白背飞虱Sogatella furcifera (Horváth)，属半翅目飞虱科，广泛分布于南亚、东南亚、太平洋岛屿及日本、朝鲜和澳大利亚，几乎遍及中国所有稻区，是影响水稻稳产、高产的主要害虫之一^[1-2]。针对其爆发性和迁飞性等特点，目前仍以化学防治为主，但杀虫剂的大量和不合理使用，导致白背飞虱对多种杀虫剂的敏感性逐年降低^[3]。

杀虫剂的田间防治效果受多种因素影响，其中温度对杀虫剂的毒力影响较大。温度不仅对杀虫剂本身有较大影响，还可调控靶标昆虫生命周期、繁殖和衰老等生理活动^[4]。研究表明，温度与杀虫剂的关系可以通过温度系数衡量^[5-6]，如：有机磷类、氨基甲酸酯类和新烟碱类杀虫剂大多数表现为正温度效应，即随温度升高毒力增强，当温度从19 ℃上升至32 ℃时，烯啶虫胺对烟粉虱的毒力增加12.67倍^[7]；相反，拟除虫菊酯类杀虫剂多表现为负温度效应。目前，关于温度对杀虫剂药效的影响与昆虫体内解毒酶相关的研究已有报道^[8]，昆虫体内主要的解毒酶有谷胱甘肽S-转移酶 (GSTs)、酯酶 (EST) 以及细胞色素P450单加氧酶 (P450)。马云华等^[8]发现，麦长管蚜在高温下GSTs活性增强，而羧酸酯酶活性降低，表明GSTs活性可能与负温度系数相关，而羧酸酯酶活性与正温度系数有关。

环氧虫啶是由华东理工大学研发的新烟碱类杀虫剂，属于乙酰胆碱受体拮抗剂，可有效防治稻飞虱等刺吸式口器害虫，对田间吡虫啉抗性害虫具有很好的防治效果^[9]。但目前未见其对白背飞虱的温度效应相关报道。本研究通过分析不同温度条件下白背飞虱对环氧虫啶的敏感性差异及其取食量和解毒酶活性变化，以期为环氧虫啶科学使用提供参考。

1 材料与方法 1.1 试虫

白背飞虱Sogatella furcifera(Horváth) 种群，2015年采自湖北省孝感市田间，不接触药剂的情况下用室内种植稻苗 (TN1) 连续饲养多代。饲养条件：温度 (28 ± 1) ℃，相对湿度60%~80%，光暗周期16 h/8 h。

1.2 药剂、试剂及主要仪器

97.59%环氧虫啶 (cycloxaprid) 原药，由华东理工大学李忠教授提供；乙酸-α-萘酯 (α-NA)、2,4-二硝基氯苯 (CDNB)、还原型谷胱甘肽 (GSH)、苯基硫脲 (PTU)、苯甲基磺酰氟 (PMSF)、二硫苏糖醇 (DTT)、还原辅酶Ⅱ四钠盐 (β-NADPH)和固蓝B盐均购自Aladdin公司；十二烷基硫酸钠 (SDS) 和Triton X-100 购自美国Sigma公司；牛血清白蛋白 (BSA)、Quick Start^TM Bradford 1 × Dye Reagent和Tris-HCl购自Takara公司；三氯乙酸 (TCA) 和7-乙氧香豆素购自东京化成工业株式会所。所有试剂均为分析纯。

UV-1800型紫外分光光度计 (日本岛津公司)；iMark^TM酶标仪 (美国BIO-RAD公司)；NP80超微量分光光度计 (德国IMPLEN公司)；5804R型台式冷冻离心机 (德国Eppendorf公司)。

1.3 环氧虫啶对白背飞虱的毒力测定

采用稻苗浸渍法^[10]。根据不同温度下预试验的结果，按等比设定5~7个浓度梯度的环氧虫啶药液(不同温度下死亡率检测选用16 mg/L诊断浓度)，取稻苗15株于药液中浸泡30 s后取出，自然晾干后用脱脂棉吸水包裹根部于试验杯中，每杯接入15头生长一致的白背飞虱3龄中期若虫。每处理重复3次，以0.1%的Triton X-100水溶液为对照。各处理若虫分别置于18、23、28和32 ℃恒温培养箱中。4 d后检查死亡情况，用0号毛笔轻触虫体，完全不动者视为死亡。

1.4 酶活性测定 1.4.1 试虫预处理

将接有3龄白背飞虱若虫的稻苗分别置于18、23、28和32 ℃下饲养24 h。每处理试虫1 500头，挑取健康试虫于离心管中，液氮速冻，于 –80 ℃保存备用，供不同温度处理白背飞虱种群3种解毒酶活力测定。

1.4.2 酶源蛋白含量测定

标准曲线绘制：分别量取100 mg/L的牛血清蛋白0、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 μL，加入到2 mL离心管中，再加入Quick Start^TM Bradford 1 × Dye Reagen，定容至1 000 μL，混匀，静置5 min，在595 nm处测定吸光度值。每处理重复3次。以吸光度值为横坐标，蛋白质量为纵坐标，绘制标准曲线。

样品测定体系：量取待测样品100 μL，加入Quick Start^TM Bradford 1 × Dye Reagent 900 μL，混匀，静置5 min，在595 nm处测定吸光度值。

酶源蛋白含量通过蛋白标准曲线，将测定的吸光度值换算成蛋白含量表示。

1.4.3 谷胱甘肽S-转移酶活性测定

酶源制备：取白背飞虱3龄若虫150头，加入1 mL冷冻的0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸盐缓冲液，于冰上用匀浆器充分匀浆后，于14 000 × g、4 ℃下离心20 min，取上清液作为粗酶液。

参照Han等^[11]的方法加以改进测定谷胱甘肽S-转移酶活性：量取740 μL缓冲液、30 μL底物 (CDNB)、100 μL酶液和30 μL还原型谷胱甘肽 (GSH)，按顺序加入到1.5 mL离心管中，混匀，在340 nm处测定2 min内吸光度的变化值。按公式 (1) 计算酶活力。

${{R_{\rm GSTs}}}= \left[({\Delta {\rm{OD}} \times {V}} \right) / \left( {\varepsilon \times {{L}}})\right] /m_{\rm{pro}} $

(1)

式中，R_GSTs为GSTs比活力(μmol/(mg·min))，ΔOD为每分钟光吸收的变化值 (OD₃₄₀/min)，V为酶促反应体积 (0.9 mL)，ε为产物的消光系数[0.009 6 L/(μmol·cm)]，L为比色杯的光程 (1 cm)，m_Pro 为蛋白含量 (mg)。

1.4.4 酯酶活性测定

酶源制备：取白背飞虱3龄若虫60头，加入1 mL冷冻的0.04 mol/L 、pH 7.0磷酸盐缓冲液，于冰上用匀浆器充分匀浆后，于14 000 × g、4 ℃下离心20 min，取上清液作为粗酶液。

参照Asperen等^[12]的方法加以改进测定酯酶活性：量取1 mL 3 × 10^–4 mol/L乙酸-α-萘酯底物溶液，加入2 mL离心管中，于37 ℃水浴3 min，加入粗酶液0.2 mL，摇匀后于37 ℃水浴中反应15 min，加入0.2 mL显色剂终止反应并显色，稳定30 min后在600 nm处测定吸光度值。以热灭活酶源为对照。根据标准曲线计算每毫升酶液生成的α-萘酚量和酶液中的蛋白含量，按公式 (2) 计算酯酶的比活力。

${R_{\rm EST}}=n_{\alpha{{\text{-}}\text{萘酚}}}/ ({m_{\rm pro}} \times t) $

(2)

式中，R_EST为酯酶比活力(μmol /(mg·min ))；n_α-萘酚为α-萘酚量(μmol)；m_pro为酶液中的蛋白含量(mg)；t为反应时间(min)。

1.4.5 细胞色素P450单加氧酶活性测定

酶源制备：取白背飞虱3龄若虫600头，加入600 μL的 0.1 mol/L 、pH 7.5的磷酸缓冲液 (含10%甘油、1 mmol/L DTT、1 mmol/L PMSF和1 mmol/L EDTA)，于冰上用匀浆器充分匀浆后，于14 000 × g、4 ℃下离心10 min，取上清液在相同条件下再次离心5 min，上清作为粗酶液。

参照Li等^[13]的方法加以改进以7-乙氧香豆素-O-脱乙基酶 (7-ECOD) 为底物测定P450酶活性：反应体系中依次加入365 μL的0.1 mol/L、pH 7.8 Tris-HCl缓冲液，5 μL的 40 mmol/L 7-乙氧香豆素，10 μL的 10 mmol/L NADPH，125 μL的粗酶液。于30 ℃下在摇床内振荡反应30 min后，立即将反应管放入冰中，加入150 μL的 15% TCA终止反应。将终止反应后的混合物于10 000× g下离心2 min，取100 μL上清液，加入45 μL的1.6 mol/L、pH 10.5甘氨酸-氢氧化钠，使上清液最终pH值为10。采用荧光酶标仪测定产物7-羟基香豆素的含量。激发波长358 nm，发射波长456 nm。用7-羟基香豆素标准品制作标准曲线，将荧光强度值转换为nmol 7-羟基香豆素/(mg·min)。按公式 (3) 计算7-ECOD比活力。

$R_{7{\text{-}}{\rm ECOD}}=(c_{\text{产}}\times {V_{\text{总}}})/({t \times m_{\rm pro}})$

(3)

式中，R_7-ECOD为7-ECOD比活力(nmol/(mg·min))，c_产为产物浓度 (nmol/μL)，V_总为反应总体积 (μL)，t为反应时间 (min)，m_pro为蛋白含量 (mg)。

1.5 白背飞虱蜜露排泄量测定

取拔节期TN1稻苗，去掉次生分蘖后，在主茎上套1只大小为5.0 cm × 5.0 cm的石蜡膜小袋^[14]，每袋接5头经保湿且饥饿2 h的白背飞虱羽化后1 d的雌性成虫，分别置于18、23、28和32 ℃下，每处理30次重复。24 h后取下小袋，用万分之一电子天平称每袋质量，按公式 (4) 计算平均每头试虫排泄的蜜露量。

$ \begin{split}&{\text{单头试虫蜜露排泄量}}=\\ & ( {\text{处理后小袋质量}}- {\text{处理前小袋质量}})/ {\text{总虫数}} \end{split}$

(4)

1.6 数据分析

生物活性测定结果采用Probit软件分析LC₅₀值，95%置信区间和斜率。相对毒力为最低温度下测得的LC₅₀值与各温度下测得的LC₅₀值的比值。采用Ducan’s多重比较分析酶活性和蜜露含量差异显著性 (P < 0.05，表示差异显著)。

2 结果与分析 2.1 不同温度下环氧虫啶对白背飞虱的毒力

结果 (表1) 表明：在18~32 ℃范围内，环氧虫啶对白背飞虱的毒力随温度升高而提高，32 ℃时毒力是18 ℃时的15.6倍，表明温度越高，白背飞虱对环氧虫啶越敏感。

根据毒力测定结果，测定不同温度下经16 mg/L环氧虫啶处理后白背飞虱的死亡率，结果表明：随温度升高，白背飞虱的死亡率显著升高 (图1)。

2.2 温度对白背飞虱解毒酶活性的影响

分别在18~32 ℃下处理3龄若虫24 h后，测定了白背飞虱中酯酶 (EST)、细胞色素P450单加氧酶 (P450) 和谷胱甘肽S-转移酶 (GSTs) 3种解毒酶活性。结果 (图2) 显示：各温度处理间白背飞虱GSTs的比活力无显著差异；而EST比活力随温度的升高呈先上升后下降趋势，且23 ℃和28 ℃ 时活性最高；7-ECOD比活力随温度升高呈下降趋势，在18 ℃和23 ℃之间及28 ℃和32 ℃之间无显著性差异，而在23 ℃和28 ℃之间差异显著。

2.3 温度对白背飞虱分泌蜜露排泄量的影响

通过测定蜜露排泄量可间接反映白背飞虱的取食量。结果表明：在18 ~28 ℃之间，白背飞虱分泌蜜露量显著增大；在28 ~32 ℃之间，蜜露量无显著差异 (图3)。

3 结论与讨论

温度主要通过影响杀虫剂的理化性质和昆虫自身的新陈代谢来影响其毒力^[15-17]。不同杀虫剂之间对温度的敏感性差异显著，本研究中，在18~32 ℃范围内，随着温度升高，白背飞虱对环氧虫啶的敏感性增强。最高温度与最低温度下环氧虫啶对白背飞虱的毒力相差15.6倍，这与马云华等的研究结果相似^[7]。

温度对白背飞虱的生长发育影响较大，白背飞虱的整个发育历期随温度升高而变短^[18]，这可能与不同温度条件下其取食量有关，且白背飞虱的取食量决定了其取食药剂量的多少。稻飞虱以口针刺入维管束组织吸取汁液，在持续吸食期间不断排泄蜜露。蜜露的多少即表示稻飞虱的相对取食量^[19]。本研究测定了18~32 ℃下白背飞虱蜜露排泄量，发现在18~28 ℃条件下，其蜜露量随温度升高显著增加，间接反映其取食量随温度升高而增加。而取食量越大，则摄入的杀虫剂越多。这可能是随温度升高白背飞虱对环氧虫啶敏感性增强的主要原因。

马云华等^[8]研究了温度对麦长管蚜体内主要解毒酶的影响，发现负温度系数药剂与GSTs活性有很大关系，正温度系数药剂与CarE和AChE活性关系密切。本研究结果显示，在18~23 ℃时，3种解毒酶比活力只有酯酶具有显著差异且呈上升趋势，在该温度范围内，根据毒力及蜜露量测定结果显示，白背飞虱敏感性增强，其分泌蜜露量显著增加，说明可能是取食量起主导作用。而在23~32 ℃范围内，酯酶和P450比活力都随温度的升高而降低，且随温度升高白背飞虱取食量显著增加，敏感性逐渐增强，表明在此温度范围内，可能是白背飞虱取食量与体内酯酶、P450两种解毒酶共同作用导致其对环氧虫啶的敏感性增强。当然其中可能还有一些其他因素起着作用，比如昆虫体内解毒酶还可能受杀虫剂的诱导而变化^[20-22]。全林发等^[23]报道，高效氯氰菊酯亚致死浓度能诱导CarE和GSTs活性增强；吴勇超等^[24]发现用环氧虫啶处理苜蓿蚜后，其体内GSTs和P450活力均显著升高，但在本研究中温度的增加却导致了昆虫体内P450酶活性的降低，更加表明P450在影响不同温度下白背飞虱对环氧虫啶敏感性中扮演重要角色，其他因素如个体与群体间对杀虫剂的耐受性差异等还有待进一步的研究。

不同杀虫剂种类之间温度敏感性存在差异。在较低温度下使用环氧虫啶时，应适当提高施药浓度以达到较好的防治效果，在较高温度下使用时则恰好相反。明确温度对杀虫剂的影响，从而更好开发药剂以及利用其本身特性达到害虫防治的目的，对药剂的科学合理使用具有重要意义。