农药学学报  2017, Vol. 19 Issue (6): 708-715   PDF    
胶孢炭疽菌生防放线菌gz-8的鉴定及生物活性初步评价
张凯, 吴曼莉, 辜柳霜, 郑钧月, 柳志强, 李晓宇     
海南大学 热带农林学院,海口 570228
摘要: 从山东省临沂地区土壤中分离到一株放线菌gz-8,发现其对胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides具有较强的抑制作用,皿内抑菌活性达72.5%。通过形态特征和生理生化测定,结合16S rDNA序列分析,鉴定该菌株为栗褐链霉菌Streptomyces badius。抗菌谱测定结果表明,菌株gz-8对6种植物病原真菌均具有较强的抑菌活性,抗菌谱较广。进一步对菌株gz-8的粗提物进行了生物活性评价,发现其发酵液粗提物可以明显抑制胶孢炭疽菌的菌丝生长(EC50=3.18 μg/mL)和分生孢子萌发(IC50=1.92 μg/mL),且活性明显高于菌体粗提物;同时发酵液粗提物具有良好的热稳定性及pH稳定性;1 000 mg/L的发酵液粗提物对感染胶孢炭疽病芒果果实的防效达到35.94%,与同浓度下百菌清的防效(34.11%)无显著差异。
关键词: 胶孢炭疽菌     放线菌     栗褐链霉菌     炭疽病     菌株鉴定     生物防治    
Identification and preliminary evaluation of a biocontrol actinomycete strain gz-8 against Colletotrichum gloeosporioides
ZHANG Kai, WU Manli, GU Liushuang, ZHENG Junyue, LIU Zhiqiang, LI Xiaoyu     
Institute of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou 570228, China
Abstract: An actinomycete strain gz-8 was isolated from Linyi, Shandong Province, which had a strong antagonistic effect against Colletotrichum gloeosporioides with the inhibition rate of 72.5%. Strain gz-8 was identified as Streptomyces badius based on the morphology, physiological and biochemical characteristics, combined with 16S rDNA sequence analysis. Strain gz-8 has a broad antifungal spectrum, with strong inhibitory effects on six plant pathogenic fungi. The inhibitory activity of the crude extract from strain gz-8 was evaluated. The fermentation broth extract exhibits obvious inhibitory effects on the mycelial growth (EC50=3.18 μg/mL) and conidial germination (IC50=1.92 μg/mL) of C. gloeosporioides, which had higher activity compared to the mycelium extract of strain gz-8. The fermentation broth extract had good thermostability and pH stability. The control effect of 1 000 mg/L fermentation broth extract to mango fruits infected with C. gloeosporioides was 35.94%, which had no significant difference with that of chlorothalonil at the same concentration(34.11%).
Key words: Colletotrichum gloeosporioides      anthracnose      actinomycete strain      Streptomyces badius      strain identification      biological control     

胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides是热带、亚热带经济作物的重要病原菌之一,其寄主范围广且种内变异多,可以侵染多种作物并引起炭疽病。已报道的主要寄主植物有橡胶、可可、芒果、木瓜、荔枝和番石榴等经济作物,一些花卉和观赏植物也严重受害,给农业生产带来了较大的经济损失[1-2]。目前,生产上对胶孢炭疽病的防治主要依靠化学防治,常用的药剂有多菌灵和百菌清等[3-4]

近年来,随着社会对食品和环境中化学农药安全性的普遍关注,导致一些危害性的化学农药被禁用,还有一些化学农药因长期大量被使用或滥用,致使炭疽病菌对其产生了抗药性,导致防治效果逐渐降低,这就使得开发安全有效的植物病害防治措施日益受到重视。链霉菌属可以产生许多具有生物活性的次级代谢产物,在植物病害生物防治过程中起到了至关重要的作用。例如:Taechowisan等从姜根内分离到一株生金链霉菌Streptomyces aureofaciens CMUAc130,其对香蕉炭疽病菌具有很强的抑制作用[5];张晓媛等试验发现白浅灰链霉菌S. albogriseolus 对胶孢炭疽病菌的抑制作用达96.31%[6]。利用放线菌产生的次级代谢产物制备的微生物农药,因具有无污染、不易使有害生物产生抗药性等特点,已成为无公害农药的主体和未来农药的发展方向[7-8]。本研究从山东省临沂地区土壤中分离到一株放线菌,命名为gz-8。初筛发现其对胶孢炭疽菌C. gloeosporioides 具有较强的抑制活性,通过形态特征、生理生化测定,结合16S rDNA序列分析对该菌株进行了鉴定,并对其粗提物的抗菌活性进行了评价。现将结果报道如下。

1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 菌株

菌株gz-8分离自山东省临沂市山区中采集的土壤。供试病原真菌:胶孢炭疽菌C. gloeosporioides、香蕉炭疽病菌C. musae、芒果蒂腐病菌Botryodiplodia theobromae、香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum sp. Cubense、火龙果溃疡病菌Neoscytalidium dimidiatum和油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum,均由海南大学热带农林学院提供。

供试农药:75%百菌清 (chlorothalonil) 可湿性粉剂 (清远市顾地丰生物科技有限公司)。

供试芒果品种:香芒Mangifera indica L.。

1.1.2 培养基

PDA培养基:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂粉18 g,蒸馏水1 000 mL,用于病菌的培养和抑菌活性测定。PDB培养基:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,蒸馏水1 000 mL,用于菌株gz-8的发酵。明胶液化培养基、牛奶凝固胨化培养基、柴斯纳 (Tresner) 琼脂培养基、酪氨酸琼脂培养基、淀粉水解琼脂培养基、纤维素水解培养基和硝酸盐还原培养基,用于生理生化测定。高氏一号琼脂培养基、察氏培养基、葡萄糖天门冬素琼脂培养基、伊莫松培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基、苹果酸钙琼脂培养基、胰蛋白胨琼脂培养基 (ISP2)、甘油天门冬素琼脂培养基 (ISP3)、L-酪氨酸琼脂培养基 (ISP4) 和燕麦琼脂培养基 (ISP5),用于菌株培养特征观察,各培养基的配方参见文献[9-10]。

1.2 试验方法 1.2.1 菌株的筛选

称取10 g待分离土样,加入90 mL已灭菌的无菌水,分别稀释到10–3、10–4和10–5 3个梯度,每个梯度吸取200 μL涂布于高氏一号培养基。重复3次。于28 ℃培养7 d后,挑取单菌落于PDA培养基划线培养,再于28 ℃培养7 d后,以胶孢炭疽菌为受试菌,采用平板对峙法[11]进行初筛,按公式 (1) 计算菌丝生长抑制率。

$\begin{split}&{\text{菌丝生长抑制率}}/{\%} = [({\text{对照菌落直径}}- {\text{处理}}\\&{\text{菌落直径}})/ ({\text{对照菌落直径}} - 5)] \times 100\end{split}$ (1)
1.2.2 菌株gz-8分类鉴定

采用插片培养方法[9-10],将gz-8菌株接种于高氏一号培养基,于28 ℃下培养7~15 d,显微镜下观察菌丝和孢子的形态特征。将菌株gz-8分别接种到上述用于特征观察的培养基中,于28 ℃下培养7~15 d,观察其生长特征、菌丝颜色以及有无可溶性色素产生等。

参照链霉菌鉴定手册[12]测定淀粉水解、纤维素水解、明胶液化、牛奶胨化、硝酸盐还原及硫化氢、黑色素产生等生理生化指标。

利用OMEGA D3350-01Bacterial DNA Kit试剂盒进行菌株基因组DNA提取,利用16S rDNA通用引物 (Primer1:5′-AGAGTTTGATCA TGGCTCAG-3′,Primer2:5′-TAGGGTTACCTT GTTACGACTT-3′) 进行基因扩增,PCR反应程序为:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性 30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸 60 s,30个循环;72 ℃延伸 8 min。扩增片段由上海英骏生物技术有限公司进行序列测定,将所测序列在GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov) 中进行Blast分析,用Clustal X (1.83) 软件进行多序列比对 (Multiple alignments),利用MEGA 5.0软件以邻近相接法 (Neighbor-joining,NJ) 构建系统进化树。

1.2.3 gz-8发酵液的制备

用接种环挑取单菌落于高氏一号培养基中进行活化培养,7 d后接种于10 mL PDB培养基中,于28 ℃、180 r/min下培养2 d,按照体积分数为10%的接种量将活化后的菌液接种于 200 mL PDB培养基中,于28 ℃、180 r/min下扩增培养6 d。再在6 000 r/min下离心7 min,分别得到发酵液和菌体,备用。

1.2.4 粗提物的制备

发酵液粗提物:将1.2.3节所得发酵液用D101大孔树脂吸附[13],分别用甲醇、乙醇、丙酮解吸附,蒸发浓缩[14]后,备用。

菌体粗提物:将1.2.3节所得菌体用95%的乙醇浸泡24 h,于180 r/min下离心,用乙酸乙酯萃取,蒸发浓缩后备用。

1.2.5 粗提物抑菌活性测定 1.2.5.1 菌丝生长速率法

将发酵液或菌体粗提物分别用丙酮溶解,制成含发酵液或菌体终浓度为0.78、1.56、3.12、6.25、12.50、25.00、50.00和100.00 μg/mL的PDA平板。以加丙酮的PDA培养基平板为对照。将6种供试植物病原真菌菌饼 (Φ=5 mm) 置于平板中央,于28 ℃下培养3~7 d,用十字交叉法测量菌落生长直径,按 (1) 式计算菌丝生长抑制率[15-16]。试验重复3次。利用软件SPSS19.0计算其EC50值。

1.2.5.2 孢子萌发法

用10 mL含体积分数为0.2%的吐温-80的无菌水将培养好的胶孢炭疽病病菌孢子从培养基上洗脱,用多层纱布过滤以除去病菌菌丝,用血球计数板计数,将孢子浓度调整至1.0 × 104个/mL,得到孢子悬浮液。以孢子悬浮液将粗提物稀释成浓度梯度,以丙酮为空白对照,置于28 ℃培养箱中,4 h后检查萌发率,凡孢子的芽管超过孢子短直径一半时判定为萌发孢子。根据 (2) 和 (3) 式计算孢子萌发抑制率[17]。利用软件SPSS19.0计算其IC50值。

$\begin{split}\!\!{\text{孢子萌发率}}/{\%} \!=\! ({\text{孢子萌发数}/\text{检查孢子数}} )\! \times \!100\end{split}$ (2)
$\begin{split}&\!\! {\text{孢子萌发抑制率}}/{\%} = [(\text{对照孢子萌发率} \!-\! \text{处理孢} \\ & \!\! \text{子萌发率})/ (\text{对照孢子萌发率} )] \times 100\end{split}$ (3)
1.2.6 粗提物热稳定性和pH稳定性测定

分别将发酵液粗提物和菌体粗提物置于50、60、70、80、90、100和110 ℃下处理1 h,利用菌丝生长速率法测定pH=7时温度对其抑菌活性的影响;分别将发酵液粗提物和菌体粗提物置于pH为2~12的缓冲液中处理1 h,利用菌丝生长速率法测定25 ℃时pH值对其抑菌活性的影响。

1.2.7 gz-8粗提物对芒果胶孢炭疽病的防效测定

参照文献[18]进行。选用7~8成熟的芒果果实用无菌水清洗干净,室内阴干,用75%的乙醇擦拭表面后,用束针刺伤果皮,每个芒果刺8个点。分别用灭菌脱脂棉蘸取1 000 mg/L的发酵液粗提物和有效成分1 000 mg/L的百菌清药液 (无菌水溶解) 涂抹芒果表面,室内阴干。重复3次。以无菌水处理芒果果实作为对照。在刺伤处接种直径为 5 mm的胶孢炭疽菌菌饼,室温保湿培养,分别按公式 (4) 和 (5) 统计病情指数及病情控制效果。

$\begin{split}\text{病情指数} =& \left[ {\sum {\left({\text{病级斑点数} \times \text{该病级值}} \right)} } \right]/ \\ &\left({\text{接种点数} \times \text{最高级值}} \right) \times 100\end{split}$ (4)
$\begin{split}&{\text{病情控制效果}}/{\%} = [ ({\text{对照组病情指数}} - {\text{处理组}}\\ &{\text{病情指数}} )/{\text{对照组病情指数} }] \times 100\end{split}$ (5)

病斑分级标准[18]:0级,刺伤点感病,未连成片;1级,病斑连成片,病斑直径在5 mm以下;2级,病斑直径在5~7 mm;3级,病斑直径在7~10 mm;4级,病斑直径在10~15 mm;5级,病斑直径在15 mm以上。

2 结果与分析 2.1 菌株的筛选

图1可以看出,菌株gz-8对胶孢炭疽菌具有较强的抑制作用,皿内抑制活性达72.5%。

A. 菌株gz-8的拮抗作用;B. 胶孢炭疽菌对照。A. The antagonistic effect of strain gz-8; B. The control of C. gloeosporioides 图 1 菌株gz-8对胶孢炭疽菌的抑制作用 Fig. 1 The inhibitory effect of strain gz-8 on C. gloeosporioides

2.2 菌株gz-8的分类鉴定

将菌株gz-8接种到高氏一号琼脂培养基上插片培养,显微观察发现:其基内菌丝和气生菌丝丰富,基内菌丝呈黄褐色、无横隔;气生菌丝多分枝,呈灰色,菌丝体形成孢子链,孢子呈现卵圆形,成串生长,孢子丝较直。将菌株gz-8接种到12种不同的培养基中,培养特性各不相同,其气生菌丝以呈白色为主,基内菌丝以呈浅黄色和褐色为主。生长状况良好,并有着不同的菌落生长特征,结果见表1

表 1 放线菌gz-8菌株在不同培养基中培养的特征 Table 1 Culture characteristics of strain gz-8 in different media

菌株生理生化特征试验结果 (表2) 表明:菌株gz-8能利用葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖及阿拉伯糖等8种碳源,不能利用棉籽糖、肌醇和蔗糖3种碳源,能使牛奶凝固胨化,淀粉水解,硝酸盐水解;但不能使明胶液化,不能产生硫化氢,不产生色素,不能水解利用纤维素。

表 2 菌株gz-8的生理生化特征 Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain gz-8

通过PCR扩增获得了菌株gz-8的16S rDNA序列,测序得到1 490 bp的序列,将该序列在GenBank上进行Blast比对,选取与其同源性较高的菌株,进行系统发育树分析,结果见图2。发现菌株gz-8与栗褐链霉菌Streptomyces badius(KX502939) 构成一个分支,相似度在99%以上。结合形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果,将菌株gz-8鉴定为栗褐链霉菌S. badius

图 2 基于16S rDNA序列的菌株gz-8系统进化树 Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain gz-8

2.3 粗提物抑菌活性评价

测定结果 (表3) 表明,发酵液粗提物在25μg/mL下对6种病原真菌具有较强的抑菌活性,且明显高于菌体粗提物的活性。

表 3 菌株gz-8粗提物在25 μg/mL下对6种供试植物病原真菌的抑制作用 Table 3 Inhibitory effects of the strain gz-8 crude extract on six plant pathogenic fungi at 25 μg/mL

菌株gz-8发酵液和菌体粗提物经丙酮溶解,配制成一定梯度浓度的PDA平板,分别通过生长速率法测量并用软件SPSS19.0计算得其EC50值为分别3.18和13.82 μg/mL。同时测定了菌株gz-8粗提物对胶孢炭疽菌孢子萌发的作用,结果发现:粗提物对孢子萌发具有较强的抑制活性,发酵液粗提物的IC50为1.92 μg/mL,菌体粗提物的IC50为10.01 μg/mL。

2.4 热稳定性

不同温度下,菌株gz-8粗提物和菌体粗提物对胶孢炭疽菌抑菌活性见图3。由图3可以看出:当温度低于100 ℃时,发酵液粗提物和菌体粗提物对胶孢炭疽菌的抑制率均在40%以上,热稳定性较好;当温度达100 ℃以上时,发酵液粗提物的抑菌活性随温度的升高变化不大,而菌体粗提物的活性则变化较大,抑菌活性明显下降 (抑制率20%以下)。可见gz-8发酵液粗提物相对于菌体粗提物具有良好的热稳定性。

不同大小写字母分别表示在0.01和0.05水平上差异显著。
Different capital and small letters indicate significant difference at 0.01 and 0.05 levels.
图 3 gz-8粗提物的热稳定性(pH=7) Fig. 3 Thermal stability of the strain gz-8 crude extract at pH=7

2.5 pH稳定性

不同pH值下,菌株gz-8粗提物和菌体粗提物对胶孢炭疽菌抑菌活性见图4。由图4可以看出:当pH在2~8之间时,发酵液粗提物对胶孢炭疽菌的抑制率均在60%以上;当pH值在10~12之间时,发酵液粗提物的抑菌活性有所下降,但抑制率也在50%以上。而菌体粗提物在pH 2~12之间时,其抑制率均维持在50%以上,波动不大,说明二者均具有较好的pH稳定性。

不同大小写字母分别表示在0.01和0.05水平上差异显著。
Different capital and small letters indicate significant difference at 0.01 and 0.05 levels.
图 4 gz-8粗提物的pH稳定性(25 ℃) Fig. 4 pH stability of the strain gz-8 crude extract at 25 ℃

2.6 发酵液粗提物对芒果炭疽病的防效

利用菌株gz-8发酵液粗提物处理芒果果实,然后接种胶孢炭疽菌,室温保湿培养,5 d后统计病情指数,计算防治效果 (表4)。与对照组相比,菌株gz-8发酵液粗提物在1 000 mg/L施药剂量下能较好地控制芒果炭疽病的病情扩展,防效达35.94%,与同浓度下百菌清的防效 (34.11%) 无显著差异。

表 4 菌株gz-8发酵液粗提物对感病芒果果实的防效 Table 4 The control efficacy on infected mango fruits of fermentation broth extraction

3 讨论

胶孢炭疽菌可以侵染寄主植物的花、叶、嫩枝和果,严重时引起落花、落叶、落果和嫩枝回枯,造成严重的经济损失,目前针对胶孢炭疽菌的防治措施主要是化学防治,化学防治短时间即可见效,但存在农药残留、环境污染等问题,因此利用生物防治方法变得越来越重要[19-20]。Vivekananthan等从印度分离到一株荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens,对胶孢炭疽菌C. gloeosporioides的抑制率达到62.7%[21]。解娜等从 100 多株放线菌中筛选到10株对辣椒炭疽病菌抑制作用较强的放线菌,其中将华丽黄链霉菌S. flaveus的发酵液稀释10倍后,对辣椒炭疽病菌的抑制率达到了68.2%[22]。汪茜等从辣椒根际土壤中筛选到一株短芽孢杆菌Brevibacillus brevis,对柑橘炭疽病的防治效果明显,处理后 20 d的防效达64.9%[23]。焦敬华等筛选到一株紫黑链霉菌S. violaceoniger,对山药炭疽病菌、芒果炭疽病菌都表现出良好的抑菌活性[24]。本研究从土壤中分离得到一株放线菌gz-8,对胶孢炭疽菌具有较强的抑制作用,皿内抑菌活性达到72.5%。

通过对菌株gz-8的形态和培养特征观察、生理生化以及16S rDNA序列分析,确定菌株gz-8为栗褐链霉菌Streptomyces badius。目前国内外已有部分关于栗褐链霉菌的研究报道,如Elsayed等从埃及的土壤中分离到一株栗褐链霉菌,并从中得到化合物marilone C,该化合物对人乳腺癌细胞 (MCF-7) 和人肺癌细胞 (A549) 具有良好的细胞毒性[25]。陈淑琴等从马铃薯植株根际周围的土壤中分离到一株栗褐链霉菌DX23,通过平板对峙法测得该菌株对马铃薯炭疽病菌Phoma foveata的抑菌活性达到72.0%[26]

抗菌谱试验表明,菌株gz-8粗提物对6种病原真菌均具有较强的抑菌活性,抗菌谱较广,且发酵液粗提物的活性明显大于菌体粗提物。菌株gz-8粗提物对胶孢炭疽菌的菌丝生长和孢子萌发均具有较强的抑制作用,初步推测其粗提物的抑菌机理主要为抑制菌丝生长及分生孢子萌发。进一步研究发现,发酵液粗提物对菌丝生长的EC50值及对孢子萌发的IC50值均显著小于菌体粗提物,推测菌株gz-8的抗菌活性产物主要集中于发酵液里,或者发酵液中含有的活性产物较菌体内产物具有更好的抑菌活性。热稳定性试验发现,发酵液粗提物的热稳定性明显优于菌体粗提物,推测二者所含的活性物质不尽相同,发酵液所含活性物质对高温的耐受性更好。pH稳定性方面,发酵液粗提物和菌体粗体物对酸和碱的耐受性均较好,在过酸和过碱的环境中均还能维持较高的活性。芒果防效试验发现,1 000 mg/L发酵液粗提物对芒果感炭疽病的防效达到35.94%,与同浓度百菌清的防效无显著差异,在炭疽病的生物防治方面具有一定的应用前景。本研究为下一步分离、纯化及鉴定菌株gz-8的抗菌活性产物,深入挖掘其抑菌机理奠定了良好的基础。

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