2. 山东泰田新药研发有限公司,济南 250062
2. Shandong Taitian New Drug Development Co., Ltd., Ji’nan 250062, China
三嗪类除草剂又被称作均三氮苯类除草剂,是预防农田杂草生长的高效除草剂,在世界范围内被广泛使用[1]。此类农药可以扰乱人体内分泌,具有潜在的致癌性。目前,三嗪类除草剂在葡萄园中的施用量逐年加大,常用的有西玛津、莠去津、特丁津和扑草净 (图式 1) 等,该类除草剂多属于内吸性除草剂,可通过发酵进入葡萄酒。日本制定了葡萄中莠去津的最大允许残留限量 (MRL值) 为0.02 mg/kg,英国制定了酿酒葡萄或葡萄中莠去津的MRL值为0.05 mg/kg[2],中国尚未制定西玛津、莠去津、特丁津和扑草净在葡萄中的MRL值。
目前,三嗪类农药的检测方法主要有高效液相色谱-质谱法[3]、气相色谱-质谱法[4]和高效液相色谱法[1, 5]等。其中,常用的前处理方法有固相分散萃取[7]和固相萃取[8]等,但存在操作复杂、有毒有害的有机溶剂用量大等缺点,因此,开发简易、高效、灵敏、快捷、污染小的前处理方法十分必要。分散液-液微萃取技术是由Assadi等[9]提出的一种新型的微萃取技术,它具有操作简单、有毒有害溶剂用量少和富集倍数高等优点,已在液态奶中拟除虫菊酯农药残留[10]、葡萄酒中磺胺类除草剂[11]、邻苯二甲酸酯[12]、有机磷酸酯[13]、铜离子和铁离子[14]等分析过程中得以成功应用。
本研究以西玛津、莠去津、特丁津和扑草净4种典型的三嗪类除草剂为研究对象,采用改进的分散液-液微萃取技术,即凝固-漂浮分散液-液微萃取技术对样品进行前处理,选用密度比水小的低毒有机溶剂作为萃取剂,且其凝固点在室温附近,既降低了萃取剂的收集难度,又使操作更加简单。随后,与高效液相色谱联用分析检测,构建了葡萄酒中痕量三嗪类除草剂的分析方法,以期为检验监督葡萄酒安全提供技术保障,也为葡萄酒中农药残留国家标准的制定提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂
Agilent1260 Infinity液相色谱仪及工作站,配备真空脱气装置、二元泵、自动进样装置、柱温箱及DAD检测器 (美国安捷伦公司);80-2离心机 (上海浦东物理光学仪器厂);万分之一电子天平 (梅特勒-托利多仪器上海有限公司);雷磁PH计 (仪电科学仪器)。
西玛津 (simazine)、莠去津 (atrazine)、特丁津 (terbuthylazine) 和扑草净 (prometryn) 标准品 (纯度99%,阿拉丁试剂有限公司);甲醇 (色谱级),其余试剂均为市售分析纯,试验用水均为超纯水。
葡萄酒:1#(干白,pH=3.2)、2#(干白,pH=3.3)、3#(干红,pH=3.6)和4#(干白,pH=3.2),均购于济南某大型超市。
1.2 检测条件ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱 (4.6 mm × 10 cm,3.5 μm),流动相为 V(甲醇):V(水)=82:18,采用等度洗脱,流速0.4 mL/min,柱温30 ℃,检测器DAD,检测波长223 nm,进样量5 μL。
1.3 标准溶液和模拟酒样的配制标准储备液:准确称取4种三嗪类除草剂标准品各10.0 mg于50 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配成质量浓度为0.2 g/L的混合标准储备液,于4 ℃保存,备用。
模拟酒样:配制体积分数为12% 的乙醇溶液,加入适量酒石酸,调节pH为3.5。
1.4 分散液-液微萃取方法准确量取2.5 mL 含4种三嗪类除草剂质量浓度为0.4 mg/L的模拟酒样或葡萄酒于10 mL具塞尖底玻璃离心管中,加入2.5 mL超纯水,用1.25 g NaCl溶解后,用微量注射器注入2 μL 0.25 g/L的Tween-20溶液,加入20 μL十一醇,振荡使管内形成均匀的乳浊液,静置10 min;于3 500 r/min下离心15 min,十一醇在液面形成漂浮液珠,冰浴50 min,使液珠凝固;迅速取出凝固状十一醇,用80 μL甲醇复溶,过0.22 μm滤膜,待测。
2 结果与讨论本研究的关键是获得良好的萃取效率和高富集倍数,根据目标物色谱峰面积的大小来评价萃取效率的高低[15],即目标分析物的色谱峰面积越大,萃取效率越高。
乙醇对萃取效率有较大影响[16],基质pH值的差异也可能有一定影响。而葡萄酒中乙醇含量的变化范围在8%~16%之间,pH值在2.7~3.8之间,为了使优化试验与实际分析的条件尽量接近,本研究采用体积分数为12%的乙醇水溶液,用酒石酸调节pH值到3.5,模拟实际酒样[16-17]。
2.1 萃取剂种类及萃取体积、萃取时间的选择选择合适的萃取剂是提高萃取效率的关键。本研究选择密度比水小的萃取剂,离心分相后萃取剂漂浮于液面,分离比较困难,但如果使漂浮的萃取剂凝固,则萃取剂易于与水相分离[18]。因此考察了凝固点在室温附近的正癸醇 (m.p. 6 ℃)、十一醇 (m.p. 11 ℃)、十二醇 (m.p. 24 ℃) 和正十六烷 (m.p. 18 ℃) 的萃取特性。结果发现:正癸醇因凝固点偏低,冰浴后分离取出时易熔化损失;正十六烷疏水性太强,萃取过程中不易形成乳浊液,并且离心及冰浴后呈片状漂浮在液面,取出时难度大,易损失;十二醇则存在色谱行为差,杂峰较多,且萃取效率比十一醇低。因此最终选择十一醇作为萃取剂。
在以2 μL质量浓度为0.25 g/L的Tween-20水溶液作为分散剂条件下,分别考察了10、15、20、25、30和40 μL十一醇对西玛津、莠去津、特丁津和扑草净萃取效率的影响。结果 (图1) 表明:4种目标分析物的色谱峰面积随十一醇体积的增加而增加,当其体积达到20 μL时,西玛津、莠去津、特丁津和扑草净的色谱峰面积均达到最大值,即萃取效率达到最大值。之后随其体积增大而降低。其原因是萃取剂体积较小时分析物难以完全进入有机相,体积过大又降低了有机相中目标分析物的浓度[17]。
试验中通过改变静置时间 (0、5、10、15、20 min),考察了萃取时间对目标分析物萃取效率的影响。结果 (图2) 表明:萃取时间为10 min时,西玛津、莠去津、特丁津和扑草净的萃取效率最高。因此选定萃取时间为10 min。
综上所述,最终选择十一醇作为萃取剂,萃取体积为20 μL,萃取时间为 10 min。
2.2 分散剂种类及用量的选择在分散液-液微萃取中,能使萃取剂和水溶液样品较好地混合,是选择分散剂的重要因素[19]。结果表明:Tween-20和SDS的水溶液均可使十一醇和葡萄酒样充分互溶,可用作分散剂。Tween-20的黏度较大,取一定量时误差较大,而十二烷基硫酸钠为固体,取样量过小时误差也较大,故先将Tween-20和SDS分别配成0.25 g/L的水溶液。分别考察了0、1、2、3和5 μL质量浓度为0.25 /L的Tween-20和SDS对萃取效率的影响。结果显示:两者均在质量浓度为0.25 g/L、用量为 2 μL的条件下,萃取效率最高,但Tween-20的萃取效率要比SDS的高。综合考虑,最终选择以2 μL质量浓度为0.25 g/L的Tween-20作为分散剂 (图3)。
2.3 盐浓度对萃取效率的影响
在分散液-液微萃取试验体系中适当增加溶液离子强度,可降低待分析物在溶液中的溶解度,提高分配系数,增强待分析物的响应值[20]。本研究通过调节样品溶液中NaCl的质量浓度来考察离子强度对西玛津、莠去津、特丁津和扑草净萃取效率的影响。结果 (图4) 显示:NaCl的质量浓度在0~280 g/L范围内4种除草剂的萃取效率均随NaCl质量浓度的增大而提高;但当NaCl的质量浓度达到280 g/L时,有盐析出,试验误差大。综合考虑,确定NaCl的最佳质量浓度为250 g/L。
3 方法学验证 3.1 线性关系和检出限
在本研究选定的条件下测定,外标法定量。将混合标准溶液分别添加到模拟酒样中,使模拟酒样中除草剂的质量浓度为0.008~5 mg/L,按照1.4节的方法处理。以添加混合标准溶液的模拟酒样中目标分析物的浓度 (x, mg/L) 为横坐标,对应色谱峰峰面积 (y) 为纵坐标,绘制工作曲线。结果(表1)表明,在0.008~5 mg/L范围内,西玛津、莠去津、特丁津和扑草净的峰面积与其质量浓度间呈良好的线性关系,相关系数 (r) 在0.999 7~0.999 9之间。以3倍信噪比 (S/N=3) 计算得到4种除草剂的检出限在1.8~2.8 μg/L之间。依照欧盟标准SANTE 11 945[21],将添加回收试验的最低添加水平定为方法的定量限 (LOQ),为0.008 mg/L。
本试验采用富集倍数 (EF) 来衡量表面活性剂辅助-凝固-漂浮分散液-液微萃取效率。EF是以标准溶液的直接进样色谱峰面积与DLLME富集后进样的色谱峰面积进行比较,以分析物经萃取后的浓度与样品溶液的初始浓度计算得到[22]。由表1可知:方法的线性关系好,定量限低,富集倍数高。
3.2 方法准确度与精密度以葡萄酒作为空白基质添加 4 种除草剂,每个水平重复5次。结果 (表2) 表明:在0.008、0.08和2.4 mg/L 3个添加水平下,4种葡萄酒中西玛津、莠去津、特丁津和扑草净的添加回收率在84%~102%之间,相对标准偏差 (RSD) 在2.1%~6.9% 之间(n=5),具有较高的准确度和良好的稳定性,可用于葡萄酒样中4种三嗪类除草剂残留的检测。典型色谱图见图5所示。
4 实际样品分析
按本研究建立的方法,对4种购于超市的葡萄酒 (1#、2#、3#、4#) 中西玛津、莠去津、特丁津和扑草净的残留量进行测定。结果在4种葡萄酒中均未检测出上述农药,说明这4种葡萄酒中上述农药的残留量低于该方法的检测限。
5 结论本研究以Tween-20为分散剂、十一醇为萃取剂,建立了表面活性剂辅助-凝固-漂浮分散液-液微萃取-高效液相色谱法测定葡萄酒中西玛津、莠去津、特丁津和扑草净残留的方法。该方法具有操作简单、耗时短、成本低、环境友好等优点。该方法对供试的4种三嗪类除草剂显示出良好的萃取效果,富集倍数达24.5~32.4倍,相对标准偏差在10%以内,呈现出良好的稳定性,可用于葡萄酒中西玛津、莠去津、特丁津和扑草净残留的测定。
[1] |
苏趋, 刘彬, 洪军, 等. 加速溶剂萃取-高效液相色谱法测定土壤中11种三嗪类除草剂[J]. 环境化学, 2017, 36(3): 628–634.
SU Q, LIU B, HONG J, et al. Determination of eleven triazine pesticides in soil samples by accelerated solvent extraction-high performance liquid chromatography[J]. Environ Chem, 2017, 36(3): 628–634. doi:10.7524/j.issn.0254-6108.2017.03.2016071805 |
[2] |
食品伙伴网. 农兽药数据库[DB/OL]. [2017-08-10]. http://db.foodmate.net/pesticide/.
Food Mate Network. Agricultural and veterinary drugs database[DB/OL]. [2017-08-10]. http://db.foodmate.net/pesticide/. |
[3] |
王晓春, 刘庆龙, 杨永亮. 高效液相色谱-串联质谱法同时测定农田土壤中31种三嗪类除草剂残留[J]. 分析化学, 2014, 42(3): 390–396.
WANG X C, LIU Q L, YANG Y L. Determination of 31 triazine herbicides in farmland soils by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chin J Analyt Chem, 2014, 42(3): 390–396. |
[4] | NAGARAJU D, HUANG S D. Determination of triazine herbicides in aqueous samples by dispersive liquid-liquid microextraction with gas chromatography-ion trap mass spectrometry[J]. J Chromatogr A, 2007, 1161(1-2): 89–97. doi:10.1016/j.chroma.2007.05.065 |
[5] | LIU T T, CAO P, GENG J P, et al. Determination of triazine herbicides in milk by cloud point extraction and high-performance liquid chromatography[J]. Food Chem, 2014, 142: 358–364. doi:10.1016/j.foodchem.2013.07.062 |
[6] |
杨眉, 陈学敏, 李钰, 等. 分子印迹传感技术在农药残留检测中的应用研究进展[J]. 农药学学报, 2016, 18(2): 151–157.
YANG M, CHEN X M, LI Y, et al. Research progress of the application of molecular imprinted sensor in the detection of pesticide residues[J]. Chin J Pestic Sci, 2016, 18(2): 151–157. |
[7] |
谢建军, 曾广丰, 丁博, 等. QuEChERS法结合高效液相色谱-串联质谱法测定葡萄酒中26种除草剂残留量[J]. 食品安全质量检测学报, 2015, 6(9): 3692–3700.
XIE J J, ZENG G F, DING B, et al. Determination of 26 kinds of herbicide residues in grape wine by QuEChERS combined with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Food Saf Qual, 2015, 6(9): 3692–3700. |
[8] |
赵建晖, 郭菁, 吴文凡, 等. 固相萃取-液相色谱串联质谱法测定葡萄酒中27种农药残留[J]. 福建分析测试, 2015, 24(6): 7–13.
ZHAO J H, GUO J, WU W F, et al. Determination of residual amounts of 27 pesticides in grape wine with SPE pretreatment (LC-MS/MS)[J]. Fujian Anal Test, 2015, 24(6): 7–13. |
[9] | FATTAHI N, ASSADI Y, HOSSEINI M R, et al. Determination of chlorophenols in water samples using simultaneous dispersive liquid–liquid microextraction and derivatization followed by gas chromatography-electron-capture detection[J]. J Chromatogr A, 2007, 1157(1-2): 23–29. doi:10.1016/j.chroma.2007.04.062 |
[10] |
孙鹏, 高玉玲, 王金梅, 等. 漂浮固化分散液-液微萃取-气相色谱法测定液态奶中5种拟除虫菊酯类农药残留[J]. 农药学学报, 2016, 18(4): 497–502.
SUN P, GAO Y L, WANG J M, et al. Dispersive liquid-liquid microextraction based on the solidification of a floating organic droplet followed by gas chromatography for the determination of five pyrethroid pesticides residues in liquid milk samples[J]. Chin J Pestic Sci, 2016, 18(4): 497–502. |
[11] | GURE A, LARA F J, GARCÍA-CAMPAÑA A M, et al. Vortex-assisted ionic liquid dispersive liquid-liquid microextraction for the determination of sulfonylurea herbicides in wine samples by capillary high-performance liquid chromatography[J]. Food Chem, 2015, 170: 348–353. doi:10.1016/j.foodchem.2014.08.065 |
[12] | CINELLI G, AVINO P, NOTARDONATO I, et al. Rapid analysis of six phthalate esters in wine by ultrasound-vortex-assisted dispersive liquid-liquid micro-extraction coupled with gas chromatography-flame ionization detector or gas chromatography-ion trap mass spectrometry[J]. Anal Chim Acta, 2013, 769: 72–78. doi:10.1016/j.aca.2013.01.031 |
[13] | PANG L, YANG H Q, YANG P J, et al. Trace determination of organophosphate esters in white wine, red wine, and beer samples using dispersive liquid-liquid microextraction combined with ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Chem, 2017, 229: 445–451. doi:10.1016/j.foodchem.2017.02.103 |
[14] | TASSIA S S, FRANCISCO C R, CEZAR A B, et al. Feasibility of dispersive liquid–liquid microextraction for extraction and preconcentration of Cu and Fe in red and white wine and determination by flame atomic absorption spectrometry[J]. Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy, 2015, 105: 136–140. doi:10.1016/j.sab.2014.11.002 |
[15] | JIANG X Y, ZHANG H, CHEN X Q. Determination of phenolic compounds in water samples by HPLC following ionic liquid dispersive liquid-liquid microextraction and cold-induced aggregation[J]. Microchim Acta, 2011, 175(3-4): 341–346. doi:10.1007/s00604-011-0672-6 |
[16] |
周荔子, 杨兆光, 刘耀驰, 等. 分散液液微萃取-气相色谱-质谱分析葡萄酒中单萜醇[J]. 分析化学, 2015, 43(4): 534–539.
ZHOU L Z, YANG Z G, LIU Y C, et al. Etermination of mono-terpenols in wine by dispersive liquid-liquid microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry[J]. Chin J Analyt Chem, 2015, 43(4): 534–539. doi:10.11895/j.issn.0253-3820.140934 |
[17] |
陈晓前, 张铁. 试述pH值与葡萄酒的关系[J]. 酿酒, 2002, 29(2): 62–63.
CHEN X Q, ZHANG T. Relationship between pH value and wine[J]. Liquor Making, 2002, 29(2): 62–63. |
[18] |
丁宗庆, 张琼瑶. 凝固-漂浮分散液液微萃取-高效液相色谱法测定水样中氯酚[J]. 分析化学, 2010, 38(10): 1400–1404.
DING Z Q, ZHANG Q Y. Dispersive liquid-liquid microextraction based on solidification of floating organic drop combined with high performance liquid chromatography for determination of chlorophenols in aqueous samples[J]. Chin J Analyt Chem, 2010, 38(10): 1400–1404. |
[19] | JIA X Y, HAN Y, LIU X L, et al. Speciation of mercury in water samples by dispersive liquid–liquid microextraction combined with high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry[J]. Spectrochimica Acta B: Atomic Spectroscopy, 2011, 66(1): 88–92. doi:10.1016/j.sab.2010.12.003 |
[20] | BASHEER C, LEE H K, OBBARD J P. Application of liquid-phase microextraction and gas chromatography–mass spectrometry for the determination of polychlorinated biphenyls in blood plasma[J]. J Chromatogr A, 2004, 1022(1-2): 161–169. doi:10.1016/j.chroma.2003.09.043 |
[21] | European Commission. Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticides residues analysis in food and feed: SANTE/11945/2015[S]. European Commission, 2015. |
[22] |
马燕玲, 陈令新, 丁养军, 等. 超声辅助分散液液微萃取-高效液相色谱测定水样中的4种邻苯二甲酸酯类增塑剂[J]. 色谱, 2013, 31(2): 155–161.
MA Y L, CHEN L X, DING Y J, et al. Simultaneous determination of four phthalate esters in water samples using ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction coupled with high performance liquid chromatography[J]. Chin J Chromatogr, 2013, 31(2): 155–161. |