2017, Vol. 19
2. 浙江大学 农药与环境毒理研究所，杭州 310029
2. Institute of Pesticide and Environmental Tooxicology, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China
随着工农业生产的迅速发展，目前水体污染现象已普遍存在，其中化学农药和重金属污染问题尤为突出，河流、湖泊、池塘和沟渠等水系已成为除农田土壤以外蓄积量最大的污染物聚集地。受污染的农田水系不仅会直接造成水生生物中毒及水产养殖灾害，而且易引起二次污染，对作物生产、生态平衡和人体健康形成威胁。
目前关于单一污染物污染效应的研究较多[1-3]。然而，在实际生态系统中存在的大多是由多种污染物共同作用而形成的复合污染效应，存在着协同、拮抗、相加等多种方式的相互作用[4]。多种污染物共存并产生不同程度的污染和危害已成事实，多元复合污染物对环境非靶标生物的联合污染效应有别于单因子的生物效应也已在众多研究中得到证实[5]。Heindel等[6]通过模拟方法研究了美国California和Lowa两州地下水体中农药-化肥复合污染物的构成及其对小鼠发育与繁殖的影响，以期估测其对人体健康的可能影响。Forget等[7]研究了重金属砷 (As)、镉 (Cd) 与克百威、敌敌畏和马拉硫磷共存时对多种水生生物死亡率的影响。然而，目前有关农田水系中重金属镉、铅与农药共存条件下对水生生物的复合污染效应仍鲜见报道。而大型溞Daphnia magna因对环境变化敏感性高、繁殖周期短和易培养等特点而被广泛应用于水生生态毒性的研究中[8-9]。基于此，本研究选取3种生产中常用的典型农药毒死蜱、三唑磷、氟虫腈以及常见重金属元素铅和镉，重点研究了其复合污染物对大型溞的联合毒性效应，以期揭示生态系中复合污染物-生物体之间的内在联系与规律，为开展生态环境污染研究、发展无公害及有机农业提供数据支持，同时为复合污染物的水环境生态风险性评价提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验生物大型溞Daphnia magna为浙江大学农药与环境毒理研究所引种的62 D. M纯品系生物株。饲养密度为每50 mL曝气水 (微粒体 < 20 mg/L，总有机碳 < 2 mg/L，未解离氨 < 1 μg/L，残留氯 < 10 μg/L，总有机氯 < 25 ng/L) 中饲养1只母溞。每2天换1次培养液，每天喂食栅藻 Scemedesmus subspicatus，投饵密度为2.0 × 105~3.0 × 105 cells/mL，每天监测栅藻的密度。挑选出生6~24 h的幼溞进行毒性试验，其对药剂的敏感性测定符合ISO标准[10]。
1.2 药剂及主要仪器99.98%毒死蜱 (chlorpyrifos) 原药 (钱江化学股份有限公司)；99.00%三唑磷 (triazophos) 原药 (浙江新农化工股份有限公司)；99.50%氟虫腈 (fipronil) 原药 (拜耳作物科学公司)；Pb(WO3)2、CdCl2·H2O等均购于华东医药有限公司。
Sartorius 1700电子分析天平 (精确到0.1 mg，梅特勒-托利多国际有限公司)；PHS-2F pH计 (上海仪电科学仪器股份有限公司)；LRH-150-G型光照培养养箱 (广州沪瑞明仪器有限公司)；SJG-203A型溶解氧分析仪 (上海仪电科学仪器股份有限公司)；SW-CJ-1F无菌操作台 (江苏苏净集团有限公司)。
1.3 试验方法 1.3.1 单一因子急性毒性测定急性毒性试验参考OECD–202 (2012)[11]进行。将5只幼溞放入盛有50 mL曝气水的烧杯中，添加不同浓度单一污染物进行染毒，每个处理重复4次。培养过程中保持水温为 (21 ± 1) ℃，光照/黑暗 = 16 h/8 h，试验期间不投放饵料，不更换试验溶液，48 h后观察试溞存活状况并记录结果。采用DPS系统[12]中的生物测定剂量效应法计算每种药物的48 h-EC50和48 h-EC25值。
1.3.2 多因子急性毒性测定将3种药剂及2种重金属化合物制成复合污染物，采用五因素五水平二次通用旋转组合设计法[13]，结合单因子急性毒性测定结果设定不同浓度，分别于12、24、36、48及60 h观察记录无游动能力试溞数。
1.4 数据处理采用DPS软件统计试验结果，并分析供试农药和重金属对大型溞的急性毒性联合效应，建立回归模型。
2 结果与讨论 2.1 单一因子急性毒性效应通过DPS统计软件中生物测定剂量效应法求得各因子的48 h-EC50和48 h-EC25值 (表1)。结果表明：大型溞对氟虫腈最敏感，对镉则表现出了一定的耐受力，5种污染物对大型溞的单一急性毒性由大到小依次为：氟虫腈 > 毒死蜱 > 三唑磷 > 铅离子 > 镉离子。王增焕等 [14]于2003年在测定中国江河口岸水生生物的重金属含量时，发现皮氏叫姑鱼Johnius belangerii体内镉离子和铅离子的含量分别为10和20 μg/kg，而虾体内镉离子和铅离子含量分别为180和50 μg/kg；丁跃平等[15]测得三唑磷对成体脊尾白虾的48 h-LC50值为8.9 μg/L；金彩杏等[16]测得三唑磷对鲈鱼的48 h-LC50值为13 μg/L。根据《化学农药环境安全评价试验准则》(GBT 31270.1–2014) 中有关污染物对水生生物 (斑马鱼和溞) 毒性的分级标准[17]，本研究中的5种污染物对鱼和甲壳类生物的毒性效应均不可忽视。
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表 1 五种污染物对大型溞的急性毒性 Table 1 The acute toxicity of five selected pollutants to D. magna |
2.2 多因子急性毒性效应 2.2.1 多因子毒性试验设计
根据单因子试验结果，以每种药物的EC25值为变量中值0水平，lg2为步长，设置变量水平 –2、–1、0、1、2，通过DPS系统得到32个处理浓度 (表2)。
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表 2 五因素五水平二次通用旋转组合设计方案 Table 2 Five factors with five levels quadratic ratation combitination genernal design |
2.2.2 多因子试验结果
表2的32组浓度处理中，无游动能力溞数总体上随着时间的延长而增加，但除了编号为2、3、17、19以及27~32的处理组外，其余各处理组大型溞活动受抑制数均在24 h后即趋于稳定，几率值变化不大。表3为多因子染毒48 h试验结果，利用DPS软件对其进行二次通用旋转组合统计分析，建立数学回归模型。
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表 3 多因子处理48 h急性毒性 Table 3 48 h acute toxicity of multi factors treatments |
2.2.3 数学模型的建立与检验
根据二次通用旋转组合回归分析得到回归方程模型，五因素五水平之间的相互关系见式(1)。
| $\begin{aligned}&y = 5.551\; 2 + 0.472\; 4{x_1} + 0.668 \;8{x_2} + 0.632\; 9{x_3} + \\ & \;\;0.099\; 6{x_4} + 2.416\; 2{x_5} + 0.039\; 8{x_1}^2 + 0.036\; 6{{x_2}^2 }+ \\ &\;\; 0.303\; 4{x_3}^2 + 0.511\; 8{x_4}^2 - 0.181\; 6{x_5}^2 + 0.161\; 4{x_1}{x_2} + \\ &\;\; 0.368\; 0{x_1}{x_3} \!-\! 0.223\; 5{x_1}{x_4}\! - \!1.051\; 8{x_1}{x_5} \!- \!0.309\; 6{x_2}{x_3} \!+\! \\ &\;\; 0.165\; 1{x_2}{x_4}\! - \!0.283\; 3{x_2}{x_5}\! +\! 0.371\; 7{x_3}{x_4} \!+\! 0.165\; 1{x_3}{x_5}\! - \!\\& \;\;0.309\; 6{x_4}{x_5}\end{aligned}$ | (1) |
计算该回归方程中各项偏差的平方和，进行失拟性F检验和回归方程的显著性分析。结果表明：失拟项显著性F1 < Fa (a = 0.05)，表明失拟项在0.05水平不显著，可用统计量F2对模型做进一步检验；回归方程显著性F2 > Fa (a = 0.01)，表明回归方程在0.01水平显著，即试验数据与所采用的二次数学模型显著符合，二次回归方程与实际情况拟合较好，将方程 (1) 进一步优化，即可反映农药和重金属之间的复合污染效应。
偏回归系数方差分析表明，比值F小于显著性水平P的均为非显著项，剔除偏回归系数未达到显著水平 (a = 0.10) 的项，简化后的回归方程模型见式(2)。
| $\begin{aligned}y =& 5.551\;2 + 0.472\;4{x_1} + 0.668\;8{x_2} + 0.632\;9{x_3} +\\ & 2.416\;2{x_5} + 0.511\;8{x_4}^2 - 1.051\;8{x_1}{x_5}\end{aligned}$ | (2) |
模型 (1) 和 (2) 中的各因素 (xj) 均经过了无量纲线形变换，其偏回归系数已经标准化。因此，可从其绝对值大小顺序直接判断出各药物对大型溞毒性作用的影响程度，模型 (1) 中的一次项顺序为x5 > x2 > x3 > x1 > x4，二次项顺序为x4 > x3 > x5 > x1 > x2。因在偏回归系数方差分析检验中，一次项只有x4未达到显著或极显著水平，而二次项中只有x4的系数达到极显著水平，故主效应因子的大小顺序为x5 > x2 > x3 > x1 > x4。即在本试验中，5种污染物共存的情况下，其对大型溞毒性影响的顺序依次为:镉离子 (x5) > 三唑磷 ( x2) > 氟虫腈 ( x3) > 毒死蜱 ( x1) > 铅离子 ( x4)。也就是说，5种成分复合污染物对大型溞的急性毒性效应中，镉离子的效应贡献值最大，铅离子的贡献值最小。已有研究发现，一般水生生物体内的铅主要以不溶性分子态积累在骨骼中[18]，这可能导致铅对水生生物的急性毒性效应不明显。此外，模型中各个单因子 (xj) 与y的关系均呈正相关，表明随5种污染物浓度的增加，复合污染物对大型溞的急性毒性也相应增大。
2.2.4.2 单因子效应分析为探讨单一因子对复合污染物毒性效应的影响，采用“降维法”将其他4个变量固定取0水平，代入模型 (2)，观察该自变量与毒性效应 (y) 的关系，据此导出5个一元降维偏回归模型，即回归模型 (3)。
| $\begin{array}{l}{y_1}{\rm{ = }}5.551\; 2 + 0.472\; 4{x_1}\left( {{\text{毒死蜱}}} \right)\\{y_2}{\rm{ = }}5.551\; 2 + 0.668\; 8{x_2}\left( {{\text{三唑磷}}} \right)\\{y_3}{\rm{ = }}5.551\; 2 + 0.632\; 9{x_3}\left( {{\text{氟虫腈}}} \right)\\{y_4}{\rm{ = }}5.551\; 2 + 0.511 \;8{x_4}^2\left( {{\text{铅离子}}} \right)\\{y_5}{\rm{ = }}5.551\; 2 + 2.416\; 2{x_5}\left( {{\text{镉离子}}} \right)\end{array}$ | (3) |
图1为以5种污染物的单因子效应为横坐标、编码值为纵坐标的单因子效应分析图。从中可见，除y4外，其余4项因子的编码水平值跟毒性效应值均呈线性相关，即随着编码水平值 (污染物浓度) 的增大，毒性效应也随之增大。其中y5的斜率最大，y2和y3基本一致，y1斜率最小。复合污染物中，y4为上开口的抛物线，其最小值为编码水平值0，即浓度值为EC25值，说明y4对毒性效应的贡献较少。y5 (镉离子) 对毒性效应的贡献值最大，其次是y2 (三唑磷)、y3 (氟虫腈)、y1 (毒死蜱) 和y4 (铅离子)。此分析结果和主因子效应分析结果相吻合。
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图 1 单因子效应分析 Fig. 1 Single factor effect analysis |
2.2.4.3 多因子交互作用分析
通过对模型 (2) 的分析发现，x1和x5的互作达到极显著水平(表4)，表明农药和重金属对大型溞的联合毒性并非各因子单独效应的简单相加，同时还存在着各因子之间的互作效应。将模型 (2) 中其他3个因子固定在0水平，即得到2个因子在0水平上的互作效应回归子模型 (4)。
| $y{\rm{ = }}5.551\; 2 + 0.472\; 4{x_1} + 2.416 \;2{x_5}{\rm{ - }}1.051\; 8{x_1}{x_5}$ | (4) |
在试验范围内，除去效应值小于3和大于10 (死亡率不到0%或超过100%) 的数，其毒性效应的最大值为9.728 1，接近100%死亡率，此时x5的编码值为1.5，x1的编码值为 –0.5，即低浓度 (2.29 μg/L) 的毒死蜱和高浓度 (2 682.25 μg/L) 的镉离子共存时毒性增大。横向看表4，当x1水平固定时，随着x5编码值的增大 (污染物浓度增加)，毒性效应逐渐增大，尤其在x1为低浓度水平时增大效应格外突出。
对其他多因子交互作用的分析表明，两两互作时毒性效应最大值即两因子编码水平为2时，无论横向还是竖向排列，毒性效应均随着编码值的增大 (即污染物浓度的增加) 而增大。由于互作效应未达到显著水平，因此无法确定各因素之间的作用是相加、协同还是增效，需要进一步验证。
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表 4 毒死蜱 (x1) 和镉离子 (x5) 的交互效应值 Table 4 The interaction between chlorpyrifos (x1) and Cd2+ (x5) |
2.2.4.4 模型的最优解
在步长为“1”的 –2≤xj≤2区间内进行优化模式计算机处理，得到本试验条件下农药及重金属对大型溞复合污染的理论协同效应最大值为18.3 μg/L，此时因子编码值为x1 = –2、x2 = 2、x3 = 2、x4 = –2、x5 = 2，根据公式xj × lg2 = lgNj–lgN0计算得各因子质量浓度分别为x1 (毒死蜱) 为0.81 μg/L、x2 (三唑磷) 为17.22 μg/L、x3 (氟虫腈) 为5.65 μg/L、x4 (铅离子) 为83.75 μg/L及x5 (镉离子) 为3 793.15 μg/L，即在此条件下复合污染物毒性的理论协同效应最大。
根据上述模型，预测并统计大型溞受复合污染物影响时，抑制率大于50% (即几率值 > 5.0) 的2 156个因子编码方案，各方案中不同因子的频率分布如 表5所示。结果表明，铅离子在低浓度 (即编码值小于0) 时，随着其浓度增加，对大型溞的抑制率反而下降，而其他4种化合物随浓度增加对大型溞的抑制率均呈线性上升。表明当有其他4种污染物共存时，在一定浓度水平内，铅离子对大型溞的行为反而有一定的促进作用。
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表 5 2 156个方案中各变量取值的频率分布 Table 5 Factors frequency distributing of 2 156 schemes |
3 结论
急性毒性试验结果表明，当污染物在水中单独存在时，毒死蜱、三唑磷和氟虫腈对大型溞的48 h-EC50值均小于10 μg/L，属于剧毒类污染物；而铅离子对大型溞具有高等毒性效应 (48 h-EC50值为454.91 μg/L)，镉离子的毒性属于中等 (48 h-EC50值为1 175.74 μg/L)。当多种污染物共存时，镉离子浓度对5种污染物的复合毒性效应影响最大；在一定浓度范围内，铅离子对大型溞反而表现出一定的刺激作用。
对回归模型进行失拟性F检验和回归方程显著性分析，结果显示，所采用的二次数学模型与实际情况拟合度较好，可对方程做进一步的解析。5种污染物共存时，对大型溞毒性影响的顺序依次为：镉离子 > 三唑磷 > 氟虫腈 > 毒死蜱 > 铅离子。依据优化后的方程计算可得：水溶液中毒死蜱为0.81 μg/L、三唑磷为17.22 μg/L、氟虫腈为5.65 μg/L、铅离子为83.75 μg/L及镉离子为3 793.15 μg/L时，复合污染物毒性的理论协同效应最大。其中，毒死蜱和镉离子的互作效应极显著，但其他污染物间的互作效应未达到显著水平。试验结果显示：多因素多水平二次通用旋转组合设计试验所得回归方程可用于初步评价多种污染物共存时对大型溞的协同作用；对已知浓度的多种污染物，利用回归方程可快速评价复合污染物对大型溞存在的协同风险。
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