSS 22.0统计软件处理，采用单因素方差分析法，通过Duncan氏新复极差检验法进行组间差异性比较。

2 结果与分析 2.1 草甘膦污染对可口革囊星虫抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响

由表1可知：染毒时间短 (2 d) 时，可口革囊星虫肠组织的SOD、CAT活性和MDA含量均随草甘膦浓度的增加而升高，与对照组相比差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)；之后，除染毒4 d时CAT活性仍随草甘膦浓度增加而升高外，其余时间内SOD、CAT活性和MDA含量均随染毒时间和草甘膦浓度的增加而逐渐降低，直至显著或极显著低于对照组。

表 1 草甘膦污染对可口革囊星虫抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响 Table 1 Effect of glyphosate on the antioxidant enzyme activity and the MDA content of P. esculenta

2.2 草甘膦污染对缢蛏抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响

由表2可知：缢蛏内脏团SOD活性均随染毒时间和草甘膦浓度的增加而升高，显著或极显著高于对照组；染毒时间短 (2 d) 时，CAT活性和MDA含量随草甘膦浓度的增加而升高，与对照组相比差异显著或极显著，之后随着染毒时间延长，CAT活性及MDA含量随草甘膦浓度增加而升高的趋势逐渐减弱，直至略低于对照组。

表 2 草甘膦污染对缢蛏抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响 Table 2 Effect of glyphosate on the antioxidant enzyme activity and the MDA content of S. constricta

2.3 草甘膦污染对大弹涂鱼抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响

由表3可知：大弹涂鱼肝脏组织CAT活性总体上随染毒时间和草甘膦浓度的增加而升高，显著或极显著高于对照组，但在染毒8 d时，高浓度组 (214.0 mg/L) CAT活性迅速降低，与对照组相比差异不显著；染毒时间短 (2 d) 时，大弹涂鱼SOD活性和MDA含量均随草甘膦浓度的增加而升高，与对照组相比差异显著或极显著，之后随着染毒时间延长，酶活性及MDA含量随草甘膦浓度增加而升高的趋势逐渐减弱，直至略低于对照组。

表 3 草甘膦污染对大弹涂鱼抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响 Table 3 Effect of glyphosate on the antioxidant enzyme activity and the MDA content of B. pectinirostris

2.4 草甘膦污染对大弹涂鱼红细胞微核率及核异常率的影响

由表4可知：经草甘膦染毒处理后，大弹涂鱼红细胞微核率随染毒时间和药剂浓度的增加而升高，显著或极显著高于对照组；核异常率则仅在染毒8 d时随草甘膦浓度的增加而升高，与对照组相比差异极显著。

表 4 草甘膦污染对大弹涂鱼红细胞微核率及核异常率的影响 Table 4 Effect of glyphosate on micronuclei and nuclear anomalies in erythrocyte of B. pectinirostris

3 结论与讨论

已有研究表明，草甘膦对可口革囊星虫、缢蛏和大弹涂鱼均存在一定程度的急性毒性[4-5]。本研究在室内条件下就草甘膦对以上3种水生经济动物抗氧化酶活性、MDA含量及红细胞微核的影响进行了深入研究，发现草甘膦能够诱导以上3种生物的SOD、CAT活性及MDA含量升高，并可导致大弹涂鱼红细胞微核数及核异常率增加。此结果进一步明确了草甘膦对上述3种滩涂经济生物的毒害作用，为滩涂水域草甘膦污染的早期预警提供了一定的参考指标。

研究表明，污染胁迫能够造成水生生物的抗氧化酶活性发生改变。Chipman等[23]报道，多环芳烃和多氯联苯等污染物可诱导鲽鱼Limanda limanda的抗氧化酶活性升高。冯涛等[24]研究发现，苯并 (α) 芘可诱导大弹涂鱼肝脏SOD活性发生显著变化。Burgeot等[25]研究发现，污染海区羊鱼Mullus barbatus肝脏内CAT的活性高于非污染海区。本研究表明，当3种滩涂水生动物暴露于污染物中的时间较短、污染物浓度较低时，对其抗氧化酶 (SOD和CAT) 活性的影响表现为诱导上升，之后随着染毒时间延长和污染物浓度增加，滩涂生物的耐受能力降低，对其抗氧化酶活性的影响逐渐转为抑制作用，这与多数研究报道结果基本一致[11, 24-25]。

对水生生物而言，抗氧化酶是一类比较敏感的毒理学指标，因此不少研究者建议将水生生物抗氧化酶活性作为水体环境污染早期预警的生物指标[12, 24]。但由于在自然条件下，生物体抗氧化酶的活性可随季节而发生变化[26]，同时生物种类、性别、生长发育阶段及环境中其他污染物等因素都可以影响其活性，因此，将抗氧化酶活性作为环境污染早期预警的生物指标还需考虑众多因素的综合影响，并在试验条件及操作上严格加以控制, 尽量减少可能产生的误差, 以确保结果的真实可靠[27]。

生物体内MDA的含量变化可反映机体内脂质过氧化程度，进而间接地反映出细胞受损伤的程度。本研究结果表明，草甘膦处理后短时间内，3种滩涂生物的MDA含量均迅速升高，之后随草甘膦浓度增加和处理时间延长，MDA含量升高幅度减小直至表现为显著降低，与王军等[28]的研究结果相似。这可能是由于在亚致死情况下，随着时间延长，生物体内各种解毒机制被激活，对毒物产生了一定的适应，从而造成相关毒理学指标的下降。关于污染物对生物体内脂质过氧化作用的影响, 因生物种类、试验条件等因素的差异, 研究所得结论也有所不同[29-35]，因此在利用MDA的含量变化来监测草甘膦等外界污染状况时，还应与抗氧化酶活力及防御物质等生理指标的检测相结合。

微核测定常被用于对化学致癌剂或致突变物诱变的监测、辐射损伤诊断、辐射保护药物评价以及重金属中毒等方面的研究。南旭阳[36]报道，鲫鱼的核异常率和总核异常率绝大多数情况下随草甘膦染毒时间的延长而逐渐升高，但并不存在明显的剂量关系。与上述报道不同，本研究发现，随着草甘膦浓度增加和染毒时间延长，大弹涂鱼红细胞微核率和核异常率均呈递增趋势，其中微核率的变化幅度大于核异常率，表明大弹涂鱼对草甘膦有较高的敏感性，因此大弹涂鱼红细胞微核率及核异常率的变化可作为检测滩涂水域草甘膦污染状况的参考指标。

综上所述，本研究表明，草甘膦对可口革囊星虫肠组织、缢蛏内脏和大弹涂鱼肝脏超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和脂质过氧化物丙二醛以及大弹涂鱼红细胞微核均有影响，且表现出一定的浓度和时间效应。但要全面、合理评价滩涂水域中草甘膦污染情况，还应结合草甘膦对3种滩涂生物毒理学机理的深入研究，以期更准确地反映草甘膦对河口及沿海滩涂水生生物的影响。

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