2017, Vol. 19
2. 湖南师范大学附属中学，长沙 410006;
3. 湖南人文科技学院，湖南 娄底 417000
2. The High School Attached to Hunan Normal University, Changsha 410006, Hunan Province, China;
3. Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, Hunan Province, China
乙基多杀菌素 (spinetoram) 是由美国陶氏益农公司研发的一种新型多杀菌素[1]，原药的有效成分为乙基多杀菌素-J (代号为XDE-175-J) 和乙基多杀菌素-L (代号为XDE-175-L) 的混合物 (结构式见图式 1)。乙基多杀菌素具有胃毒和触杀作用，主要用于防治鳞翅目害虫 (小菜蛾、甜菜夜蛾) 及缨翅目害虫 (蓟马) 等，在中国该药已在甘蓝、黄瓜、茄子、水稻、杨梅和豇豆上获准登记使用，并已制定了稻谷、糙米、结球甘蓝、茄子、豇豆上的临时最大残留限量[2]，其中稻谷为 0.5 mg/kg，糙米为0.2 mg/kg。
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图式 1 |
根据农药残留联席会议 (JMPR) 报告报道[3]，乙基多杀菌素的膳食风险评估残留定义为乙基多杀菌素-J、乙基多杀菌素-L及其主要代谢物N-demethyl-175-J和N-formyl-175-J (代谢物折算后以乙基多杀菌素母体表示，其结构见图式 1)；乙基多杀菌素的监测评估残留定义为乙基多杀菌素母体。
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图式 2 乙基多杀菌素及其主要代谢物结构式 Scheme2 Structural formula of spinetoram’s major metabolites |
在JMPR报告中，植物源样品中的乙基多杀菌素采用乙腈和水的混合溶液提取，C18固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 检测，内标法定量[3]。目前，关于乙基多杀菌素在环境中的残留分析方法主要有液相色谱法[4-7]和LC-MS/MS法[8-9]，但这些分析方法均只是检测了乙基多杀菌素母体，未见有关其代谢物的残留分析报道。鉴于此，本研究采用LC-MS/MS分析方法，同时检测水稻样品中乙基多杀菌素及其代谢物残留情况，旨在为中国制定乙基多杀菌素在谷物类作物中的MRL值提供分析方法，也为进一步探究乙基多杀菌素及其代谢物对非靶标生物的毒性效应提供参考。
1 材料与方法 1.1 主要仪器Agilent1290-6460高效液相色谱-三重四极杆质谱仪 (LC-MS /MS) (美国安捷伦公司) ；Agilent SB-C18色谱柱 (50 mm × 2.1 mm，1.8 μm，美国Agilent公司)；AL204型电子天平 (瑞士梅特勒·托利多仪器有限公司)；Sartorius BL310型电子天平 (德国赛多利斯公司)；HY-B1型回旋振荡器 (江苏省金坛市医疗仪器厂)；VORTEX-5涡旋仪 (海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；ZONKIA SC-3614 低速离心机 (安徽中科中佳科学仪器有限公司)。
1.2 药剂与试剂40%氟啶虫胺腈·乙基多杀菌素水分散粒剂、96.7%的乙基多杀菌素 (spinetoram) 标准品 (其中乙基多杀菌素-J 76.7%和乙基多杀菌素-L 20%)、98%的N-Formyl-175-J标准品和99%的N-Demethyl-175-J标准品，均由陶氏益农农业科技 (中国) 有限公司提供；甲酸为质谱纯，德国CNW公司；甲醇和乙腈为色谱纯，美国Honeywell公司；无水硫酸镁为分析纯，西陇化工股份有限公司；N-丙基乙二胺 (PSA)，美国Welch Materials公司。
1.3 样品提取与净化称取适量待测样品 (糙米5 g、谷壳5 g、植株5 g) 于 150 mL具塞三角瓶中，准确加入 40 mL乙腈，振荡 30 min，静置 5 min；取上清液2 mL，转入加有 0.1 g PSA和 1.0 g无水硫酸镁的离心管中，涡旋 1 min，于 4 000 r/min下离心 5 min；取上清液，过 0.22 μm有机膜，LC-MS/MS待检测。
1.4 仪器分析条件色谱条件：流动相为0.1%甲酸乙腈溶液 (A) 和0.1%甲酸水溶液 (B)，流速0.3 mL/min；梯度洗脱程序：在第4 min时由体积分数30%的A直接增加至90%的A，保持2 min，在6.01 min时由90%的A回落至30%的A，保持3 min。柱温35 ℃；进样量5 μL。
质谱条件：多重反应监测 (MRM) 模式扫描，电喷雾正离子源 (ESI+)，离子喷雾电压3 500 V，雾化气压力103 kPa，干燥气温度300 ℃，干燥气流速6 L/min。
1.5 标准溶液配制及标准工作曲线绘制将乙基多杀菌素及其代谢物分别溶解于甲醇中，配制成 500 mg/L的各种母液，再分别移取各种母液1 mL至50 mL容量瓶中，用甲醇定容，配成10 mg/L的混合标准溶液，然后用甲醇稀释成 1、5、10、50、100、500 μg/L的系列混合标准工作溶液，按1.4 节的条件测定。以进样质量浓度为 x 轴、响应值为 y 轴绘制标准工作曲线，外标法定量。
1.6 添加回收试验向水稻植株、糙米及稻壳空白样品中分别添加 0.02、0.2 和 2.0 mg/kg的乙基多杀菌素及其代谢物混合标准工作溶液 (其中，乙基多杀菌素标准品中乙基多杀菌素-J占76.7%、乙基多杀菌素-L占20%，若按照质量比4:1计算，则当乙基多杀菌素添加水平为0.02、0.2 和 2.0 mg/kg时，相当于乙基多杀菌素-J的添加水平为0.016、0.16和1.6 mg/kg，乙基多杀菌素-L的添加水平为0.004、0.04和0.4 mg/kg)，采用所建立的方法测定其添加回收率及相对标准偏差 (RSD)。每个添加水平重复 5 次，同时设空白对照。
1.7 实际样品检测及残留量的计算运用本研究中建立的LC-MS/MS分析方法，对从大田试验中采集的水稻植株、糙米、稻壳样品中的乙基多杀菌素-J、乙基多杀菌素-L及乙基多杀菌素代谢物的残留量进行检测。稻谷残留量数据根据糙米和谷壳质量比折算，其中糙米以77.6%计算，谷壳以22.4%计算，再将两者相加即为稻谷残留量。
首先分别对代谢物N-demethyl-175-J和N-formyl-175-J、母体乙基多杀菌素-J和乙基多杀菌素-L进行定量，计算残留值，然后根据代谢物N-demethyl-175-J和N-formyl-175-J与母体乙基多杀菌素-J的相对分子质量的比 (分别为1.019和0.981)，得出代谢物折算为母体的折算系数分别为0.981和1.019，最后以折算值和母体值之和表示为乙基多杀菌素残留量。
2 结果与分析 2.1 质谱条件的确定分别取1 mL 10 mg/L的乙基多杀菌素、N-formyl-175-J和N-demethyl-175-J标准工作液，在正离子模式下进行母离子全扫描，得到乙基多杀菌素-J母离子[M+H]+ (m/z 748.4) (图1A) 和乙基多杀菌素-L母离子[M+H]+ (m/z 760.4) (图1B)，以及N-formyl-175-J母离子[M+H]+ (m/z 762.5) (图1C) 和N-demethyl-175-J母离子[M+H]+ (m/z 734.5) (图1D)。对上述母离子施加不同的碰撞能量，对产生的子离子进行全扫描，得到相对丰度较高的乙基多杀菌素-J子离子[C8H16NO]+ (m/z 142.0) 和[C10H19O4]+ (m/z203.0) (图1E)，乙基多杀菌素-L子离子[C8H16NO]+ (m/z142.0) 和[C10H19O4]+ (m/z 203.1) (图1F)，以及N-formyl-175-J子离子[C8H14NO2]+ (m/z 156.1) (图1G) 和N-demethyl-175-J子离子[C7H14NO]+ (m/z 128.1) (图1H)，具体质谱检测参数见表1。
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表 1 质谱多重反应监测参数 Table 1 The parameters of multi-reaction monitoring mode |
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A. 乙基多杀菌素-J的母离子；B. 乙基多杀菌素-L的母离子；C. N-formyl-175-J的母离子；D. N-demethyl-175-J的母离子；E. 乙基多杀菌素-J的子离子；F. 乙基多杀菌素-L的子离子；G. N-formyl-175-J的子离子；H. N-demethyl-175-J的子离子 A. precursor ion of spinetoram-J; B. precursor ion of spinetoram-L; C. precursor ion of N-formyl-175-J; D. precursor ion of N-demethyl-175-J; E. product ion of spinetoram-J; F. product ion of spinetoram-L; G. product ion of N-formyl-175-J; H. product ion of N-demethyl-175-J. 图 1 乙基多杀菌素及代谢物的母离子和子离子全扫描质谱图 Fig. 1 Full scan MS spectra of precursor ions and product ions of spinetoram and its metabolites |
2.2 吸附剂的优化
分别考察了不同质量的PSA对净化效果和回收率的影响。结果 (图2) 表明：选用50、100和200 mg PSA，糙米、植株和谷壳 3 种基质中乙基多杀菌素及代谢物的回收率分别为66%~86%、74%~100%和63%~80%。本研究最终选用100 mg PSA。鉴于3种基质中乙基多杀菌素及代谢物均满足农药残留检测的要求[10]，因此未进一步研究基质效应的影响。
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1. N-demethyl-175-J；2. 乙基多杀菌素-J(spinetoram-J)；3. 乙基多杀菌素-L(spinetoram-L)；4.N-formyl-175-J 图 2 不同质量吸附剂PSA对净化效果的影响 Fig. 2 Influence of adsorbent in samples |
2.2 方法的线性范围与检出限
在1~500 μg/L范围内，乙基多杀菌素及其代谢物的进样质量浓度 (x) 与色谱峰面积 (y) 间线性关系良好，决定系数 (R2) 在 0.999 1~0.999 8 之间 (表2)，乙基多杀菌素-J和-L在检测样品中的LOQ分别0.016和0.004 mg/kg，代谢物的定量限 (LOQ) 均为 0.02 mg/kg。
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表 2 乙基多杀菌素及代谢物的标准曲线方程和决定系数 (线性范围 1~500 μg/L) Table 2 The standard curve and coefficient of determination of spinetoram and its metabolites at the concentrations ranged from 1 to 500 μg/L |
2.3 添加回收试验结果
结果 (表3) 显示：乙基多杀菌素-J在 0.016、0.16 和 1.6 mg/kg、乙基多杀菌素-L在 0.004、0.04 和 0.4 mg/kg、代谢物在0.02、0.2 和 2.0 mg/kg添加水平下，水稻植株、谷壳、糙米中乙基多杀菌素及代谢物的回收率在73%~105% 之间，相对标准偏差 (RSD) 在0.9%~10% 之间。表明方法的精密度和准确度均较好，符合农药残留分析的要求[12]。植株添加的典型色谱图见图3~图5。
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表 3 乙基多杀菌素及其代谢物在水稻样品中的添加回收率和相对标准偏差 (n = 5) Table 3 Recoveries and relative standard deviations of spinetoram and its metabolites in rice samples at different spiked levels (n = 5) |
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图 3 乙基多杀菌素及代谢物标准溶液 (0.1 mg/L) 的MRM质谱图 Fig. 3 Multiple reaction monitoring (MRM) chromatograms of standard solutions of spinetoram and its metabolites (0.1 mg/L). |
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图 4 植株空白样品的MRM质谱图 Fig. 4 Multiple reaction monitoring (MRM) chromatograms of the blank sample of rice plant |
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图 5 植株添加 (2 mg/kg) 样品的MRM质谱图 Fig. 5 Multiple reaction monitoring (MRM) chromatograms of spiked sample of rice plant(2 mg/kg) |
2.4 乙基多杀菌素及其代谢物在水稻样品中的残留量
依据NY/T 788《农药残留试验准则》[10]和《农药登记残留田间试验标准操作规程》[11]，分别以制剂量300 g/hm2 (有效成分120 g/hm2) 和制剂量450 g/hm2 (有效成分180 g/hm2) 各施药1次和2次，施药间隔7 d，于最后一次施药后14、21 d采样，测定其在水稻植株、谷壳和糙米中的最终残留量，根据糙米和稻壳中的残留量计算稻谷中的残留量，结果见表4。
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表 4 乙基多杀菌素及其代谢物在水稻样品中的残留量 Table 4 Residues of spinetoram and its metabolites in rice samples |
3 结论
运用分散固相净化-液相色谱-串联质谱技术，建立了水稻植株、谷壳和糙米中同时检测乙基多杀菌素及其代谢物残留量的分析方法。样品用乙腈提取，经PSA净化，LC-MS/MS检测。在 0.02~2 mg/kg添加水平下，乙基多杀菌素及其代谢物残留量在水稻样品中的平均回收率在 73%~105%之间，相对标准偏差在 0.9%~10%之间。该方法快速、简便、灵敏、高效，可满足农药残留分析的要求，同时实现了代谢物N-demethyl-175-J和N-formyl-175-J的定性与定量分析。
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