二氰蒽醌是德国默克公司于20世纪60年代开发的喹啉类杀菌剂,吡唑醚菌酯是德国巴斯夫公司于20世纪90年代开发的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂,两者均应用于水果、蔬菜及粮食作物真菌性病害的防治,两者复配后能显著增强药效,并延缓抗药性[1-3]。目前在中国获得登记使用的二氰蒽醌和吡唑醚菌酯复配制剂主要用于防治苹果轮纹病和炭疽病[4]。有研究显示,苹果中二氰蒽醌和吡唑醚菌酯对中国居民存在较大的膳食摄入风险。如,孙瑞卿等[5]采用农药残留专家联席会议 (JMPR) 推荐的农药残留急性膳食暴露评估方法,对中国3类人群的农药残留摄入情况进行评估的结果表明:苹果中二氰蒽醌对0~6岁儿童的国家估算急性暴露水平 (NESTI) 是急性参考剂量值 (ARfD) 的170%,存在较高的急性膳食摄入风险。李越超[6]对大连市不同地区的苹果开展农药残留风险评估,发现有11种农药检出浓度超过了中国国家标准中规定的最大残留限量值 (MRL),其中吡唑醚菌酯检出率100%,检出平均浓度是中国规定的MRL值的2倍多,存在膳食摄入风险。随着国家对农产品质量安全的重视,不断修订和完善食品安全国家标准,2016年制定了二氰蒽醌和吡唑醚菌酯在苹果中的最高残留限量值分别为5.0 mg/kg和0.5 mg/kg[7]。
导致苹果中二氰蒽醌和吡唑醚菌酯残留量超标、膳食风险高的原因有很多,但生产者不合理、不规范用药是重要原因之一[8-10]。为此,笔者于2015—2016年在山东、安徽和天津3地分别开展了16%唑醚·氰蒽醌水分散粒剂在苹果中残留和消解试验研究,以期为其在苹果生产上的安全、合理使用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 田间试验试验于2015—2016年分别在山东省烟台市、安徽省宿州市和天津市西青区3地进行。供试苹果品种为“红富士” (山东)、“乔纳金” (安徽) 和“黄香蕉” (天津)。供试药剂为16%唑醚·氰蒽醌 (吡唑醚菌酯质量分数为4%,二氰蒽醌质量分数为12%) 水分散粒剂 (16% pyraclostrobin·dithianon WG),巴斯夫 (中国) 有限公司提供。
1.1.1 消解动态试验按农药残留试验准则[11]要求,于苹果炭疽病发病初期,果实长到成熟个体一半大小时均匀喷雾施药,施药剂量为有效成分0.64 g/kg,每小区2株苹果树,重复3次。分别于施药后2 h及1、3、5、7、14、21、28、35和42 d采样,样品切碎,混匀缩分至150 g,装入自封袋,于 –20 ℃保存。
1.1.2 最终残留试验设推荐剂量有效成分质量浓度0.43 g/L (制剂用量为2.67 g/L) 和推荐剂量的1.5倍0.64 g/L (制剂用量4.0 g/L) 2个施药剂量,于果实长到成熟个体一半大小时对水均匀喷雾,分别施药3和4次,重复3次,每小区2株苹果树,施药间隔期7 d。分别于最后一次施药后7、14和21 d采样,样品制备与保存同1.1.1节。
1.2 分析方法 1.2.1 仪器、药剂与试剂岛津LC-30A超高效液相色谱仪 (配二极管阵列检测器),日本岛津公司;IKA T25高速匀浆机,德国IKA公司;TD5A-WS离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂。
99.9%吡唑醚菌酯 (pyraclostrobin) 标准品和99.6%二氰蒽醌 (dithianon) 标准品:均由巴斯夫 (中国) 有限公司提供;甲醇、乙腈、丙酮和正己烷均为色谱纯:科密欧化学试剂有限公司;盐酸 (分析纯) :天津化学试剂一厂;氯化钠 (分析纯):天津瑞金特化学品有限公司;弗罗里硅士SPE小柱 (500 mg,6 mL):美国Agilent公司。
1.2.2 样品前处理参考本实验室前期研究[12]并加以改进:准确称取20.0 g样品于150 mL三角瓶中,依次加入5 mL水、1 mL盐酸溶液 (6 mol/L) 和40 mL乙腈,高速匀浆1 min,过滤;将滤液转入盛有氯化钠的具塞量筒中,剧烈振荡,静置分层;取2 mL上清液于鸡心瓶中减压旋蒸 (不高于35 ℃) 除去乙腈溶剂,用正己烷溶解并定容至2 mL,待净化。将弗罗里硅士SPE小柱分别用5 mL丙酮和5 mL正己烷活化后,加入待净化液,用10 mL V (丙酮) : V (正己烷)= 1 : 9分2次洗脱;收集洗脱液减压旋蒸 (不高于35 ℃),用乙腈溶解并定容至1 mL,过0.22 µm滤膜,待测。
1.2.3 检测条件Shim-pack XR-ODS色谱柱 (2.0 mm × 75 mm,1.6 μm),柱温20 ℃,流速0.3 mL/min,进样量2 μL,流动相为V (乙腈) : V (甲醇) : V (水)= 45 : 25 : 30,检测波长263 nm。在此条件下二氰蒽醌和吡唑醚菌酯的保留时间分别为2.3 min和3.9 min。
1.2.4 标准曲线绘制准确称取0.005 7 g二氰蒽醌或0.004 8 g吡唑醚菌酯于10 mL容量瓶中,用乙腈溶解定容,分别制得568和480 mg/L的二氰蒽醌和吡唑醚菌酯标准品母液,再用乙腈梯度稀释得到质量浓度为5、1、0.5、0.1和0.05 mg/L的系列标准工作溶液,按1.2.3节的条件测定。以标准溶液的质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。
1.2.5 添加回收试验取制备好的苹果空白对照样品,分别添加0.1、0.5和5 mg/kg 3个水平的二氰蒽醌和吡唑醚菌酯标准工作溶液,每个水平重复5次。按1.2.2节的前处理方法和1.2.3节的条件测定,计算添加回收率和相对标准偏差 (RSD)。
2 结果与分析 2.1 方法的线性范围、准确度及精密度在0.05~5 mg/L范围内,二氰蒽醌和吡唑醚菌酯的峰面积与对应的进样质量浓度之间呈良好线性关系,线性方程二氰蒽醌为y = 2 105x – 51,相关系数 ( r)= 0.999 5;吡唑醚菌酯为y = 2 375x – 20,r = 0.999 6。
在0.1、0.5和5 mg/kg 3个添加水平下,二氰蒽醌回收率在72%~85%之间,RSD在2.5%~9.7%之间;吡唑醚菌酯回收率在87%~98%之间,RSD在2.0%~7.9%之间,符合农药残留检测的要求[11]。二氰蒽醌和吡唑醚菌酯的定量限均为0.1 mg/kg (表1)。典型谱图见图1。
2.2 二氰蒽醌和吡唑醚菌酯在苹果中的消解动态
结果 (表2) 表明:二氰蒽醌在苹果上的消解半衰期为3.0~6.5 d,施药后14 d,消解率在80%以上;吡唑醚菌酯在苹果上的消解半衰期为13.5~23.6 d,施药后45 d,消解率在90%以上。消解动态试验结果表明:二氰蒽醌和吡唑醚菌酯均属于易降解农药 (t1/2 < 30 d) [13],其中二氰蒽醌比吡唑醚菌酯消解速率快,两者消解动态均符合一级反应动力学方程。
整体上,苹果中二氰蒽醌消解半衰期在3地间差异并不特别明显,2年平均半衰期山东为3.7 d,安徽为4.7 d,天津为4.4 d。但在同一试验点不同年度间二氰蒽醌消解动态存在一定差异,如2015年安徽试验点二氰蒽醌半衰期为6.5 d,2016年为3.0 d。查阅试验点天气信息,2015年安徽试验点首次施药后1 、2和3 d天气为阴天和多云,2016年首次施药后3 d内天气均晴朗,气温较高。相关研究表明,二氰蒽醌在田间使用时主要发生水解和光解,其中光解为主要降解途径[14-15]。因此,2016年安徽试验点二氰蒽醌消解速率比2015年度快,可能与天气晴朗、光照充足、光解迅速有关。
而相比二氰蒽醌,吡唑醚菌酯在光解和水解方面性质比较稳定,消解半衰期较长。消解半衰期在山东试验点为19.6 d,安徽为13.8 d,天津为17.1 d。其中安徽试验点半衰期最短,可能与气候有关。安徽省宿州市属于亚热带季风气候区,年平均气温较高,而山东省烟台市和天津市西青区分别属于温带大陆性季风气候和暖温带季风性大陆海洋过渡性气候,年平均气温较安徽低;另外,山东试验点比安徽和天津半衰期长,除了与气候有关外,苹果品种可能也是影响因素之一。山东供试苹果品种为红富士,属晚熟品种,生育期170 d左右,而安徽和天津供试苹果品种分别为乔纳金和黄香蕉,两者均为中熟品种,生育期140 d左右。苹果个体生长对吡唑醚菌酯残留量有稀释作用。不同品种苹果,生育期不同,膨大期生长速度不同,对农药稀释程度也就不同,消解代谢各有差异。
2.3 二氰蒽醌和吡唑醚菌酯在苹果中的最终残留
2015—2016年分别在山东、安徽和天津2年3地的试验结果 (表3) 表明:16%唑醚·氰蒽醌水分散粒剂分别按有效成分质量浓度0.43 g/L和0.64 g/L施药剂量对苹果树施药3~4次,距最后一次施药7、14、21 d时采收,苹果中二氰蒽醌残留量分别为0.35~1.47、< 0.10~1.16和 < 0.10~0.80 mg/kg,吡唑醚菌酯残留量分别为0.22~0.81、0.17~0.56和 < 0.10~0.34 mg/kg。整体上,二氰蒽醌和吡唑醚菌酯在苹果上的最终残留量随施药剂量和施药次数的增加而增加,随采样间隔期的延长而降低。
3 结论与讨论
借鉴实验室已报道的枣中二氰蒽醌和吡唑醚菌酯残留检测前处理方法,采用超高效液相色谱仪对苹果中这2种农药残留进行分析,该方法的准确度和精密度均可满足农药残留分析的要求,可以实现苹果中二氰蒽醌和吡唑醚菌酯的同时快速检测。
消解动态试验表明:二氰蒽醌在田间易发生光解和水解,2015—2016年在山东、安徽和天津2年3地消解半衰期为3.0~6.5 d;吡唑醚菌酯比二氰蒽醌消解缓慢,半衰期长,2年3地半衰期为13.5~23.6 d。整体上,二氰蒽醌的消解主要受天气和光照的影响较大,光解是主要降解途径。而吡唑醚菌酯的消解除了与天气有关外,与供试品种也有一定关系。
最终残留试验表明:16%唑醚·氰蒽醌水分散粒剂以有效成分质量浓度0.43和0.64 g/L,施药3~4次,距最后一次施药7、14、21 d后,苹果中二氰蒽醌最大残留量分别为1.47、1.16和0.80 mg/kg,吡唑醚菌酯最大残留量分别为0.81、0.56和0.34 mg/kg。距最后一次施药21 d后,苹果中二氰蒽醌和吡唑醚菌酯最大残留量均低于中国国家标准中规定的最大残留限量 (MRL) 值[7] (二氰蒽醌5.0 mg/kg,吡唑醚菌酯0.5 mg/kg)。虽然按厂家推荐剂量和1.5倍推荐剂量,在末次施药21 d后,二氰蒽醌和吡唑醚菌酯残留量均未超过MRL值,但结合厂家推荐的使用次数 (3次) 和农药合理使用准则的要求,每种农药在苹果上最多使用3次,建议两者在苹果上使用不超过3次。因此,为确保16%唑醚·氰蒽醌水分散粒剂在苹果上安全合理使用,建议施药剂量为有效成分质量浓度0.43 g/L,最多施药3次,安全间隔期为21 d。
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