2018, Vol. 20
内吸性杀菌剂在农业病害防治中发挥着重要作用，但大多数内吸性杀菌剂只能通过木质部在植物的质外体运转，无法通过叶面喷施来防治根部和维管束病害[1]，在使用中存在一定局限性。甲霜灵作为一种苯基酰胺类高效、低毒、低残留的内吸性杀菌剂[2]，可以在植物韧皮部中自上而下向基传导[3]，并能运输到各个器官。有关甲霜灵等杀菌剂传导性的研究主要采用标记法[3-5]或者取整株植株进行含量分析[6]。Bromilow等[7]建立了利用蓖麻植株体系来验证外源化合物能否在植物韧皮部中运输的方法，但因该体系受培养液中供试化合物浓度、培养温度与培养液的酸碱性[8]等因素的影响，其渗出液中被检出的化合物浓度表现出较大差异，甚至当培养液的酸碱性差异较大时有可能导致待测物质不能被检出[9]。因此，对不同培养条件下甲霜灵在蓖麻韧皮部中输导性的深入研究，对甲霜灵的科学使用及改善杀菌剂传导性具有重要意义。为此，本研究探讨了不同培养条件下甲霜灵在蓖麻幼苗韧皮部中的输导性，以确保在一定条件下化合物可以最大限度地在蓖麻韧皮部积累并被检测，同时为检测其他未知化合物在植株中的输导性提供一定参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 仪器与试剂Agilent 7890A/5975C型GC-MSD，美国Agilent公司。
甲霜灵 (metalaxyl) 标准品 (浙江禾本科技有限公司，纯度96.8%)；丙酮等均为市售分析纯 (国药集团化学试剂有限公司)。
1.1.2 植物试材蓖麻Ricinus communis Linn. 种子由山东省淄博市农业科学研究院提供，在28 ℃下催芽48 h后，取发芽的种子播于砂基土中，置于人工气候箱中培养。培养温度28 ℃ ± 1 ℃，相对湿度80%，保持每天14 h光照、10 h黑暗条件。培养6 d后，选取长势基本一致、有胚乳包被子叶的蓖麻幼苗供试。
1.2 试验方法 1.2.1 样品的采集与处理取供试蓖麻幼苗，剥去胚乳且不伤及子叶，用去离子水洗净根和子叶后，将子叶浸入含不同质量浓度(100、200、400、500和600 mg/L)甲霜灵的培养液 (含1%丙酮，4 mmol/L吐温-80，pH = 5.5) 中，根部浸入含0.5 mmol/L氯化钙的去离子水中，培养2 h。以不含甲霜灵的相同培养液为空白对照。以8株蓖麻幼苗为1组，每处理3次重复。参照文献[10-11]，从蓖麻幼苗子叶至下胚轴弯钩处切断，收集0~6 h内蓖麻韧皮部的渗出液，用乙腈稀释，加无水硫酸钠干燥，超声振荡2 min后，取上清液过0.22 μm有机相微孔滤膜，待测。
数据通过SPSS19.0统计软件，采用单因素方差分析进行差异显著性分析。
1.2.2 蓖麻幼苗韧皮部渗出液中甲霜灵含量的测定采用GC-MS法检测。
色谱条件：HP-5MS色谱柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)，载气为氦气，流速1 mL/min，进样口温度250 ℃，进样量1 μL，不分流进样。程序升温：初始温度100 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持10 min，运行时间22 min。
质谱条件：电子轰击电离 (EI) 源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子轰击能量70 eV，采集方式为全扫描 (SCAN)，质量扫描范围m/z：50~550。
1.2.3 标准溶液配制及标准曲线绘制准确称取一定质量的甲霜灵标准品，用乙腈溶解并逐级稀释，配成20、10、5.0、2.0和1.0 mg/L的系列标准溶液，按1.2.2节的条件测定。以标准溶液中甲霜灵的质量浓度为横坐标，蓖麻韧皮部渗出液中甲霜灵的峰面积为纵坐标，得回归曲线方程，并根据此方程计算韧皮部渗出液中甲霜灵的含量。
1.2.4 不同培养条件对甲霜灵在蓖麻韧皮部输导性的影响 1.2.4.1 光照的影响取2组蓖麻幼苗，将子叶浸入含药培养液 (含甲霜灵200 mg/L、4 mmol/L的吐温-80以及pH = 5.5的磷酸盐缓冲液) 中，其中一组用保鲜膜覆盖，另一组用不透光的盖子覆盖，置于培养箱中培养。培养条件：正常光照，室温28 ℃。按1.2.1节取样及处理，按1.2.2节条件测定0~6 h内收集的蓖麻韧皮部渗出液中甲霜灵的含量。
1.2.4.2 培养液中甲霜灵浓度的影响取5组蓖麻幼苗，将子叶分别浸入含不同质量浓度 (100、200、400、500和600 mg/L) 甲霜灵的培养液中，培养液其余成分及培养条件同1.2.4.1节。按1.2.1节取样及处理，按1.2.2节的条件测定0~6 h内收集的蓖麻韧皮部渗出液中甲霜灵的含量。
1.2.4.3 培养液pH值的影响取5组蓖麻幼苗，将子叶分别浸入不同pH值 (5.5、6.5、7.0、7.5和8.0) 的培养液中，培养液中甲霜灵质量浓度为400 mg/L，培养液其余成分及培养条件同1.2.4.1节。按1.2.1节取样及处理，按1.2.2节的条件测定0~6 h内收集的蓖麻韧皮部渗出液中甲霜灵的含量。
1.2.4.4 培养温度的影响取4组蓖麻幼苗，将子叶分别浸入含400 mg/L甲霜灵、pH值为5.5的培养液中，置于不同温度 (10、20、28及35 ℃) 下正常光照培养。按1.2.1节取样及处理，按1.2.2节的条件测定0~6 h内收集的蓖麻韧皮部渗出液中甲霜灵的含量。
1.2.4.5 培养时间的影响取1组蓖麻幼苗，将子叶浸入含药培养液 (含甲霜灵400 mg/L、4 mmol/L的吐温80以及pH = 5.5的磷酸盐缓冲液) 中，培养条件同1.2.4.1节，按1.2.1节处理，分别于1、2、3、4、5和6 h取样，按1.2.2节的条件测定蓖麻韧皮部渗出液中甲霜灵的含量。
2 结果与分析 2.1 甲霜灵含量分析的标准曲线结果表明：在1.0~20 mg/L范围内，甲霜灵质量浓度和其对应的峰面积间具有良好的线性相关，其线性方程为y = 331 517x - 308 642，r = 0.999 8。表明此方法可有效分离甲霜灵和蓖麻韧皮部汁液中其余物质。相关谱图见图 1和图 2。
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A. 气相色谱图；B. 质谱图。 A. The gas chromatogram; B. The mass spectrum. 图 1 甲霜灵标准样品的气相色谱-质谱图 Fig. 1 The GC-MS chromatogram of standard sample of metalaxyl |
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A. 空白对照 (子叶培养于标准培养液中)；B. 处理组 (子叶培养于含药培养液中)。 A. Control, the cotyledons were incubated in the standard medium; B. Treated set, the cotyledons were incubated in the same solution with metalaxyl. 图 2 蓖麻韧皮部渗出液的气相色谱图 Fig. 2 The gas chromatogram of phloem sap of R. communis |
2.2 光照对甲霜灵在蓖麻韧皮部输导性的影响
光照条件下，甲霜灵在蓖麻韧皮部渗出液中的含量为 (8.83 ± 0.33) μg/g，在黑暗条件下为 (8.42 ± 0.56) μg/g，两者无显著性差异，说明光照条件对甲霜灵在韧皮部的输导能力无显著影响。
2.3 培养液中甲霜灵浓度对其在蓖麻韧皮部输导性的影响结果 (图 3A) 显示：甲霜灵在蓖麻韧皮部中的输导性与培养液中甲霜灵的质量浓度有关。在供试的100~600 mg/L范围内，随甲霜灵质量浓度的增加，其在韧皮部渗出液中的含量呈先升后降趋势，并于400 mg/L处理下达最大值(14.19 ± 0.84) μg/g。
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图柱上不同字母表示在5%水平上差异显著(LSD法)，n = 3。 Those followed by different letters in the same column are significantly different at the 5% level (LSD method, n = 3). 图 3 不同培养条件下甲霜灵在蓖麻韧皮部渗出液中的含量 Fig. 3 Content of metalaxyl in phloem sap of R. communis under different culture conditions |
2.4 培养液pH值对甲霜灵在蓖麻韧皮部输导性的影响
结果 (图 3B) 显示：pH值在5.5~8.0范围内，甲霜灵在蓖麻韧皮部渗出液中的含量呈先降后升的趋势，其中，在中性及弱碱性 (7.0~8.0) 条件下差异不显著，表明弱酸条件更有利于甲霜灵在蓖麻韧皮部的输导。
2.5 培养温度对甲霜灵在蓖麻韧皮部输导性的影响结果 (图 3C) 表明：在供试的温度范围内，甲霜灵在蓖麻韧皮部渗出液中的含量呈先升后降的变化趋势，并于28 ℃处理下达最大值，为 (14.19 ± 0.84) μg/g。在较低 (10 ℃) 或较高 (35 ℃) 温度下，甲霜灵在蓖麻韧皮部的输导能力均较弱。
2.6 培养时间对甲霜灵在韧皮部渗出液中含量的影响结果 (图 3D) 表明：蓖麻韧皮部渗出液中甲霜灵的含量随培养时间延长总体呈递增趋势，其中第3小时内的含量显著高于前2 h，在4、5和6 h内差异不显著。
3 结论与讨论笔者以甲霜灵为模式植物，采用GC-MS分析方法，初步研究了不同培养条件下甲霜灵在蓖麻幼苗韧皮部输导性的差异。结果表明，光照对甲霜灵在蓖麻韧皮部中的输导性无明显影响，而培养液的含药质量浓度、pH值、培养温度及时间均对甲霜灵在蓖麻韧皮部的输导性有明显影响。当培养液中甲霜灵质量浓度为400 mg/L、pH值为5.5和培养温度为28 ℃时，甲霜灵在蓖麻韧皮部中的输导能力最强，渗出液中甲霜灵的含量从第3小时起显著升高。因此，在甲霜灵的实际使用中，应注意施药浓度既不能过高也不能过低，可考虑将其配制成偏酸性溶液后施用。
1) 理论上，光照应该影响依赖于光合产物进行主动运输的化合物在韧皮部的输导，然而本研究中光照对甲霜灵的输导性影响不显著，由此推测，甲霜灵在蓖麻韧皮部的输导并不属于主动运输，更有可能是被动扩散；2) 在甲霜灵的质量浓度未超过蓖麻所能承受的极限时，其在蓖麻韧皮部中的输导性随着药剂质量浓度的增加而增强，高浓度的甲霜灵则可能伤害植物组织，反而使输导性变差；3) pH值在5.5~8.0范围内，当培养液pH值为5.5时，甲霜灵具有最好的韧皮部输导性。Buchenauer等[12]采用苯菌灵等杀菌剂及其对应的酸性制剂处理感染了黄萎病的棉花植株，发现使用酸性试剂抑菌效果更好；然而强酸性会导致植物组织受损伤[13]。本研究中，适当的酸性条件有利于甲霜灵穿透蓖麻幼苗子叶的表皮，并在其韧皮部积累；4) 本研究中，28 ℃较适宜甲霜灵的输导，温度过高或过低均不利于其在植物韧皮部中的输导；5) 在稀释倍数相同的条件下，渗出液中含药浓度越高越易被检测出，因此在后续试验中，为提高效率，可收集3 h之后的渗出液。
与以往研究[14-15]不同，本研究的目的是优化模式植物蓖麻获得药剂最大吸收时的适宜培养条件，并分析其可能的原因，旨在为检测其他未知化合物在植株韧皮部中的输导性提供一定的参考，然而本文中的条件只是针对蓖麻幼苗体系筛选出来的，对成熟植株是否适用仍需探索。
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