2018, Vol. 20
2. 安徽科立特农药环境评价科技有限公司，合肥 230031
2. Anhui Create Pesticide and Environment Evaluation Technology Co., Hefei 230031, China
新奥霉素 (xinaomycin)，又称新奥苷肽，是中国科学院成都生物研究所用遗传改良菌株“诺尔斯链霉菌 XiAo-3” (Streptomyces noursei XiAo-3) 发酵生产的新型尿嘧啶核苷肽类抗生素，其分子式为C16H23N5O10[1]，结构式见图式 1。其母药呈淡褐色略粘稠状液体，有效成分质量分数为12.36%，溶于水，微溶于甲醇。
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图式1 新奥霉素的化学结构式 Scheme1 Structural formula of xinaomycin |
新奥霉素是一种新型光谱生物杀菌剂：可诱导植物对病原菌产生免疫抗性，对植物病害具有较好的防治效果[2]；对疫霉和小麦纹枯病菌等具有较强抑制作用[3-4]。但有关其对环境中非靶标生物的毒性研究较少，目前仅见有关其对日本鹌鹑安全性评价的研究报道[5]。
鱼类、蜜蜂等是农田生态系统中常见的非靶标生物，化学农药的使用可能会对此类生物造成死亡等危害[6]。本研究参照《化学农药环境安全评价试验准则》，开展了新奥霉素母药对斑马鱼、大型溞、羊角月芽藻、蜜蜂和家蚕等5种非靶标生物的急性毒性试验，并对其进行了初步的环境安全性评价，以期为这种新型生物农药在农业生产中的合理使用以及发展推广提供相应的参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 供试药剂12.36%新奥霉素母药，由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提供；新奥霉素标准品，纯度21.5%，由河南省济源白云实业有限公司提供。99.8%重铬酸钾 (优级纯)，由国药集团化学试剂有限公司提供。98%乐果 (dimethoate) 原药，由郑州南化化工有限公司提供。吐温-80，由天津市福晨化学试剂厂提供。
1.1.2 供试生物蓝色斑马鱼Brachydanio rerio，购自合肥市飞扬水族馆，平均体重0.3 g，平均体长2.0 cm，健康无病，在与试验相同条件下预养10 d，预养期间自然死亡率0.6%，试验前24 h停止喂食。
大型溞Daphnia magna Straus，选用实验室条件下孤雌繁殖3代以上、出生时间6~24 h的幼溞供试。
羊角月芽藻Pseudokirchneriella subcapitata，购自中国科学院淡水藻种库，无菌条件下转接于BG11培养液中，在温度 (22 ± 2) ℃、光照/黑暗时间比为16 h/8 h，光照度4 000 lx下培养，连续转接3次以上，使藻基本达到对数生长期。
蜜蜂为意大利工蜂Apis melliifera L.，购于安徽先行养蜂厂，于室外条件下人工饲养。蜜蜂收集于试验当天清晨，试验时选择大小一致、活泼健康的成年工蜂作为试验用蜂。用于急性经口毒性试验的蜜蜂，在试验前饥饿2 h。
家蚕Bombyx mori，蚕卵购自山东省广通蚕种集团有限公司，蚕卵品种为箐松 × 皓月，购买时没有经过催青处理，供试蚕为2龄起蚕。供试蚕活性良好，身体健康，体态大小一致，起蚕时间一致。
1.1.3 主要仪器设备智能人工气候箱，宁波东南仪器有限公司；SK200Digital光学显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司；MS3涡旋振荡器，德国IKA公司；岛津LC-20AT高效液相色谱仪，配二级管阵列检测器，日本岛津公司。
1.2 试验方法 1.2.1 鱼类急性毒性试验参照文献[7]采用半静态法。将新奥霉素母药用曝气水溶解，配制成有效成分质量浓度为100 mg/L的试验药液。每缸5 L试验药液，投入10条斑马鱼，设置3个重复，以不加药的曝气水为空白对照。每隔24 h更换一次药液。
1.2.2 溞类急性活动抑制试验参照文献[8]并稍加调整，采用半静态法。将新奥霉素母药用ISO标准稀释水溶解，配制成有效成分质量浓度分别为0.800、1.184、1.752、2.593、3.838、5.681和8.407 mg/L的药液。以不加药的ISO标准稀释水为空白对照。每24 h更换1次药液。
1.2.3 藻类生长抑制试验参照文献[9]，采用分光光度计法。分别于试验开始后第24、48、72 小时取样，用分光光度计测定各处理藻液在650 nm处的吸光度值。
1.2.4 水生物试验药液真实浓度测定斑马鱼急性毒性试验及大型溞急性活动抑制试验中每次更换供试药液前后分别留取药液样品；藻类生长抑制试验于试验开始后0、72 h时分别留取试验药液样品。取样后将样品避光、密封，保存于–20 ℃冰箱，待试验结束时检测药液浓度。
取混合均匀的水样加色谱纯甲醇溶液混匀后过0.22 μm有机相滤膜，液相色谱检测。检测条件：Shim-pack C18色谱柱 (4.6 mm × 150 mm，5 μm)；流动相为V (0.05%乙酸水) V (0.05%乙酸-甲醇溶液) = 50 : 50；检测波长260 nm；柱温40 ℃；流速0.8 mL/min；进样量20 μL。
准确称取0.0465 g新奥霉素标准品，用超纯水定容至10 mL，得到有效成分质量浓度为1 000 mg/L的标准品溶液，再用超纯水稀释制得0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和75.0 mg/L系列标准溶液，在上述仪器条件下进行检测，以药液质量浓度为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标，制作标准曲线。
1.2.5 蜜蜂急性毒性试验蜜蜂急性经口毒性试验和蜜蜂急性接触毒性试验均参照文献[10]进行。
1.2.6 家蚕急性毒性试验采用浸叶法[11]。将新奥霉素母药用去离子水溶解，配制成有效成分质量浓度为2.00 × 103 mg/L的药液，空白对照组和处理组各设置6个重复。
1.2.7 数据处理用统计软件SPSS 20.0处理数据，得到新奥霉素母药对大型溞的EC50值、对羊角月芽藻的ErC50和EyC50值、对意大利工蜂的LD50值及其95%置信限，并根据试验准则得出新奥霉素母药对鱼、溞、藻、蜜蜂和家蚕的毒性等级。
2 结果与分析 2.1 检测方法的可靠性分析以新奥霉素标准溶液检测出相应的峰面积，得到线性回归方程为y = 2 585.948 x + 25.593，R2 = 1。在0.2~150.0 mg/L添加水平下，新奥霉素的平均回收率为90%~102%，相对标准偏差 (RSD) 为0.25%~6.5%，最低检测浓度为0.2 mg/L，最小检出量为2 × 10–9 g。新奥霉素标准品、母药和试验样品的典型色谱图见图1和 图2。
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图 1 新奥霉素标准品 (5 mg/L )(A) 和新奥霉素母药 ( 10 mg/L)(B) 的典型色谱图 Fig. 1 Chromatograms of xinaomycin standard sample (5 mg/L) (A) and xinaomycin TK (10 mg/L) (B) |
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图 2 鱼急性毒性试验 (A)、溞急性活动抑制试验 (B) 和藻生长抑制试验(C)中新奥霉素样品的典型色谱图 Fig. 2 Chromatograms of xinaomycin in fish acute toxicity test (A), alga growth inhibition test (B) and Daphnia sp. acute immobilisation test (C) |
2.2 供试生物参比试验结果
结果表明：重铬酸钾对斑马鱼24 h-LC50值为245 mg/L；对大型溞24 h-EC50值为1.02 mg/L；对羊角月芽藻生长抑制72 h-EyC50值为8.30 × 10-2 mg/L，72 h-ErC50值为0.241 mg/L。乐果对意大利工蜂急性经口24 h-LD50值为0.127 μg/蜂，急性接触24 h-LD50值为0.159 μg/蜂；对家蚕急性毒性96 h-LC50值为2.07 × 103 mg/L。所用生物试材的体质均符合试验准则的要求[7-11]。
2.3 新奥霉素母药对蓝色斑马鱼的急性毒性结果表明：96 h后，药剂处理组少数斑马鱼出现体色变深的中毒症状，死亡数为0。本研究中供试物药液96 h实测的质量浓度为99.5 mg/L。根据准则[7]农药对鱼96 h-LC50大于10 mg/L 为低毒，故可判断供试物对斑马鱼毒性为低毒。
2.4 新奥霉素母药对大型溞急性活动的抑制作用本研究结果表明，试验期间对照组大型溞没有出现受抑制及中毒现象。而处理组在给药24 h后，各浓度组大型溞的受抑制数呈梯度增长趋势，并且伴有体色发白、被固于水面、游动打转等症状；48 h后少数大型溞出现游动迟缓、被固于水面等主要症状。在更换供试药液前后分别留取水样测定含量，以每次换水周期实测浓度的几何平均数作为实测浓度，计算EC50值。药液的实测质量浓度分别为0.609、0.892、1.30、1.67、2.25、2.98和5.84 mg/L，计算得到新奥霉素母药对大型溞的48 h-EC50值为1.48 mg/L (表1)。
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表 1 新奥霉素母药对大型溞急性活动抑制作用 Table 1 The acute immobilisation test results of xinaomycin TK to D. magna |
根据农药对溞类的毒性划分标准[8]，新奥霉素母药对大型溞的毒性等级为“中等毒性”。
2.5 新奥霉素对羊角月芽藻的生长抑制作用于染毒后72 h用光学显微镜观察藻细胞的生长情况，最低浓度组藻细胞颜色呈绿色，大部分呈饱满月牙状，少数呈细丝月牙状；最高浓度藻细胞颜色微绿，细胞小，有的出现分解粘连等症状。不同时间取样测定药液的质量浓度，发现0 h时其分别为3.07、5.37、10.3、19.5、36.0、65.6、119 mg/L；72 h时样品中未检到新奥霉素。因此以0 h的实测浓度来计算EyC50及ErC50值。结果表明，新奥霉素母药对羊角月芽藻的72 h-EyC50值为8.74 mg/L；72 h-ErC50值为29.2 mg/L (表2和表3)。
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表 2 新奥霉素母药对羊角月芽藻生物量增长的抑制作用 Table 2 The inhibition test of xinaomycin TK to biomass growth of P. subcapitata |
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表 3 新奥霉素母药对羊角月芽藻生长率的抑制作用 Table 3 The inhibition test of xinaomycin TK to growth rate of P. subcapitata |
根据农药对藻类的毒性划分标准[9]，新奥霉素母药对羊角月芽藻的毒性等级为“低毒”。
2.6 新奥霉素母药对意大利工蜂的急性毒性 2.6.1 蜜蜂急性经口毒性试验4 h后，各浓度组药液均被食用完全。根据各处理组药液质量浓度计算出蜜蜂实际取食药量为：21.0、26.3、32.8、41.0、51.3、64.1和80.1 μg/蜂。试验期间空白对照组蜜蜂没有中毒和死亡现象。供试蜜蜂经口给药24 h后，各浓度组蜜蜂没有死亡；48 h后，蜜蜂有少量死亡，且死亡数不呈梯度，但是存活蜜蜂大多有抽搐、站立不稳等中毒现象；96 h后，低浓度组存活蜜蜂没有明显中毒症状，高浓度组蜜蜂则全部死亡。根据蜜蜂实际取食药量和96 h的死亡率计算得到96 h-LD50值为31.3 μg/蜂 (表4)。
2.6.2 蜜蜂急性接触毒性试验期间空白对照组和溶剂对照组均没有中毒和死亡现象。供试蜜蜂点滴接触给药24 h后，各浓度组蜜蜂几乎没有死亡；48 h后，各浓度组蜜蜂有不同程度死亡，存活蜜蜂大多出现移动缓慢、静止趴着不动、站立不稳等中毒现象，死亡数量成阶梯分布；96 h后，低浓度组蜜蜂死亡数量没有变化，高浓度组蜜蜂则全部死亡。根据96 h后的死亡结果计算得到96 h-LD50值为39.9 μg/蜂 (表4)。
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表 4 新奥霉素母药对意大利工蜂的急性毒性试验结果 Table 4 The acute toxicity test results of xinaomycin TK to A. melliifera |
根据农药对蜜蜂的毒性划分标准[10]，新奥霉素母药对意大利工蜂的急性经口毒性和急性接触毒性等级均为“低毒”。
2.7 新奥霉素母药对家蚕的急性毒性试验期间空白对照组家蚕死亡7头，死亡率为5.83%，没有中毒现象；处理组家蚕死亡6头，死亡率为5.00%。处理组家蚕经浸渍桑叶给药24 h后，和对照组相比没有明显变化；48 h后处理组家蚕略微有昂头现象，少量家蚕出现吐液和假死现象；96 h后，处理组家蚕有拒食现象，且部分家蚕还出现晃头、扭曲挣扎、假死现象。新奥霉素母药对家蚕96 h-LC50 > 2.00 × 10 3 mg/L 。根据试验准则[11]中农药对家蚕的毒性划分标准，96 h-LC50大于200 mg/L 为低毒，故12.36%新奥霉素母药对家蚕急性毒性等级为“低毒”。
3 结论本研究测定了新奥霉素母药对5种非靶标生物的急性毒性。结果显示，新奥霉素对斑马鱼、羊角月芽藻、蜜蜂和家蚕均为低毒，对大型溞为中毒。新奥霉素作为一种新型生物杀菌剂，在预防和防治效果上以及病害抗药性问题上都有很大的优势，且对非靶标生物较安全，具有很好的应用前景。
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