2018, Vol. 20
2. 德宏职业学院，云南 芒市 678400
2. Dehong Vocational College, Mangshi 678400, Yunnan Province, China
从植物中寻找新的杀菌、杀虫活性物质或药物前体，不仅是有效创制新药的经济、快捷途径，也是对植物资源的合理开发与利用。坡柳Dodonaea viscosa (Linn.) Jacq. Enum.，又名车桑子，属无患子科车桑子属，又名铁扫把、明子柴等，灌木或小乔木，原产于澳大利亚，现主要分布于热带和亚热带地区，多年来被认为是一种恶性杂草，可引起草原退化，严重影响牧业发展[1]。
对坡柳研究较多的是其化学成分和药理活性。已陆续从中分离到黄酮类化合物[2-3]、二萜[4-5]和三萜类化合物[6-7]，并证实其具有抗炎[8-9]、抗溃疡活性和解痉等药理活性[10]。近年来对坡柳的报道多见于其生理和生态应用方面[11]，对其次生代谢物质研究较少。笔者在前期研究发现坡柳种子乙醇提取物对小菜蛾和菜粉蝶幼虫有较好拒食活性[12-13]的基础上，采用生物活性跟踪的方法，从坡柳种子乙醇提取物中分离鉴定出一个活性化合物，对其结构进行了鉴定，并初步测定了其对小菜蛾的拒食活性。
1 材料与方法 1.1 供试材料坡柳Dodonaea viscosa种子，购自云南生态技术有限公司，由云南农业大学植物学分类专家李孙文副教授鉴定，标本存放于云南农业大学植物保护学院化学楼生物农药实验室。
小菜蛾Plutella xylostella幼虫：从实验室自养并接有小菜蛾的甘蓝上收集小菜蛾成熟的蛹，放入三角瓶中，待羽化后向瓶中插入涂有甘蓝汁液的自制吹塑纸产卵板，并用10%的蜂蜜水饲喂成虫，每天更换产卵板及蜂蜜水。将产卵板放入温度 (26 ± 1) ℃、相对湿度70%的保温箱内孵化。将已经孵化的产卵板放在甘蓝苗上，幼虫在植株上自主取食，扩繁至3龄。
1.2 仪器与设备硅胶GF254薄层板 (青岛海洋化工厂)；全自动Lisui EZ Purifier III快速制备层析系统，填充材料：小孔硅胶，CHP-20P；普通硅胶柱填料：硅胶粒径48~75 μm，青岛海洋化工厂；凝胶柱、加压反相柱，普通硅胶柱均为自制玻璃柱；加压反相柱填料：硅胶RP-18为40~60 μm，Merk公司；凝胶柱填料：Sephadex LH-20，Phamacia公司；Agilent 1260 Infinit高效液相色谱仪，Alltech 3300 ELSD蒸发光散射检测器。
JASCODIP-370型数字式旋光仪；Bio-Rad FTS-135型红外光谱仪 (KBr压片法)；岛津UV-210A型紫外可见分光光度计；Bruker AM-400及DRX-500核磁共振仪，VG AUTO Spec-3000及Finnigan MAT 90质谱仪。
1.3 坡柳种子乙醇提取物的获得采用秦小萍等的方法[13]。将坡柳干种子20 kg粉碎，先用石油醚 (沸程60~90 ℃) 脱脂后，再用乙醇在室温下浸渍提取3次，每次浸提24 h。合并提取液，减压浓缩得乙醇粗提物1.05 kg。
1.4 化合物的分离纯化通过全自动Lisui EZ Purifier III快速制备层析系统，对乙醇提取物进行反相划段，划段条件为：样品用甲醇溶解后用加压泵压入MCI柱，洗脱剂为V (甲醇) : V (水) = 50 : 50~0 : 100，梯度洗脱；Sephadax LH-20葡聚糖凝胶 (Phamacia) 75 g，装柱，上样量小于100 mg，用甲醇淋洗。流速6 s/滴，先接收初始部分 (约100 mL)，然后按2 mL/管接收。薄层层析 (TLC) 跟踪检测[展开剂为V (氯仿) : V (甲醇) : V (水) = 6 : 4 : 1]，合并相同馏分；加压反相柱分离条件：洗脱剂为V (甲醇) : V (水) = 80 : 20~100 : 0，甲醇按体积分数为5%的比例梯度增加，最后用甲醇洗脱。以上分离采用TLC跟踪检测[展开剂为V (氯仿) : V (甲醇) : V (水) = 6 : 4 : 1]，通过碘显色、10%硫酸乙醇溶液显色和紫外荧光显色检测，合并相同馏分。
制备型色谱Pre-HPLC (Agilent 1260)，色谱制备条件：ZORBAX SB-C18半制备柱 (9.4 mm × 250 mm，5 μm)；洗脱剂为V (甲醇) : V (5%甲酸) : V (乙腈) = 17:48:35；进样量5 μL；流速2 mL/min；柱温30 ℃；化合物1的相对保留时间 (tR) = 32.1 min；检测波长为254、210、208和280 nm。
分析性色谱Ana-HPLC (Agilent 1260)，色谱分析条件：RBAX SB-C18色谱柱 (4.6 mm × 150 mm，5 μm)；洗脱剂为V (甲醇) : V (5%甲酸) : V (乙腈) = 17 : 48 : 35；进样量5 μL；流速2 mL/min；柱温30 ℃；化合物1的tR = 10.1 min ；检测波长为 254、210、208和280 nm。
坡柳种子乙醇提取物 (1.05 kg)，经过Lisui EZ Purifier III快速制备层析系统，收集到用V (甲醇) : V (水) = 80 : 20混合溶剂洗脱的馏分 (2.2 g)，对洗脱后的馏分采用普通反相柱分离[RP-18，洗脱剂为V (甲醇) : V (水) = 80:20~100:0]，得洗脱馏分③1.3 g (该部分洗脱剂为V (甲醇) : V (水) = 80: 20)。
1.5 结构鉴定采用常规方法测定所分离化合物的旋光度、红外光谱及紫外光谱。在VG AUTO Spec-3000及Finnigan MAT 90质谱仪上进行质谱扫描。
核磁共振分析：所分离化合物用氘代氯仿 (CDCl3) 溶解，分别在Bruker AM-400及DRX-500型核磁共振仪 (TMS为内标) 上进行 1H NMR、13C NMR、COSY、DEPT、HMBC、TOCSY、NOESY、HSQC、HSQC-TOCSY和NOESY分析。化学位移以δ表示，偶合常数 (J) 以Hz表示。
1.6 拒食活性测定采用叶碟法[14]测定化合物对小菜蛾3龄幼虫的非选择拒食活性。供试幼虫在温度 (25 ± 1) ℃、相对湿度75%~85%、光照16 h/d的光照培养箱中饲养，24 h后用方格纸测定所剩下的叶面积，计算拒食率。将拒食率转化为机率值，浓度转化为对数值进行线性回归，依据回归方程计算拒食中浓度 (AFC50)。
| ${\text{拒食率}} /{\text{%}} = \frac{{{\text{对照取食面积}}} - {{\text{处理取食面积}}}}{{{\text{对照取食面积}}}} \times 100$ |
对洗脱馏分③1.3 g，通过制备型色谱Pre-HPLC进行制备，得到保留时间为 32 min的组分—化合物1；进一步采用凝胶葡聚糖凝胶柱Sephadax LH-20 (洗脱剂为甲醇) 进行纯化分离，经真空浓缩、冷冻干燥，最终得到纯化后的化合物1 (956 mg)，为白色无定形粉末。用1.4节中的色谱分析条件通过分析型液相色谱Ana-HPLC检测，化合物1的纯度为98%，相对保留时间为10.1 min。通过色谱含量分析，发现其在坡柳种子乙醇提取物的得率为0.91‰。
2.2 结构鉴定化合物1，白色无定形粉末，
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表 1 化合物1及文献化合物dodoneaside B[7] 和R1-barrigenol[16] 的核磁共振数据 Table 1 The NMR datas of compound 1, dodoneasides B[7] and R1-barrigenol[16] |
13C NMR数据 (表1) 显示有56个碳信号 (其中有2个信号发生了重叠)，包括11个甲基、10个亚甲基、25个次甲基和11个季碳信号 (DEPT实验)。化学位移 (δ) 为178.2和171.3的季碳信号表明至少有两个酯键或羧基存在，δ 110.7、105.5和104.5的3个次甲基信号，化合物中存在3个糖基，而氢谱中的3个低场质子信号δ 5.28、4.69、4.53也支持该推测。一维核磁共振谱显示，7个末端甲基的高场信号单峰 (δH 0.85-1.42) 和一个典型的双键信号 (δC 127.0和143.5 (C-12、C-13))，表明该化合物为12-烯齐墩果烷型的三萜皂苷衍生物[16-17]。而在HMBC谱中 (图式 1) ，角甲基质子δH 1.11 (H-23)、δH 0.90 (H-24) 与碳δC 91.9 (C-3)，质子δH 1.42 (H-27) 与碳δC 143.5 (C-13)和68.5 (C-15) 相关，以及质子δH 3.32、3.04 (H-28，d, J = 8.8 Hz) 与碳δC 73.8 (C-22) 的相关，质子δH 0.85、1.09 (H-29和H-30，s) 与碳δC 81.8 (C-21) 相关，表明苷元是3,15,16,21,22,28-hexaoxygenated olean-12-ene；与苷元相比，C-3, C-21, C-22的相差较大，其余位置没有显著变化，表明在C-3, C-21, C-22有取代[7, 16]。糖基信号以及3个糖基的连接顺序通过与文献报道[7]比对以及FAB-MS试验数据来指定。在FAB-MS谱中，1 026 [M–Ara]–、996 [M–Glc]–和863 [M–Ara–Glc]–表明有1个阿拉伯糖基和1个葡萄糖基分别连接在C-3位的葡萄糖醛酸上。C-3位信号δH 3.22和δC 91.9表明糖基连接在该原子上[22]。与Cao等及Zhang等的文献对比[7, 18-22]，15位碳的化学位移和类型均证明在C-15发生了杂原子取代，同时，角甲基δC 1.42 (C-27) 与δC68.5 (C-15) 相关，进一步证明了羟基取代。
C-21位取代基团2,3-环氧-2-甲基丁酰基的结构，可以通过基团中质子信号δH 3.13与碳信号δC 60.8和13.8的HMBC相关，以及δH 1.48与δC 171.3、60.8的HMBC相关来推定。C-22位取代基团2-甲基丁酰基的结构，可通过基团中质子信号δH 2.41与碳信号δC 178.2、27.1和17.1的HMBC相关，以及δH 1.19与δC 178.2、42.8和27.1的HMBC相关来推定。通过HMBC谱中 (图式1)，δH 5.89 (H-21) 与δC 171.3处酯基碳 (C21-1) 信号的相关关系，δH 5.61 (H-22) 的质子信号与δC 178.2处酯基碳 (C22-1) 信号的相关关系，以及5.89 (H-21) 的质子与δC 73.8处的次甲基碳 (C-22)、δC 36.7处季碳 (C-20) 和δC 29.5 (C-29)、δC 20.0 (C-30) 的远程相关点，δH 5.61 (H-22) 的质子与δC 81.8处的次甲基碳 (C-21)、δC 73.95处次甲基碳 (C-16) 和δC 48.2处季碳 (C-17)、δC 63.8出亚甲基碳 (C-28) 的远程相关点，表明两个取代基团分别连接在齐墩果烷骨架的C-21、C-22位上。
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图式1 化合物1关键HMBC和ROESY相关信号 Scheme1 Key HMBC and COSY correlations for compound 1 |
综合各种相关波谱数据，可确认化合物1的结构为21-epoxyangeloyl-15,16,28-tirhydroxy-22-(2-methylbutanoyl)-Olean-12-en-3-(O-α-L-arabinofuranosyl-(1→3)-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronide，为一个新的齐墩果酸型三萜皂苷类化合物，命名为坡柳皂苷A (dodoneaviscoside A)，结构式见图式2。
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图式2 化合物1(坡柳皂苷A)的结构式 Scheme2 Structural formula of compound 1 (dodoneaviscoside A) |
2.3 拒食活性
测定结果表明，坡柳皂苷A (dodoneaviscoside A) 对小菜蛾P. xylostella 3龄幼虫24 h的非选择性拒食活性较强，拒食中浓度 (AFC50) 为 207.4 μg/mL (线性回归方程为y = 3.657 1x – 3.472 8，相关系数r = 0.98)。
3 结论本研究采用小孔树脂柱、凝胶柱、反相柱和Pre-HPLC等多种分离技术从坡柳D. viscosa种子乙醇提取物中分离获得了一种新的齐墩果烷型三萜皂苷类化合物—坡柳皂苷A (dodoneaviscoside A)，初步生物活性测定结果表明，其对小菜蛾P. xylostella 3龄幼虫具有较强的拒食活性，具有进一步研究开发的潜力。
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