以苦参碱为有效成分的农药产品已广泛用于水果^[1]、蔬菜^[2]、茶树^[2-3]和中药材^[4]等作物及林业^[5]上的多种病虫害的防治，如粉虱^[6]、害螨^[7]、蚜虫^[8]、棉铃虫^[8]、苹果炭疽病、苹果树腐烂病和葡萄霜霉病等^[9]，且对作物生长具有一定的促进作用^[10-11]，是中国最具代表性的植物源农药品种^[12]。据中国农药信息网记载，截止2017年8月，已有105种含苦参碱成分的农药产品获得登记，位居中国植物源农药之首^[13]。

然而，目前对苦参碱类农药产品的环境安全性研究尚未见系统性的公开报道，已有报道中的受试生物仅限于部分非靶标生物和环境行为研究，或仅评价了苦参碱单一化合物及制剂的安全性，如研究表明：苦参碱在小白菜和黄瓜上易降解^[14-15]，在自然水体中易降解^[16]，在土壤中不易残留；0.36%苦参碱水剂对蜜蜂、斑马鱼和家蚕均为低毒^[17]；0.3%苦参碱水剂对六斑月瓢虫的安全性较高^[18]。截至目前，尚未见有关苦参碱制品 (母药和制剂) 对非靶标生物毒性的系统评价。安全性评价是新农药开发与应用中必不可少的环节，不仅为新农药的登记提供基础毒理学数据，还可为其科学合理使用提供理论依据与指导。

苦参碱类农药产品主要包括苦参碱、苦参提取物和苦参总生物碱等，其中，以苦参提取物作为母药的苦参碱水剂最为常见，已被广泛用于蔬菜、水果、烟草及茶叶等农作物上多种病虫害的防治^[19-20]。鉴于此，笔者系统测定并比较了苦参碱、苦参总生物碱、苦参乙醇浸膏和0.3%苦参碱水剂对生态环境中非靶标生物 (鹌鹑、家蚕、蜜蜂、蚯蚓、蝌蚪、斑马鱼) 的毒性及农作物 (豇豆) 对其的敏感性，以期为该类农药的登记及正确合理使用提供依据。

1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 供试药剂

苦参碱 (matrine) 标准品 (纯度 ≥95%)，由内蒙古鄂尔多斯市金驼药业有限责任公司提供；苦参乙醇浸膏 (苦参碱质量分数为4.3%，剩余部分包括其他初生和次生代谢物质)：以苦参根由工业乙醇提取制备；苦参总生物碱 (质量分数 ≥96%)：从苦参乙醇浸膏中提取获得；0.3%苦参碱水剂由苦参乙醇浸膏、无水乙醇 (5%)、吐温-80(6%) 和水 (84.7%) 配制而成；助剂系统：为0.3%苦参碱水剂中除苦参乙醇浸膏之外的助剂 (5%无水乙醇、6%吐温-80，以蒸馏水补足到100%)。除苦参碱标准品以外的其他供试药剂均为自提自制。

1.1.2 供试生物

鹌鹑Coturnix chinensis：美国红唇与朝鲜龙城的F₁代，30日龄，购于陕西兴平养殖专业户。选用同批大小均匀、雌雄各半的鹌鹑，试验前在室温25 ℃ ± 2 ℃、自然光照条件下驯养7 d。

家蚕Bombyx mori：品种为菁松 × 皓月，2~5龄幼虫，购于西北农林科技大学蚕桑研究所。

意大利蜂Apis mellifera L.：成年工蜂，购于陕西杨凌蜜蜂养殖户。

赤子爱胜蚯蚓Eisenia foetida：饲养3个月左右带有明显生殖环带，体重300~600 mg/只，购于陕西杨凌三度蚯蚓科技有限公司。

泽蛙Rana limnocharis ：采自陕西杨凌渭河边孵化10ｄ左右的蝌蚪，在实验室预养2ｄ后，选用健壮、个体均一的蝌蚪，整个试验期间不喂食。

斑马鱼Brachydanio rerio：体长 3~4 cm，个体质量 (0.3 ± 0.1) g，购于陕西杨凌水产养殖户。鱼苗健壮无病，大小一致，试验前在实验室条件下驯养7 d，每日喂食1~2次，曝气充氧，光照14 h，及时清除粪便及食物残渣。试验前1 d至试验结束停止喂食，保持其他条件不变。

豇豆Vigna unguiculata：供试品种为“一把抓”和“高科”，分别由武汉金阳红种苗农业有限公司和杨凌农业高科技发展股份有限公司提供。

1.2 试验设计与方法

试验均在西北农林科技大学无公害农药研究服务中心参照《化学农药环境安全评价试验准则》(以下简称“准则”) 等相关试验标准进行。先进行预试验，确定受试生物对供试药剂的最低全致死剂量和最高全存活剂量。正式试验时，在此剂量范围内设置5~7个梯度浓度处理，以助剂系统作为0.3%苦参碱水剂的对照，以5%的乙醇水溶液作为其他处理的对照，每处理3个重复，每重复10只 (头、尾) 相应的生物个体 (其中蚕茧量损失法试验中家蚕为50头，蜜蜂触杀毒性试验为20头，蝌蚪20尾)。斑马鱼、蝌蚪饲养和试验用水均采用经曝气处理24 h以上的自来水。试验过程中，若加入的供试药剂远高于标准规定的低毒水平剂量时，在相应时间内供试生物仍未出现死亡，则终止试验。

1.2.1 对鹌鹑的毒性试验

采用经口一次性染毒法^[21]。供试鹌鹑以经口灌注法一次性给药1.0 mL/100 g_鹌鹑，每组10只鹌鹑 (雌雄各半)，连续7 d观察受试鹌鹑的死亡情况与中毒症状，试验在通风透光、温度25 ℃ ± 2 ℃的实验室中进行。

1.2.2 对家蚕的毒性试验 1.2.2.1 食下毒叶法

参考文献[22-24]方法，在直径9 cm的玻璃培养皿内饲养2龄起蚕，用不同浓度的药液5 mL浸渍5 g桑叶，晾干供蚕食用。整个试验期间饲喂处理桑叶，观察记录24、48和96 h受试家蚕中毒死亡情况。依据0.3%苦参碱水剂田间施药浓度与其致死中浓度(LC₅₀) 的比值，划分药剂对家蚕的风险等级^[24]。

1.2.2.2 蚕茧量损失法

参考文献[23, 25]方法，将5 g新鲜桑叶用5 mL不同质量浓度药液浸渍，晾干备用。选用2龄起蚕作为供试虫体，每天用处理过的有毒桑叶喂养3次，直至结茧化蛹。供试药剂为0.3%苦参碱水剂，设3个浓度组，每组浓度分别为其LC₅₀值的1/10、1/100和1/1 000，同时设清水和助剂对照。在试验过程中，随机抽取20个蚕茧，分别称量蚕茧和茧皮质量。

1.2.3 对蜜蜂的毒性试验 1.2.3.1 胃毒法

参考文献[23, 26]方法，将供试药液与蜂蜜按体积比 2 : 1混匀制成药蜜，用0.3 g脱脂棉浸渍药蜜，置于装有10头蜜蜂的三角瓶的纱网上，通过网眼供蜜蜂摄食。观察并记录处理24 h和48 h蜜蜂死亡情况。

1.2.3.2 点滴法

参考文献[23, 26]方法，用微量注射器点滴1.0 μL质量浓度为15 mg/mL的供试药液于蜜蜂的前胸背板，待蜂身晾干后转入试验笼中，用脱脂棉浸泡适量蜜和水饲喂，观察并记录处理24 h和48 h蜜蜂中毒症状及死亡情况。

1.2.4 对蚯蚓的毒性试验

采用土壤浸泡法^[27-28]。按比例将不同浓度药液加入500 g人工配制的标准土壤 (表1) 中拌匀，补加适量蒸馏水，调节土壤含水率为20%。将蚯蚓放入含有药土的标本瓶中，纱布扎瓶口，置于20 ℃ ± 1 ℃、湿度80%~85%的条件下培养，于第7 d和第14 d倒出瓶内土壤，观察记录蚯蚓的中毒及死亡情况，及时清除死蚯蚓。

1.2.5 对蝌蚪的毒性试验

采用半静态法^[29]。每缸分别配制不同浓度的药液各2 L，充分搅拌均匀，投放蝌蚪20尾，调节试液温度在20 ℃左右。每隔24 h更换1次药液，观察并记录24 h与48 h蝌蚪死亡情况。

1.2.6 对鱼类的毒性试验

采用半静态法^[30]。供试斑马鱼在实验室条件下驯养14 d，饲养及试验水温均为25 ℃ ± 2 ℃，光周期L : D=16 h : 8 h。试验开始后6 h内随时观察记录受试鱼的中毒及死亡情况，其后于24、48、72、96 h观察记录结果并及时清除死鱼。

1.2.7 对后茬作物豇豆生长的影响

采用土培法^[31]。选用直径12 cm的盆钵，装入药土 (用定量的供试药剂与土壤充分拌匀所得)，播入2粒种子，然后将盆钵置于人工气候箱中 (25 ℃ ± 2 ℃)，以底部吸湿法加水。定期 (7 d、14 d) 观察记录发芽率 (出苗率)、株高、主根长、须根数、植株鲜重和植株干重。

1.3 数据处理及毒性评价

试验数据利用SPSS 20.0进行统计，计算受试生物的LC₅₀ 值或致死中量 (LD₅₀) 及95%置信限，并依据“准则”中标准判定其毒性级别。

2 结果与分析 2.1 苦参碱制品对鹌鹑的毒性

测定结果 (表2) 表明：苦参碱、苦参总生物碱、0.3%苦参碱水剂和苦参乙醇浸膏经口灌注7 d后对鹌鹑的毒性均为低毒；但不同制品之间的致死中量 (LD₅₀) 存在一定差异，其中0.3%苦参碱水剂和苦参乙醇浸膏较苦参碱和苦参总生物碱毒性更低。

2.2 苦参碱制品对家蚕的毒性 2.2.1 苦参碱制品对家蚕的急性毒性

食下毒叶法测定结果 (表3) 表明：苦参总生物碱、0.3%苦参碱水剂、苦参碱和苦参乙醇浸膏对家蚕的LC₅₀值 (本文所涉及的剂量或浓度无特殊说明均为有效成分) 分别为1 300、821、>3 000和 >5 000 mg/L，根据农药对家蚕的毒性等级划分准则 ^[22]，苦参碱制品对家蚕均为低毒。依据0.3%苦参碱水剂田间施药浓度 (参照中国农药信息网0.3%苦参碱水剂登记时的推荐用量^[32]，4.87~7.80 g/hm²/LC₅₀的比值分析，苦参碱制品对家蚕均为低风险性。

2.2.2 0.3%苦参碱水剂对家蚕的慢性毒性

测定结果 (表4) 表明，0.3%苦参碱水剂对蚕茧和蚕茧皮质量均无影响，各处理间也无显著差异，说明苦参碱水剂对家蚕无慢性毒性。

2.3 苦参碱制品对蜜蜂的毒性

点滴法测定结果表明：以15.0 μg/头的剂量点滴处理后，48 h后蜜蜂的死亡率为0；胃毒法测定结果 (表5) 表明，苦参碱制品对蜜蜂具有一定的毒性，但不同制品间存在差异。根据农药对蜜蜂的毒性等级划分准则^[26]，苦参碱制品对蜜蜂无触杀毒性，胃毒毒性均为低毒。

2.4 苦参碱制品对蚯蚓的毒性

测定结果 (表6) 表明，0.3%苦参碱水剂对蚯蚓的LC₅₀ >1 000 mg/kg _土壤，苦参总生物碱对蚯蚓的毒性比苦参碱和苦参乙醇浸膏高，但LC₅₀值均在 400~600 mg/kg_土壤 之间。根据农药对蚯蚓的毒性等级划分准则^[28]，苦参碱制品对蚯蚓的毒性均为低毒。

2.5 苦参碱制品对蝌蚪的毒性

测定结果 (表7) 表明，0.3%苦参碱水剂对蝌蚪48 h-LC₅₀值为15 mg/L；而以100 mg/L的苦参碱和苦参总生物碱处理蝌蚪，24 h和48 h均无死亡现象，因此认为苦参碱和苦参总生物碱对蝌蚪的LC₅₀值远大于100 mg/L。根据农药对蛙类的毒性等级划分准则^[29]，苦参碱制品对蝌蚪均为低毒。

2.6 苦参碱制品对斑马鱼的毒性

测定结果 (表8) 表明，各供试样品对斑马鱼的毒性具有一定的差异，其中0.3%苦参碱水剂的毒性比苦参乙醇浸膏高10倍。然而，根据农药对鱼类的毒性等级划分准则^[30]，苦参碱制品对斑马鱼的毒性均为低毒。

2.7 苦参碱制品对后茬作物豇豆的影响

测定结果 (表9) 表明：与对照相比，各供试药剂对豇豆品种“一把抓”的各项测试指标的影响没有明显差异；对“高科”的发芽率、株高、主根长和须根数也没有明显影响，但对植株鲜重表现出一定的抑制作用，且处理间有一定差异；另外，苦参碱制品有利于“高科”豇豆干物质的积累，尤其是苦参碱水剂可明显提高其干重。以供试剂量1 000 mg/kg_干土计算，各苦参碱制品对作物的安全系数均远大于10。根据农药对作物的风险等级划分标准^[33]，4种苦参碱制品对后茬种植的豇豆属于低风险性。

3 讨论

有研究表明，苦参碱类植物源农药不仅具有良好的杀虫、抑菌作用，而且可以促进作物生长，提高植物抗逆性^[20]，是目前中国植物源农药开发的热点，探讨其对非靶标生物毒性具有重要意义。本研究结果表明，苦参碱、苦参总生物碱、0.3%苦参碱水剂和苦参乙醇浸膏对非靶标生物鹌鹑、家蚕、蜜蜂、蚯蚓、蝌蚪和斑马鱼的毒性均为低毒，对后茬作物豇豆属于低风险性，该结果与陈昂^[17]、王庆森^[18]和熊鑫^[10]等的研究结果较为一致；另有研究表明，苦参碱在6 种自然水体 (池塘水、河水、雨水、湖水、海水和自来水) 中均属于易降解型，半衰期在 6.3~12.8 d之间^[16]。可见，苦参碱对非靶标生物毒性较低，对环境较为安全。

值得注意的是，尽管0.3%苦参碱水剂对非靶标生物的毒性为低毒，但其对斑马鱼、蝌蚪、蜜蜂和家蚕的LC₅₀值均低于苦参碱、苦参总碱及浸膏，表明苦参碱制剂的毒性高于其母药。这一结果与雷公藤生物碱和川楝素等植物源农药的毒性评价结果较为类似：1.0%雷公藤生物碱微乳剂对蝌蚪为高毒，对鹌鹑和家蚕为中毒，对鲤鱼、蜜蜂和蚯蚓均为低毒，而雷公藤乙醇浸膏对鹌鹑为中毒，对蜜蜂、家蚕、鲤鱼、蚯蚓和蝌蚪均为低毒^[34]；0.5%川楝素乳油对家蚕、蜜蜂、蚯蚓和瓢虫等为低毒，对鹌鹑中毒，对蝌蚪高毒，而78%川楝素原粉对鹌鹑、家蚕、蜜蜂、蚯蚓、瓢虫和蝌蚪均为低毒^[23]。其原因可能在于制剂中的助剂在供试药剂有效成分对生物表皮的穿透性方面起到了促进作用，致使毒性增加。

目前，中国对植物源农药母药的定义为：指在生产过程中得到的由有效成分及有关杂质组成的产品，可能含有少量必需的添加剂和适当的稀释剂；进行登记时，母药的产品识别可通过有效成分或标志性有效成分和限制性组分进行识别^[35]。据此，苦参碱的母药，可以是苦参碱单体化合物，也可以是苦参总生物碱，或苦参乙醇浸膏，注明苦参碱为有效成分即可。本研究表明，苦参乙醇浸膏的毒性低于苦参总生物碱和苦参碱，这与雷公藤生物碱^[34]、川楝素^[23]、枯茗酸^[33]等植物源农药较为类似，均表现为粗提物的毒性低于单体化合物。植物源农药的有效成分往往为多种成分的混合物，这些成分对靶标生物可能均产生作用^{[20, 36]}，因此，尽管苦参碱、苦参总生物碱和苦参乙醇浸膏都可作为苦参碱类农药的母药，但基于上述原因，笔者认为苦参碱类农药产品在登记母药时，应以苦参浸膏为主，不但安全性高，而且保证了有效成分的完整性，符合植物源农药的特点。当然，从化学组成来看：苦参乙醇浸膏为多组分混合物，包括蛋白、糖类、色素、生物碱及其他多种次生代谢物质；而苦参总生物碱是苦参碱、氧化苦参碱等多种生物碱类化合物的总和；苦参碱母药中则主要为苦参碱单体化合物。这些母药的毒性差异可能与其中化学成分的差异有关，尤其是苦参乙醇浸膏的毒性低于苦参总生物碱和苦参碱，其原因还有必要进一步研究。

总之，苦参碱制品对家蚕、蜜蜂、蚯蚓、蝌蚪、斑马鱼和鹌鹑及后茬作物豇豆均较为安全，其田间应用具有良好的生态效益；建议在登记苦参碱母药时，以苦参乙醇浸膏为主。