2018, Vol. 20
2. 合肥市农产品质量检测检验中心，合肥 230091
, QI Chuanyong2, CAO Haiqun1
, SU Yiling1,2, SHANG Luning1,2, TAN Genjia1, JIANG Bingxin1
2. Hefei Testing and Inspection Center for Agricultural Products Quality, Hefei 230091, China
香菇Lentinus edodes在栽培过程中使用了被农药污染的基质载体或农业用水，或直接使用了化学农药均易导致农药残留问题[1]，危及消费者健康及食用菌产业的健康发展[2-3]。近年来，各国都制定了日益严格的农药残留限量标准[4-5]。因此，建立快速、简单、高效的香菇中农药多残留检测技术，加强其农药残留监测，意义重大。
香菇基质复杂，含有大量多糖、嘌呤、核酸、脂肪等[6]，采用传统的色谱分析手段[7]时杂质干扰较大，因此在开展香菇等食用菌产品上的农药多残留分析时，多采用色谱-质谱联用技术[8-14]。中国国家标准[15-16]中采用的Carbon-NH2固相萃取法虽然可以获得比较理想的净化结果，但操作过程复杂且耗时，对操作人员水平要求较高。梁达清等采用QuEChERS前处理技术结合液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 法检测了香菇中23种有机磷类农药残留[17]，但未涵盖国家标准中要求检测的具有毒理学意义的相关代谢物[4]，如甲拌磷的代谢物甲拌磷砜和甲拌磷亚砜等。本研究采用UPLC-MS/MS-MRM模式，拟建立香菇中56种农药残留快速、准确的分析方法，包括44种农药母体及GB/T 2763—2016中规定需要检测的12种具有毒理学意义的代谢物[4]，以期为食用菌质量安全评估提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂香菇Lentinus edodes购于安徽省合肥市农贸市场；56种农药标准品质量浓度均为1 000 mg/L，均购于农业部环境保护科研监测所 (天津)；C18吸附剂和PSA吸附剂 (上海安谱公司)；无水硫酸镁和乙酸钠 (分析纯，上海安谱公司)；乙腈、甲醇、甲酸 (色谱纯，美国Tedia公司)；聚四氟乙烯 (PTFE) (亲水性/疏水性) 和尼龙滤膜 (0.22 μm，上海安谱公司)。
1.2 仪器与设备超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪 (配有电喷雾离子源)(Waters ACQUITY UPLC Xevo TQ，美国Waters公司)；离心机 (Hettich ROTINA380，德国Hettich zentrifugen公司)；多位脉冲涡旋振荡器 (WIGGENS VB424，德国WIGGENS公司)。
1.3 样品前处理方法称取10 g均质后的鲜香菇样品于50 mL离心管中，加入20 mL含1%乙酸的乙腈溶液和3颗玻璃弹珠，涡旋提取2 min后，加入5 g m (无水乙酸钠) : m (无水硫酸镁) = 1 : 4的混合萃取填料，手摇振荡至充分混匀，于4 000 r/min下离心3 min；准确吸取4 mL乙腈相至预先加入1 g纯化填料[m (PSA) : m (C18) : m (MgSO4) = 1 : 1 : 3]的离心管中，涡旋30 s，于4 000 r/min下离心3 min；取2 mL乙腈相至玻璃试管中，于55 ℃水浴氮吹至近干；用1 mL甲醇溶解残渣，过0.22 μm滤膜后，待分析。
干香菇样品可参考上述方法。取2 g样品，加入8 mL水 (相当于10 g鲜香菇) 浸泡10 min后按上述步骤进行前处理。
1.4 检测条件色谱条件：ACQUITY BEH C18色谱柱 (2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm，美国Waters公司)；流动相A为0.05%甲酸溶液，流动相B为0.05%甲酸-甲醇溶液；梯度洗脱程序：0~0.25 min，90% A；0.25~7 min，90% A~0% A；7~8.5 min，0% A；8.5~10 min，0% A~90% A；流速0.4 mL/min；柱温40 ℃；进样量3 μL。
质谱条件：ESI源；正离子模式；毛细管电压3.0 kV；离子源温度150 ℃；锥孔反吹气流量50 L/h；脱溶剂气温度500 ℃；脱溶剂气流量900 L/h；多反应监测模式 (MRM)。
1.5 标准溶液配制及标准曲线绘制分别量取一定量56种农药标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释，配制成混合标准储备液，其中，嘧霉胺、多菌灵、三唑酮、磷胺、二嗪磷、三唑磷、哒螨灵和嘧菌酯的质量浓度为5 mg/L，吡虫啉、噻虫嗪、异菌脲、氟虫腈及其代谢物质量浓度为20 mg/L，其余农药为 10 mg/L，于 –18 ℃贮存，备用。试验时，用基质空白溶液逐级稀释，配成系列基质匹配混合标准溶液，其中，嘧霉胺、多菌灵、三唑酮、磷胺、二嗪磷、三唑磷、哒螨灵和嘧菌酯的质量浓度为1、2.5、5、10、25、50、100 μg/L，吡虫啉、噻虫嗪、异菌脲、氟虫腈及其代谢物的为4、10、20、40、100、200、400 μg/L，其余的为2、5、10、20、50、100、200 μg/L，按1.4节的条件进行测定。以目标组分的峰面积 (y) 对相应的质量浓度 (x) 绘制标准曲线。
1.6 添加回收试验向空白样品中准确加入56种农药混合标准储备液，制备3个水平的添加样品，每个水平重复5次。其中，嘧霉胺、多菌灵、三唑酮、磷胺、二嗪磷、三唑磷、哒螨灵和嘧菌酯的添加水平分别为25 μg/kg (低浓度)、50 μg/kg (中浓度) 和100 μg/kg (高浓度)，吡虫啉、噻虫嗪、异菌脲、氟虫腈及其代谢物为100 μg/kg (低浓度)、200 μg/kg (中浓度) 和400 μg/kg (高浓度)，其余为50 μg/kg (低浓度)、100 μg/kg (中浓度) 和200 μg/kg (高浓度)。按1.3节的方法进行提取、净化，按1.4节条件测定，并采用基质匹配外标法定量，计算添加回收率和相对标准偏差。
1.7 基质效应由于香菇样品基质复杂，在前处理过程中遗留在分析液中的各种无机物和有机物会对目标化合物的离子化程度产生很大影响[18]，因此，本研究考察了香菇基质中目标化合物的基质效应。采用提取后加入法[19]，分别用纯甲醇和空白样品提取液配制等浓度的标准溶液 (嘧霉胺、多菌灵、三唑酮、磷胺、二嗪磷、三唑磷、哒螨灵和嘧菌酯的添加水平为50 μg/L，吡虫啉、噻虫嗪、异菌脲、氟虫氰及其代谢物为200 μg/L，其余农药为100 μg/L)，按1.4节条件测定，并根据公式ME = cm/cs对基质效应 (ME) 进行评价。其中，cm为空白基质中目标化合物的浓度；cs为溶剂中目标化合物的浓度。当ME=1时无基质效应；当ME＞1时为基质增强效应；当ME＜1时为基质减弱效应。其中，当0.8≤ME≤1.2时为弱基质效应；当0.5＜ME＜0.8或1.2＜ME＜1.5时为中等强度基质效应；当ME ≤0.5或ME≥1.5时为强基质效应[20]。
2 结果与分析 2.1 检测条件的优化分别配制1 000 μg/L的56种农药单一标准溶液，通过比较正/负电离模式，优化母离子、子离子、锥孔电压以及碰撞能等质谱条件，以获得目标化合物离子对最优响应值，优化后的质谱条件如表1所示。
本研究选择超高效液相色谱法进行目标化合物的分离，与传统的高效液相色谱法相比，可以在更短的时间内获得更好的分离度，从而显著缩短分析时间。同时，考虑到所有化合物均选择ESI+ 模式，因此比较了含体积分数0.05%甲酸的乙腈溶液 + 0.05%甲酸溶液和含0.05%甲酸的甲醇溶液 + 0.05%甲酸溶液两种流动相体系，综合考虑色谱峰型、化合物响应值和分离度等指标后，选择含0.05%甲酸的甲醇溶液 + 0.05%甲酸溶液作为流动相。结果显示，10 min的分析时间内，56种农药获得了较好的分离，并且响应值理想，标准溶液色谱图见图1(A)。
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表 1 56种农药的质谱检测条件 Table 1 MS parameters for the determination of the 56 pesticides |
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A. 56种农药标准品 (嘧霉胺、多菌灵、三唑酮、磷胺、二嗪磷、三唑磷、哒螨灵和嘧菌酯的质量浓度为50 μg/L，吡虫啉、噻虫嗪、异菌脲、氟虫腈及其代谢物为200 μg/L，其余农药为100 μg/L)；B. 样品空白；C. 样品添加 (嘧霉胺、多菌灵、三唑酮、磷胺、二嗪磷、三唑磷、哒螨灵和嘧菌酯的添加水平为50 μg/L，吡虫啉、噻虫嗪、异菌脲、氟虫腈及其代谢物的添加水平为200 μg/L，其余农药为100 μg/L). A. Total ion chromatogram of standards of 56 pesticides (pyrimethanil, carbendazim, triadimefon, phosphamidon, diazinon, triazophos, pyridaben and azoxystrobin 50 μg/L, imidacloprid, thiamethoxam, iprodione, fipronil and its metabolites 200 μg/L, all remaining pesticides 100 μg/L); B. Total ion chromatogram of sample blank; C. Total ion chromatogram of sample spiked (pyrimethanil, carbendazim, triadimefon, phosphamidon, diazinon, triazophos, pyridaben and azoxystrobin 50 μg/L, imidacloprid, thiamethoxam, iprodione, fipronil and its metabolites 200 μg/L, all remaining pesticides 100 μg/L). 图 1 多反应监测总离子流色谱图 Fig. 1 Total ions chromatograms of multiple reaction monitoring |
2.2 样品前处理方法的优化 2.2.1 提取净化方法的选择
参考美国AOAC 2007.01标准方法[21]并加以改进：提取方面，AOAC 2007.01选择15 g样品加入15 mL乙腈，但由于香菇样品含水率较低，为了保证提取效率，本研究取10 g样品加入20 mL乙腈；净化方面，鉴于观察到的香菇提取液的颜色较浅，因此净化时未加入用于去除色素的石墨化碳黑 (GCB)，以降低一些平面化结构农药被吸附的风险。空白香菇样品按上述方法提取净化后，杂质干扰小，色谱图见图1(B)。
2.2.2 溶剂及滤膜的选择定容溶剂及滤膜的选择通常是农药残留分析过程中容易被忽视的部分，多数学者认为该步骤对农药回收率的影响较小。然而本研究发现，采用V (甲醇) : V (水) = 1 : 1或V (乙腈) : V (水) = 3 : 2作为溶剂时，部分化合物的回收率较低。对3种不同滤膜 (有机尼龙膜、亲水性PTFE膜、疏水性PTFE膜) 进行比较后发现，当选择V (甲醇) : V (水) = 1 : 1或V (乙腈) : V (水) = 3 : 2作为溶剂时，部分化合物有明显的损失，平均损失率 (n = 3) 分别为多菌灵30%、三唑磷17%、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐21%、甲拌磷20%、哒螨灵80%，其余化合物损失可以忽略。考虑到不同产品批次间的差异，这种由于滤膜吸附导致的损失并不稳定，不仅降低了方法的回收率，还降低了方法的精密度；而采用甲醇或乙腈作为溶剂时，选用以上任一滤膜均没有造成损失，故本研究最终选择甲醇作为定容溶剂，亲水性PTFE膜作为滤膜。此外，本研究采取降低进样量至3 μL的方法来克服甲胺磷、乙酰甲胺磷等农药的溶剂效应。
2.3 方法的线性范围与定量限按1.5节配制基质匹配标准溶液，用UPLC-MS/MS测定并绘制标准曲线，结果 (表2) 表明：在线性范围内，56种农药的质量浓度与对应的峰面积间具有较好的线性关系，决定系数 (R2) 均大于0. 99。对线性范围内最低浓度香菇空白基质匹配标准溶液进行分析，以被测化合物定量离子对信噪比S/N=10确定的方法定量限 (LOQ) 在0.01~5.56 μg/kg之间。
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表 2 56种农药的线性范围、标准曲线、决定系数及定量限 Table 2 Linear ranges, linear regression equations, determination coefficients and LOQs of the 56 pesticides |
2.4 方法的准确度及精密度
按1.6节方法进行添加回收试验，结果 (表3) 显示：56种农药的回收率均在71%~121%之间，相对标准偏差在0.6%~9.2%之间，添加回收色谱图见图1(C)。
2.5 基质效应基质效应评价结果 (表3) 显示：灭多威等40种农药表现为弱基质效应，甲胺磷等16种农药表现为中等强度基质效应；仅苯醚甲环唑和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐表现为基质增强效应，其余均为基质减弱效应。为保证检测结果的准确性，降低基质效应对结果带来的误差，在实际样品的检测中应采用基质匹配标准溶液。
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表 3 56种农药的平均回收率、相对标准偏差 (n = 5) 及基质效应 (n = 3) Table 3 Recoveries and RSDs of the 56 pesticides spiked at three levels (n = 5) and matrix effect (n = 3) |
2.6 实际样品分析
对购于农贸市场的10批次香菇样品进行了测定，其中1份香菇样品中检出多菌灵 (55 μg/kg)，其余样品均未检出。
3 结论本研究采用QuEChERS前处理技术结合超高液相色谱-串联质谱法 (UPLC-MS/MS)，建立了一种简便、快速的测定香菇中56种农药残留的分析方法，实现了复杂基质一次提取、快速净化、农药多残留快速筛查及确证检测技术的有机融合，显著缩短了检测时间，降低了检测成本，保证了检测结果的准确性。并对香菇样品检测时的基质效应进行了分析，受检的56种农药中，16种农药受基质效应影响较大，表现为中等强度基质效应，因此在实际样品检测中应采用空白基质匹配标准溶液的方法加以补偿。定容溶剂及滤膜的选择对于哒螨灵等部分农药残留分析结果的准确性影响较大，需要引起广大检测人员的重视。
| [1] |
唐俊. 食用菌中农药多残留分析方法研究[D]. 合肥: 安徽农业大学, 2009.
TANG J. Development of a multiresidue screening method for the determination of pesticides in edible fungi[D]. Hefei: Anhui Agricultural University, 2009. |
| [2] |
管道平, 胡清秀. 食用菌药残留限量与产品质量安全[J]. 中国食用菌, 2008, 27(2): 3–6.
GUAN D P, HU Q X. Maximum pesticide residues limits for edible fungi product quality and safety[J]. Edible Fungi China, 2008, 27(2): 3–6. |
| [3] |
张丙春, 张红, 李慧冬, 等. 我国食用菌标准现状研究[J]. 食品研究与开发, 2008, 29(10): 162–165.
ZHANG B C, ZHANG H, LI H D, et al. The study of the actualities of our state standards for edible fungi[J]. Food Res Dev, 2008, 29(10): 162–165. doi:10.3969/j.issn.1005-6521.2008.10.050 |
| [4] |
食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量: GB 2763—2016[S]. 北京: 中国标准出版社, 2017.
National food safety standard-maximum residue limits for pesticides in food: GB 2763—2016[S]. Beijing: Standards Press of China, 2017. |
| [5] |
毛雪丹. 日本" 肯定列表制度”及其农药残留限量标准[J]. 中国食品卫生杂志, 2006, 18(1): 91–92.
MAO X D. Japan "Positive List System" and its pesticide residue limits[J]. Chin J Food Hygiene, 2006, 18(1): 91–92. |
| [6] |
张书香, 谢建春, 靳林溪, 等. 同时蒸馏萃取/气-质联用分析黑龙江香菇香味成分[J]. 精细化工, 2010, 27(5): 456–462.
ZHANG S X, XIE J C, JIN L X, et al. Analysis of volatile flavors in Heilongjiang Lentinus edodes by simultaneous distillation and solvent extraction combining with GC-MS [J]. Fine Chem, 2010, 27(5): 456–462. |
| [7] |
王会锋, 冯书惠, 贾斌. 香菇中40种农药残留量的气相色谱法测定[J]. 食品科学, 2010, 31(20): 335–341.
WANG H F, FENG S H, JIA B. GC Method for the determination of forty pesticide residues in shiitake mushroom[J]. Food Sci, 2010, 31(20): 335–341. |
| [8] |
水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法: GB/T 20769—2008[S]. 北京: 中国标准出版社, 2009.
Determination of 450 pesticides and related chemicals residues in fruits and vegetables-LC-MS-MS method: GB/T 20769—2008[S]. Beijing: Standards Press of China, 2009. |
| [9] |
食品安全国家标准 水果和蔬菜中500种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法: GB 23200.8—2016[S]. 北京: 中国标准出版社, 2017.
National food safety standards—determination of 500 pesticides and related chemicals residues in fruits and vegetables gas chromatography-mass spectrometry: GB 23200.8—2016[S]. Beijing: Standards Press of China, 2017. |
| [10] |
于彦彬, 谭丕功, 刘宗兴, 等. 基质校正固相萃取液相色谱-串联质谱法测定食用菌中22种农药残留[J]. 分析化学, 2013, 41(8): 1259–1263.
YU Y B, TAN P G, LIU Z X, et al. Determination of 22 pesticides residues in domestic fungus by solid phase extraction and LC/MS/MS with matrix correction[J]. Chin J Anal Chem, 2013, 41(8): 1259–1263. |
| [11] |
白冰, 董茂锋, 邢增涛, 等. 气相色谱-质谱法检测双孢蘑菇和香菇中的67种农药残留[J]. 食用菌学报, 2011, 18(1): 63–69.
BAI B, DONG M F, XING Z T, et al. Determination of 67 different pesticide residues in Agaricus bisporus and Lentinus edodes fruit bodies by gas chromatography-mass spectrometry [J]. Acta Edulis Fungi, 2011, 18(1): 63–69. |
| [12] | CAO X L, LIU S H, YANG X Q, et al. A modified QuEChERS sample preparation method for simultaneous determination of 62 pesticide residues in edible fungi using gas chromatography–triple quadrupole mass spectrometry[J]. Food Anal Methods, 2016, 9(1): 263–274. doi:10.1007/s12161-015-0200-0 |
| [13] | CHANG Q Y, FAN C L, CHEN H, et al. Determination of 187 pesticide residues in edible fungi by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Anal Methods, 2014, 6(12): 4288–4304. doi:10.1039/c3ay42213e |
| [14] | NAN J X, WANG J, PIAO X F, et al. Novel and rapid method for determination of organophosphorus pesticide residues in edible fungus using direct gas purge microsyringe extraction coupled on-line with gas chromatography–mass spectrometry[J]. Talanta, 2015, 142: 64–71. doi:10.1016/j.talanta.2015.04.035 |
| [15] |
食品安全国家标准 食用菌中440种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-质谱法: GB 23200.12—2016[S]. 北京: 中国标准出版社, 2017.
National food safety standards-determination of 440 pesticides and related chemicals residues in mushrooms Liquid chromatography-mass spectrometry: GB 23200.12—2016[S]. Beijing: Standards Press of China, 2017. |
| [16] |
食品安全国家标准 食用菌中503种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法: GB 23200.15—2016[S]. 北京: 中国标准出版社, 2017.
National food safety standards—determination of 503 pesticides residues in mushrooms gas chromatography-mass spectrometry: GB 23200.15—2016[S]. Beijing: Standards Press of China, 2017. |
| [17] |
梁达清, 苏肯明, 张菊梅, 等. 高效液相色谱-串联质谱法测定香菇中23种有机磷农药[J]. 食品科学, 2014, 35(4): 159–162.
LIANG D Q, SU K M, ZHANG J M, et al. Determination of 23 organophosphorus pesticide residues in Lentinus edodes by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Food Sci, 2014, 35(4): 159–162. doi:10.7506/spkx1002-6630-201404033 |
| [18] | TAYLOR P J. Matrix effects: the Achilles heel of quantitative high-performance liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry[J]. Clin Biochem, 2005, 38(4): 328–334. doi:10.1016/j.clinbiochem.2004.11.007 |
| [19] | MATUSZEWSKI B K, CONSTANZER M L, CHAVEZ-ENG C M. Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS[J]. Anal Chem, 2003, 75(13): 3019–3030. doi:10.1021/ac020361s |
| [20] |
刘进玺, 秦珊珊, 冯书惠, 等. 高效液相色谱-串联质谱法测定食用菌中农药多残留的基质效应[J]. 食品科学, 2016, 37(18): 171–177.
LIU J X, QIN S S, FENG S H, et al. Matrix effects in the analysis of pesticides residues in edible fungi by HPLC-MS/MS[J]. Food Sci, 2016, 37(18): 171–177. doi:10.7506/spkx1002-6630-201618028 |
| [21] | LEHOTAY S J. Determination of pesticide residues in foods by acetonitrile extraction and partitioning with magnesium sulfate: collaborative study[J]. J AOAC Int, 2007, 90(2): 485–520. |