2018, Vol. 20
2. 湖南农业大学 植物保护学院，长沙 410128
, PAN Jiuyue2, MATSUMOTO Haruna1, FAN Xiaoyan1, LIN Ting1, QIAN Yuan1, ZHU Guonian1, WANG Mengcen1
2. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
稻曲病又称假黑穗病、绿黑穗病、青粉病和谷花病等。中国早在明朝李时珍《本草纲目》中便有指稻曲病子实体为“粳谷奴”的记载。该病在亚洲、美洲和非洲的30多个国家及中国各稻区都有不同程度发生[1]。一般穗发病率为4%~6%，严重时达50%以上，粒发病率为0.2%~0.4%，高的可达5%以上。它不仅使秕谷率、青米率及碎米率增加，局部田块减产10%~30%[2]，而且能产生对人和牲畜有剧毒作用的真菌毒素，进而引起人畜中毒[3-5]。自20世纪70年代以来，由于水稻耕作制度的改变、化学肥料的大量使用，以及杂交水稻的推广，稻曲病的发生及危害呈加重趋势，已成为中国及世界上许多稻区的主要病害之一[6]。
稻曲病病原菌为Ustilaginoidea virens(Cooke) Takahashi，异名：U. oryzae(Pat) Bref.，属半知菌亚门绿核菌属，有性态为Claviceps oryzae sativae Hashioka，主要通过侵染水稻穗部致病[7]。病理学研究发现，稻曲病菌可在水稻的灌浆初期或者扬花期从谷粒的外稃和内稃间隙侵入，在黄熟期的稻穗上形成大于谷粒的稻曲球，其中心为菌丝组织密集构成的白色肉质块，表面覆盖大量的黄色或墨绿色厚垣孢子，外围因产生厚垣孢子的菌丝成熟度不同而分为3层：外层最早成熟，呈墨绿色或橄榄绿色；第2层为橙黄色；第3层为黄色[8]。稻曲球的形成，不仅导致了水稻减产，同时可产生严重影响稻米品质的两类真菌毒素：一类是属环状多肽类化合物的Ustiloxins[9]，另一类是属双萘并吡喃酮类化合物的Ustilaginoidins[10]。据报道，U. virens产生的两类毒素能够阻止细胞微管蛋白的聚合，干扰细胞骨架的形成，并可抑制细胞有丝分裂，人或牲畜误食后会出现内脏发生病变等中毒现象[11]。
具有杀菌活性的先导化合物的离体筛选是稻曲病菌防控研究的关键基础，而高效、可靠的离体培养体系是生物测定试验开展的重要步骤。在常见的马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 培养基上培养7 d即可完成对多数半知菌亚门真菌的生物测定试验，如：木霉菌在PDA培养基上培养5 d，菌丝体直径即可长到80~90 mm[12]；镰刀菌在PDA培养基上培养10 d，菌丝体可长到70~80 mm[13]。据报道，U. virens培养体系目前多采用市场上的商品化培养基，如PDA培养基、马铃薯蔗糖琼脂 (PSA) 培养基、胁本哲氏培养基和大米粒培养基。在30 d的培养周期内，U. virens菌丝体的直径分别仅为60.3 mm (PDA培养基)、69.8 mm (PSA培养基)、59.6 mm (胁本哲氏培养基) 和65.9 mm (大米粒培养基)[14]。可见，U. virens在离体培养体系中生长缓慢，培养周期长，严重制约了室内生物测定试验的效率和杀菌活性化合物的筛选，也成为了U. virens相关研究工作开展的一道门槛[15]。
鉴于此，笔者通过研究碳源、氮源、凝固剂和金属阳离子 (Mg2+) 在不同组合与配比下对U. virens生长速率的影响，优化和筛选出适合U. virens生长的固体离体培养体系，并验证了其对不同来源的U. virens菌株的培养效果，旨在为稻曲病菌生理生化及防治等相关研究的开展提供一个有效、可靠的培养体系。
1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 药剂与生化试剂配制培养基所需的碳源和氮源：葡萄糖 (G) 和蔗糖 (S)，购于国药集团化学试剂北京有限公司；D-果糖 (F) 和可溶性淀粉 (D)，购于上海麦克林生化科技有限公司；生化蛋白胨 (P) 和酵母提取物 (Y)，购于英国OXOID公司；L-亮氨酸 (L) 和L-谷氨酸 (E)，购于上海麦克林生化科技有限公司。凝固剂：琼脂 (A，北京索莱宝科技有限公司)；结冷胶 (GG，大连美仑生物技术有限公司)。无水乙醇、升汞、磷酸氢钾、七水合硫酸镁、氯化钠、七水合硫酸亚铁、二水合钼酸钠、四水合硫酸锰和氢氧化钠均购于国药集团化学试剂北京有限公司；链霉素，购于上海麦克林生化科技有限公司。所有试剂及化合物均为分析纯。
真菌DNA提取试剂盒 (美国OmegaBio-Tek公司)；液氮 [比欧西气体 (苏州) 有限公司]；ITS引物 (上海桑尼生物科技有限公司)；Taq酶和DNA Marker (DL2000)，[宝生物工程 (大连) 有限公司]。引物序列：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG (19 bp)；TS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC (20 bp)。
1.1.2 主要仪器MLS3752L-PC高压蒸汽灭菌锅[松下电器 (中国) 有限公司]；XT5107-IM250霉菌培养箱 (杭州雪中炭恒温技术有限公司)；MP2002电子天平 (上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；MS-H280-Pro加热型磁力搅拌器[大龙兴创实验仪器 (北京) 有限公司]；FE20实验室pH计 (梅特勒-托利多 (METTLER TOLEDO)；EN034285PCR仪[伯乐生命医学产品 (上海) 有限公司]；EPS100核酸电泳仪 (上海天能科技有限公司)；2500R凝胶成像系统 (上海天能科技有限公司)；Te2000-S光学显微镜 (尼康株式会社)。
1.1.3 商品化培养基商品化培养基 (含琼脂)：马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 培养基 (美国BD) 和马铃薯蔗糖琼脂 (PSA) 培养基 (北京酷来搏科技有限公司)；商品化培养基 (不含琼脂)：营养肉汤 (NB) 培养基、LB-MILLER肉汤 (LB) 培养基、海生菌肉汤 (MB) 培养基和马铃薯葡萄糖 (PS) 培养基均购于美国BD公司。所有不含琼脂的商品化培养基均加入琼脂 (每100 mL培养液含1.5 g琼脂) 以便制作固体培养基培养病菌。
1.1.4 供试菌株新鲜的稻曲球分别采自山东东营市 (SD)、江苏常州市 (JS)、浙江杭州市 (ZJ01)、浙江诸暨市 (ZJ02) 的发病水稻植株，于–4 ℃贮存。
1.2 稻曲病菌株的分离及鉴定 1.2.1 稻曲病菌株的分离及致病性鉴定将从不同地区采集到的稻曲球放入75%的乙醇溶液中60 s，再放入0.1%的升汞乙醇溶液中消毒5 min，然后用灭菌水冲洗3次，用灭菌纸吸干表面的水分，将稻曲球的内层组织切成小块，置于含有100 mg/L链霉素的PSA培养基上，每皿3块，28 ℃培养[16-17]。10 d后挑取平板培养基上的菌丝体，通过显微镜观察菌丝和孢子的形态特征，以判断分离培养的菌种是否为U. virens。
将分离培养得到的病菌，用无菌水稀释成浓度为10–6/L的菌悬液。在水稻破口抽穗时，用注射器吸取菌悬液1 mg/L接种在稻苞的下端，接种后稻穗外罩塑料薄膜，25 ℃下保湿处理72 h后移至室外自然条件下培养，经常喷水保持湿度。观察接种后水稻穗部的发病情况。
1.2.2 稻曲病菌株DNA序列鉴定U. virens基因组DNA提取：将U. virens接种于PS培养液中，于28 ℃黑暗、150 r/min条件下培养10 d后装在50 mL离心管中，5 000 r/min离心15 min，收集菌丝体。称取1 g菌丝体，用液氮磨成细粉状，转入1.5 mL离心管中，按照OMEGA真菌DNA提取试剂盒提供的参照步骤提取DNA。以基因组DNA为模板对rDNA-ITS片段进行扩增，引物为ITS1与ITS4[18]。50 μL PCR反应体系为：5 μL PCR Buffer (10 ×)，4 μL dNTP (2.5 mmol/L)，2 μL DNA模板 (100~200 ng/μL)，引物ITS1(10 mmol/L) 与ITS4(10 mmol/L) 各2 μL，1 μL Taq DNA polymerase (5 U/μL)，34 μL ddH2O。PCR反应程序为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，最后72 ℃扩展10 min，35个循环。
1.3 培养基的配制配制培养基中各成分基础比例为：每1 mL培养基中含有碳源2 g，氮源1 g，琼脂粉1.5 g或结冷胶0.05 g；每1 L无机盐溶液中含有磷酸氢钾50 g，七水合硫酸镁25 g，氯化钠25 g，七水合硫酸亚铁1 g，二水合钼酸钠1 g和四水合硫酸锰1 g，用氢氧化钠 (10 mol/L) 调节pH值至7.0，稀释200倍使用。选择作为氮源的物质有：酵母提取物、蛋白胨、亮氨酸和谷氨酸；选择作为碳源的物质有：可溶性淀粉、蔗糖、果糖和葡萄糖；凝固剂分别为琼脂和结冷胶。
用以上培养基成分及比例所配制的培养基[19]为：酵母葡萄糖琼脂 (YGA) 培养基，酵母蔗糖琼脂 (YSA) 培养基，酵母果糖琼脂 (YFA) 培养基，酵母淀粉琼脂 (YDA) 培养基，蛋白胨葡萄糖琼脂 (PGA) 培养基，蛋白胨蔗糖琼脂 (PSA*) 培养基，蛋白胨果糖琼脂 (PFA) 培养基，蛋白胨淀粉琼脂 (PDA*) 培养基，亮氨酸葡萄糖琼脂 (LGA) 培养基，亮氨酸蔗糖琼脂 (LSA) 培养基，亮氨酸果糖琼脂 (LFA) 培养基，亮氨酸淀粉糖琼脂 (LDA) 培养基，谷氨酸葡萄糖琼脂 (GGA) 培养基，谷氨酸蔗糖琼脂 (GSA) 培养基，谷氨酸果糖琼脂 (GFA) 培养基，谷氨酸淀粉糖琼脂 (GDA) 培养基，酵母果糖结冷胶 (YFGG) 培养基，蛋白胨蔗糖结冷胶 (PSGG) 培养基。
1.4 商品化培养基与配制培养基对U. virens菌丝体生长速率的影响在超净工作台中，将分离纯化并经培养后的U. virens ZJ01沿菌落边缘切成5 mm × 5 mm的菌块接种在供试商品化培养基中，每种培养基设3个重复。在相同条件下，将U. virens ZJ01菌块接种在配制培养基中，每种培养基设3个重复。
25 ℃恒温培养21 d，用十字交叉法测量菌落生长直径，并计算其生长速率[16]。
1.5 优化的固体培养体系对不同菌株的适用性将分离纯化并经活化得到的U. virens ZJ01、ZJ02、SD和JS置于在超净工作台上，沿菌落边缘切5 mm × 5 mm的菌块，接种在PSGG培养基及PDA培养基中。各设3个重复。25 ℃培养21 d，用十字交叉法测量菌落生长直径，并计算其生长速率[16]。
1.6 Mg2+ 浓度对菌丝体生长的影响培养基中离子的浓度不仅影响固体培养基的凝固效果，还会影响真菌的培养效果。选择YFGG培养基和PSGG培养基为基础培养基，在每1 mL培养基中各加入无水硫酸镁0.01、0.02、0.05和0.1 g，共8个处理，每处理3个重复，观察培养基是否凝固，并将供试菌株U. virens ZJ01接种在完全凝固的培养基中，25 ℃培养21 d，用十字交叉法测量菌落生长直径，并计算其生长速率[16]。
1.7 数据统计分析试验数据用SPSS统计软件进行统计分析。
2 结果与分析 2.1 稻曲病菌株的鉴定 2.1.1 稻曲病菌株分离鉴定结果分离得到的病原菌，经液体培养后在显微镜下观察其形态特征，病原菌菌丝及薄壁分生孢子如图1A所示。将其人工接种于水稻稻穗后，发现水稻谷粒内部结块膨大，水稻颖壳胀破，露出块状物；随后继续增大，后期在正常水稻谷表面形成谷粒4~5倍大小的墨绿色稻曲球 (图1B)，前期表面光滑，之后出现龟裂，散发孢子。人工接种后的发病特征符合稻曲病的典型病征[2]，初步可确定分离培养得到的病原菌为稻曲病菌株。
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A. 稻曲病菌菌丝及分生孢子形态；B. 稻曲球形态 A. Hypha and conidiophore of U. virens under optical microscope；B. False smut of U. virens 图 1 稻曲病病原体形态特征 Fig. 1 Morphological feature of rice false smut pathogen |
2.1.2 稻曲病菌株ITS序列鉴定
为了验证蛋白胨蔗糖结冷胶 (PSGG) 培养基对不同菌株的适用性，从不同气候区域的稻田稻曲球中采集和分离了4份样品，分离得到4株可能的U. virens，分别命名为U. virens ZJ01、U. virens ZJ02、U. virens JS和U. virens SD。对菌株进行DNA提取，PCR扩增获得大小一致且均位于500~750 bp的rDNA-ITS片段 (图2)。经BLAST比对分析发现，4株菌和U. virens Liao-Rfsb149(Genebank登录号KX067883.1) 的ITS序列相似度为99%，故均鉴定为U. virens。
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Marker: 100-2 000 bp；1-2：U. virens ZJ01；3-4：U. virens ZJ02；5-6：U. virens JS；7-8：U. virens SD 图 2 ITS-PCR产物凝胶电泳 Fig. 2 Gel electrophoresis for product of ITS-PCR |
2.2 不同成分培养基对U. virens生长速率的影响
结果表明：对于商品化培养基，U. virens在PDA培养基中的生长速率最高，为2.3 mm/d (表1)。对于配制培养基，U. virens在蛋白胨蔗糖结冷胶 (PSGG) 培养基和酵母粉果糖结冷胶 (YFGG) 培养基中的生长速率均大于其在PDA培养基中的生长速率，且在PSGG培养基中的生长速率最高，为3.4 mm/d (表2)，但其在蛋白胨蔗糖琼脂 (PSA*) 培养基、蛋白胨果糖琼脂 (PFA) 培养基中的生长速率与其在PDA培养基中的生长速率并无明显差异，说明添加的凝固剂可能对该菌株的生长率也具有一定影响。U. virens在PSGG培养基与PFA培养基中培养28 d后典型生长形态见图3。综上所述，在供试商品化培养基和配制培养基中，PSGG培养基是最适合U. virens离体培养的培养基。
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表 1 U. virens在商品化培养基上的生长效果 Table 1 Growth efficiency of U. virens on commercial medium |
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表 2 U. virens在配制培养基上的生长效果 Table 2 Growth efficiency of U. virens on compound medium |
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A． 蛋白胨蔗糖结冷胶 (PSGG) 培养基；B.蛋白胨果糖琼脂 (PFA) 培养基 A．Peptone sucrose gellan gum (PSGG) medium; B. Peptone fructose agar (PFA) medium 图 3 U. virens在不同培养基中培养28 d的生长效果图 Fig. 3 Growth performance of U. virens on different media at 28 d |
2.3 不同来源U. virens菌株在PSGG培养基中的生长速率
测定结果 (图4) 表明：4株稻曲病菌在PSGG培养基中的生长速率 (大于3.5 mm/d) 均显著高于其在PDA培养基中的生长速率 (最高2.5 mm/d)，表明PSGG培养基对采自不同地区的U. virens均有较好的培养效果。
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*代表差异显著 (Student t-test，P < 0.05)。 *Significant difference (Student t-test, P < 0.05). 图 4 U. virens在不同培养基上的生长速率 Fig. 4 Growth rate of U. virens on different media |
2.4 Mg2+质量分数对结冷胶凝固状态及U. virens生长的影响
研究结果表明：当在PSGG培养基和YFGG培养基中添加Mg2+的质量分数为0.01%时，培养基不会凝固；而当Mg2+的质量分数为0.02%时，培养基完全凝固，且U. virens生长速率不受抑制，分别为3.5与2.8 mm/d (表3)；U. virens的生长速率随Mg2+质量分数增大而减小，表明Mg2+对U. virens的生长具有抑制作用，且浓度越大抑制效果越明显，这与前人的研究结果[21]相符。
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表 3 U. virens在含不同质量分数Mg2+ 的PSGG和YFGG培养基上的生长效果 Table 3 Growth rate of U. virens on PSGG and YFGG medium with the addition of different concentrations of Mg2+ |
3 结论与讨论
真菌固体培养基的主要组成成分为碳源、氮源、无机盐和凝固剂，其中碳源主要为碳水化合物，氮源主要为蛋白质和氨基酸，两者是菌体生长和代谢所必需的前体物质，可合成真菌自身所需的结构蛋白以及生化反应中必不可少的生物酶，直接参与次生代谢产物的生物合成，同时也是合成其他生物分子的代谢中间体，可作为底物提供细胞生理活动所必需的能量，是细胞生长、代谢和产物生产的重要营养物质[16]。本研究结果发现，以蔗糖和葡萄糖等单糖作为培养病菌的碳源时，U. virens菌丝体生长效果较好；而以可溶性淀粉作为碳源时，培养效果不理想，这表明适合U. virens生长的碳源与多数半知菌亚门的真菌相同，多以单糖为主[23]。
U. virens对氮源的利用情况则与碳源有所不同。U. virens在多数混合氮源中的生长效率优于单一氮源，如以蛋白胨作为氮源时，生长效率较高，而以亮氨酸和谷氨酸等氨基酸作为单一氮源时，生长效率低下甚至停止生长。此外还发现，在部分商品化培养基，如LB-MILLER肉汤 (LB) 培养基与海生菌肉汤 (MB) 培养基中，U. virens生长效果较差，这可能是由于其缺乏真菌生长所必须的物质所致。
在固体培养基中，凝固剂是其核心组成，一般不会被微生物利用和分解，并且可促进菌丝生长和保持培养基水分[24-25]，便于后期相关生测试验的进行和观察。常见的固体培养基凝固剂有琼脂、卡拉胶、黄原胶、明胶、结冷胶等，其中琼脂是最常用的凝固剂，但本研究发现，相对于琼脂，结冷胶[26]对U. virens的生长具有明显的促进作用，是更适合U. virens生长的固体培养基的凝固剂[27]。其原因可能有：1) 琼脂来源于富含次生代谢物的红藻，而结冷胶来源于假单胞杆菌的胞外多糖，结冷胶生产制备过程中所带入的次生代谢产物相对较少，而琼脂则可能在加工过程中带入了抑制U. virens生长的副产物[28]。2) 有报道发现，结冷胶对培养的微生物无生长抑制作用，甚至促进微生物的生长[22]。除了能够促进U. virens的生长之外，结冷胶与其他同类产品相比具有用量少，弹性、硬度和凝固点、熔点可调节，形成的凝胶具有很高的强度和透明度，热稳定性好且耐酸碱等特点[21]。因此，结冷胶作为一种新型的微生物代谢胶，在真菌固体培养基中具有广阔的应用前景[17, 20]。
无机盐混合溶液通常含有磷酸盐缓冲物及Mg2+、Na+、Fe2+ 等金属阳离子，离子是构成真菌维持正常生理过程的主要成分，也可作为辅酶或酶的组成部分以维持酶的活性，调节细胞渗透压、氢离子浓度及氧化还原电位等，某些无机盐可以作为激活剂作用于酶类如蛋白酶[19]。本研究发现，在以结冷胶作为凝固剂的固体培养基中，Mg2+ 的浓度影响培养基的凝固效果，同时过高的浓度 (质量分数≥0.1%) 也会对U. virens的生长有一定的抑制作用，这可能是由于阳离子的浓度通过影响真菌生长环境的渗透压从而影响真菌生长效果。
综上所述，通过对U. virens培养体系中的氮源、碳源、凝固剂及Mg2+质量分数进行筛选和优化，发现以蛋白胨作为氮源 (2%)、蔗糖作为碳源 (1%)、结冷胶 (0.05%) 作为凝固剂及Mg2+的最终添加质量分数为0.02%时，所配制的培养基体系适合U. virens的离体生长。本研究构建的PSGG培养基可以提高U. virens的生长速率，可用于杀菌活性物质的筛选，也为探索U. virens防治手段的相关工作提供了重要参考。
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