2018, Vol. 20
2. 中华人民共和国宁波海关，浙江 宁波 315012
2. Ningbo Customs Distric, P.R.China, Ningbo 315012, Zhejiang Province, China
活性天然产物模型是新农药创制的重要手段，本课题组一直关注结构新颖的活性天然产物，如对Drimane类倍半萜[1-3]和唑啉类生物碱天然产物[4]进行了合成方法和农药活性方面的探索，并发现了新型的农药候选化合物。丁香提取物具有抗病毒[5]、抗氧化[6]、抗菌[7-9]和杀虫或杀螨[10-11]等广泛的生物活性，其主要成分丁香酚 (结构见图式1) 对斜纹夜蛾等具有较好的杀虫活性[10]，对荔枝霜疫霉具有明显的抑制作用[12]。唑啉的生物电子等排体异唑啉具有广泛的农药生物活性，已被广泛用于农药和医药分子设计中[13-15]，如杜邦公司研发的新型含异唑啉的杀菌剂氟噻唑吡乙酮 (oxathiapiprolin) 对卵菌病害有特效，对其他病害也有较好的生物活性，具有用量少、作用机制独特、对哺乳动物低毒等特点，曾为杜邦公司赢得“Agrow Awards”中的最佳创新化学奖[16]。
本研究以天然产物丁香酚和廉价易得的苯甲醛类化合物为原料，采用活性亚结构拼接法，通过1,3-偶极环加成等反应，制备了35个新型异唑啉类化合物 (D1~D32，E1~E3)，对其化学结构进行了鉴定，并初步测定了所有目标化合物对几种常见植物病原真菌的抑菌活性，初步探讨了结构与抑菌活性的关系。目标化合物的设计及合成路线见图式1。
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图式1 基于丁香酚的新型异唑啉类化合物的设计与合成路线 Scheme1 Design and synthesis of novel isoxazolines from eugenol |
1 实验部分 1.1 试剂与仪器
SHZ-III型循环水式真空泵 (郑州长城)；WRS-1B型数字熔点仪 (上海仪电)；DRX-400型核磁共振仪 (德国Bruker，TMS为内标，溶剂为CDCl3)；Elementar Vairo EL元素分析仪(德国Elementar)；SX-500型高压蒸汽灭菌锅 (日本TOMY)；IKA RV8型旋转蒸发仪 (德国IKA)；AIRTECH SW-CJ-1F型超净工作台 (江苏苏净)。98%的多菌灵原药 (carbendazim，百灵威科技有限公司)。试剂均为分析纯，购自安耐吉化学或者迈瑞尔化学技术有限公司。
1.2 供试菌株水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani、油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、番茄早疫病菌Alternaria solani和辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici，均由南京农业大学植物保护学院农药系保存并提供。
1.3 化合物的合成 1.3.1 化合物C的合成以苯甲醛氯代肟中间体C1的合成为例。将苯甲醛 (A1，4.08 mL，40.0 mmol)、碳酸钠 (6.36 g，60.0 mmol) 和盐酸羟胺 (4.17 g，60.0 mmol) 加入到25 mL水中，加热回流，薄层层析[TLC，V(石油醚):V(乙酸乙酯)= 8:1]监测至苯甲醛反应完全。向体系中加入10 mL饱和氯化铵溶液淬灭反应，用乙酸乙酯 (75 mL × 3) 萃取，合并有机相，依次用饱和氯化铵 (50 mL × 3)、水 (50 mL × 3) 和饱和氯化钠溶液 (50 mL × 1) 洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后，得到苯甲醛肟B1 4.48 g，无色油状液体，收率92.5%。
将化合物B1 (2.42 g，20.0 mmol) 溶于35 mL二氯甲烷中，加入N-氯代琥珀酰亚胺 (NCS，3.2 g，24.0 mmol) 和0.02 mL吡啶，于25 ℃下反应3 h。用二氯甲烷 (30 mL × 3) 萃取，有机相依次用饱和氯化铵 (20 mL × 3)、水 (20 mL × 3) 和饱和氯化钠溶液 (20 mL × 3) 洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后，得到苯甲醛氯代肟中间体C1 2.82 g，无色油状液体，收率90%。直接用于下一步反应。其余芳香醛氯代肟C2~C32按照此方法制备。
1.3.2 异唑啉类目标化合物D1的合成合成方法A：参考文献[15]方法。将苯甲醛氯代肟C1 (1.85 g，10.0 mmol) 溶于 50 mL无水二氯甲烷中，加入丁香酚 (1.55 mL，10.0 mmol) 后缓慢滴加三乙胺 (1.66 mL，12.0 mmol)，室温下反应，TLC[V(石油醚):V(乙酸乙酯)= 5:1]监测反应至化合物C1反应完全。加入10 mL饱和氯化铵溶液淬灭反应，用二氯甲烷萃取 (30 mL × 3)，依次用饱和氯化铵溶液 (30 mL × 3)、水 (30 mL × 3) 和饱和氯化钠溶液 (30 mL) 洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后，用硅胶柱层析纯化[洗脱剂V(石油醚):V(乙酸乙酯)= 6:1]，得2-甲氧基-4-((3-苯基-4,5-二氢异唑-5-基)甲基) 苯酚D1 2.35 g，黄色固体，收率83%，熔点 (m.p.) 121.3~121.5 ℃ (文献值[18] 100~101 ℃)。
合成方法B：参考文献[17]方法。将化合物B1 (1.21 g，10.0 mmol) 和过一硫酸氢钾复合盐 (4.61 g，7.5 mmol) 加入到17 mL水中，加入丁香酚 (1.55 mL，10.0 mmol) 和氯化钾 (7.45 g，10.0 mmol)，25 ℃下反应2 h，TLC[V(石油醚):V(乙酸乙酯)= 5:1]监测至反应完全。向反应体系中加入水，分液后，用二氯甲烷萃取 (20 mL × 3)，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液 (20 mL × 3)、水 (20 mL × 3) 和饱和氯化钠溶液 (20 mL × 3) 洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后，用硅胶柱层析纯化[V(石油醚):V(乙酸乙酯)= 6:1]，得黄色固体D1 2.58 g，m.p. 121.3~121.5 ℃，收率91%。
采用合成方法A完成目标化合物D2~D32的制备。
1.3.3 化合物E1的合成将三氯化铝 (399 mg，3.0 mmol) 和碘化钠 (900 mg，6.0 mmol) 溶于10 mL无水二氯甲烷中，冰浴条件下加入化合物D1 (283 mg，1.0 mmol)，TLC[V(石油醚):V(乙酸乙酯)=4:1]监测，常温下反应约5 min后原料消失。过滤，用二氯甲烷洗涤 (15 mL × 3)，合并有机相，分别用水 (10 mL × 3)、饱和氯化钠溶液 (10 mL × 2) 洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后，用硅胶柱层析纯化[洗脱剂为V(石油醚):V(乙酸乙酯)= 5:1]，得4-((3-苯基-4,5-二氢异唑-5-基)甲基)苯-1,2-二醇(E1) 188 mg，黄色油状液体，收率70%。
1.3.4 化合物E2的合成将化合物D1溶于10 mL乙腈中，加入碳酸钾 (165 mg，1.2 mmol)，冰浴条件下缓慢滴加乙酰氯 (71 μL，1.0 mmol)，反应体系自然恢复至室温，TLC[V(石油醚):V(乙酸乙酯)= 5:1]监测至反应完全，减压蒸除溶剂。加入15 mL水和15 mL二氯甲烷，分液后，水相用二氯甲烷萃取 (15 mL × 3)，合并有机相，依次用水 (15 mL × 3) 和饱和氯化钠溶液 (15 mL × 2) 洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后，用硅胶柱层析纯化[洗脱剂V(石油醚):V(乙酸乙酯)= 6:1]，得2-甲氧基-4-((3-苯基-4,5-二氢异唑-5基)甲基)苯基乙酸酯 (E2) 266 mg，无色油状液体，收率82%。
1.3.5 化合物E3的合成分别称取化合物D1 (283 mg，1.0 mmol)、苯硼酸 (122mg，1.0 mmol) 和醋酸铜 (199.7 mg，1.1 mmol) 于干燥的50 mL圆底烧瓶中，加入无水二氯甲烷 (15 mL) 溶解，滴加三乙胺(694 μL), 磁力搅拌常温下反应，TLC[V(石油醚):V(乙酸乙酯)= 6:1]监测至反应完全。过滤，用二氯甲烷 (15 mL × 3) 洗涤，减压浓缩后，用硅胶柱层析纯化[洗脱剂V(石油醚):V(乙酸乙酯)= 5:1]，得到5-(3-甲氧基-4-苯氧苄基)-3-苯基4,5-二氢异唑 (E3) 257 mg，白色固体，收率72%，m.p. 85.8~86.1 ℃。
目标化合物的理化数据、质谱及元素分析数据见表1，核磁共振氢谱数据见表2。
1.4 杀菌活性测定采用菌丝生长速率法[19]测定目标化合物对供试4种植物病原真菌的离体抑菌活性。将供试化合物用二甲基亚砜溶解并配制成10 000 mg/L的母液，待用。制备供试化合物质量浓度分别为50 mg/L和25 mg/L的马铃薯葡萄糖培养基 (PDA) 平板，接种病原菌培养后用十字交叉法测量菌落直径，按 (1) 式计算抑制率。以丁香酚为参照，以98%的多菌灵原药为阳性对照，每个处理均设3次重复。对抑制率较高的化合物进行精密毒力测定。将化合物母液按等比稀释法稀释成50、25、12.5、6.25和3.125 mg/L的系列质量浓度药液，分别测定其对供试病原菌的抑制率，通过SPSS 22 软件分析，计算抑制中浓度 (EC50)。
| ${\text{抑制率}}/{\text\%}\!\!=\!\!\frac{{\text{对照菌落直径}}\!\!-\!\!{\text{处理菌落直径}}}{{\text{对照菌落直径}}\!\!-\!\!{\text{菌饼直径}}}\!\!\text{×}\!\!100$ | (1) |
在合成中间体醛肟B1~B32时发现，芳香醛苯环上的取代基对肟的产率有明显影响，除羟基取代的苯甲醛和杂环醛外 (B19~B23)，其余化合物的产率均达90%以上。中间体氯代肟 (C) 一般通过N-氯代琥珀酰亚胺 (NCS) 处理后制备，产物直接用于下一步反应 (合成方法A)。本研究发现，苯甲醛类化合物的芳基上含有供电子取代基时有利于产率的提高。中间体C在碱性条件下形成的1,3-偶极子和烯烃发生[3+2]环加成反应得到异唑啉类目标化合物D。后来我们也尝试了在过一硫酸氢钾和氯化钾复合盐存在条件下[15]原位生成氯代肟，不经分离，直接经1,3-偶极环加成反应得到目标化合物D1 (合成方法B)，发现此方法可以提高产率、缩短反应时间，为快速制备此类化合物提供了新思路。
化合物D1中的苯甲醚结构片段可以在三氯化铝/碘化钠条件下通过脱甲基化反应，获得含有游离酚羟基的化合物E1；同时分别通过在碱性条件下的酰基化反应和Chan-Lam反应[20]对丁香酚苯环上的酚羟基进行保护，得到乙酸酯类化合物E2和二芳醚类类似物E3。
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表 1 目标化合物的理化数据、质谱和元素分析数据 Table 1 Physico-chemical data, MS and elemental analysis data of target compounds |
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表 2 化合物的核磁共振氢谱数据 Table 2 1H NMR data of target compounds |
从1H NMR数据可以看出：目标化合物中异唑啉环上的-CH2-和苄基上的-CH2-为4组dd峰，而唑啉环上的CH为多重峰，化学位移在δ 4.97~5.09之间，丁香酚环上的-OH在δ 5.50~5.59之间。从LC-ESI-MS图谱中可以看出，所有目标化合物均显示出较强的[M+H]+或[M+Na]+峰。
2.2 抑菌活性测定结果 (表3) 表明：目标化合物对供试4种植物病原真菌的菌丝生长均表现出较好的抑菌活性，部分化合物对辣椒疫霉病菌的活性高于阳性对照多菌灵，证实了本研究设计的合理性。化合物的抑菌活性表现出了明显的取代基效应：芳香醛片段的苯环上对位取代基的引入不利于抑菌活性的提高，而间位吸电子效应基团的引入有利于抑菌活性的提高 (Cl>H>Me>OH)；向邻位引入取代基对抑菌活性是有利的，这可能是由于邻位基团的引入使得化合物在与靶标作用时更容易形成优势构象，减少熵变；但两个邻位均被取代的化合物并不能显著提高抑菌活性。吡啶和噻唑等杂环片段的引入并未显著提高化合物的抑菌活性 (D21~D23)。目标产物D1中甲氧基脱甲基化 (E1)、酚羟基乙酸酯化 (E2) 或者芳醚化 (E3) 后均使抑菌活性降低，证实了由丁香酚引入的酚羟基和甲氧基对抑菌活性都是必须的。
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表 3 目标化合物对4种植物病原真菌菌丝生长的抑制作用 (抑制率，%) Table 3 Antifungal activities of the target compounds against mycelium growth of 4 plant pathogenic fungif(inhibitory rate, %) |
选取初筛中抑菌活性较好的化合物D26进行了精密毒力测定，发现其对油菜菌核病原菌的EC50为14.3 mg/L (毒力方程为y = 2.807 1 + 1.898 2x，r = 0.984 1)，具有进一步的研究价值。
3 结论本研究以活性天然产物丁香酚和芳香醛类化合物为原料，采用活性亚结构拼接的方法，以1,3-偶极环加成为关键步骤，制备了异唑啉类化合物35个，其中34个为新化合物。抑菌活性测定表明，设计合成的异唑啉类化合物对4种供试病原真菌具有一定的抑菌活性。对这类新异唑啉类化合物构效关系的探讨，可为丁香酚的进一步结构优化以及相关天然产物农药候选化合物的发现打下基础。
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