琥珀酸脱氢酶抑制剂 (SDHIs) 早期也被称为酰胺类杀菌剂，目前市场上登记应用的代表性品种主要有噻呋酰胺 (trifuzamide) 和啶酰菌胺 (boscalid) 等^[1-2]。噻呋酰胺主要用于防治水稻纹枯病等病害，杀菌谱较窄，对担子菌防治效果较好，但对子囊菌、卵菌和半知菌效果较差^[1]。啶酰菌胺由德国巴斯夫公司于1992年发现其具有杀菌活性并申请专利，现已在50多个国家获准登记，用于防治100多种作物上的80多种病害，其对灰霉病、菌核病、白粉病及各种腐烂病、根腐病等均有良好的防治效果^[3-5]。近年来，新型的SDHIs药剂不断推出，已成为全球杀菌剂研究的主要热点之一^[6-7]。

氯苯醚酰胺 (图式1)，化学名称N-(2-(2,4-二氯苯氧基) 苯基)-3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-酰胺，是由华中师范大学自主创制的新型SDHIs药剂 (开发号Y13149)^[8-9]，但目前尚未见公开发表的该药剂相关研究数据。本文拟测定氯苯醚酰胺对植物病原菌的抗菌谱，并在此基础上开展其防治水稻纹枯病的田间试验，同时尝试建立水稻纹枯病菌群体对其的敏感性基线，以期为后续氯苯醚酰胺在病害防治领域的推广应用及监测其敏感性变化提供依据。

1 材料与方法 1.1 供试菌株

辣椒疫霉Phytophthora capsici、链状腐霉Pythium catenulatum、藤仓镰孢Fusarium fujikuroi、葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、链格孢Alternaria alternata、灰葡萄孢Botrytis cinerea、胶孢炭疽Colletotrichum gloeosporioides、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、齐整小核菌Sclerotium rolfsii、麦根腐双极蠕孢Bipolaris sorokiniana、稻梨孢Pyricularia grisea和核盘菌Sclerotinia sclerotiorum均由本实验室保存。

1.2 药剂及培养基

氯苯醚酰胺 (Y13149) 原药用丙酮配制成10 g/L的母液，4 ℃下保存，用于抗菌谱和敏感性基线测定。5%氯苯醚酰胺乳油 (Y13149 EC) 和240 g/L噻呋酰胺悬浮剂 (trifuzamide SC) 均由江西正邦集团提供，用于田间药效试验。

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，用蒸馏水定容至1 000 mL，每200 mL分装入锥形瓶中。放入高压灭菌锅中灭菌，室温保存备用。

1.3 抗菌谱测定

采用离体菌丝生长速率法^[4-5]。将病原菌从4 ℃ PDA斜面活化到PDA平板上，置于各菌最适温度环境中，黑暗培养，至菌丝生长到平板直径3/4处时再转接到新的PDA板上；待菌丝再次生长至平板直径的3/4处时，于接近菌落边缘同一圆周上制取直径为5 mm的菌丝块；将菌丝块接种至含不同浓度氯苯醚酰胺的PDA平板中央，对照为含相同体积丙酮的PDA平板，每处理4次重复。预试验中药剂质量浓度分别为0、0.5、1、2、4、8和16 mg/L，根据预试验结果对特别敏感或不敏感的病原菌适当调整了浓度梯度。在适温下倒置、黑暗培养3~6 d，用十字交叉法测量菌落直径，取平均值，按式 (1) 计算菌丝生长抑制率。利用IBM SPSS Statistics软件，以药剂浓度的对数值为横坐标、以菌丝生长抑制率几率值为纵坐标建立线性回归方程，并进行相关性分析，测定氯苯醚酰胺对不同病原菌的抑制活性 (EC₅₀值)。

$\begin{aligned}\!\!\!\!{\text{抑制率}}/\text{\%}\! =&\left [ {\left( {{\text{对照菌落增长直径}} - {\text{处理菌落增长}}} \right.} \right.\\&\left.{\text{直径}}\right)/ \left. {{\text{对照菌落增长直径}}} \right] \times 100\end{aligned}$

(1)

1.4 防治水稻纹枯病的田间药效试验

田间试验于2013年在浙江省宁波和绍兴两地分别进行，分别设4个处理 (有效剂量)：① 5%氯苯醚酰胺EC 75 g/hm²，② 5%氯苯醚酰胺EC 37.5 g/hm²，③ 240 g/L噻呋酰胺SC 75 g/hm²，④ 空白对照 (CK)。于2013年7–9月期间连续施药2次，待病情稳定后 (第二次施药后21 d) 调查结果。其余操作参照“田间药效试验准则 (一) 杀菌剂防治水稻纹枯病”^[10]进行。分析同一地区不同处理间防治效果的差异显著性 (P = 0.05)。

1.5 水稻纹枯病菌对氯苯醚酰胺敏感性基线的建立

用于建立敏感性基线的125个菌株于2006–2009年8–9月期间采自浙江省和江苏省水稻田，其中浙江省81株，江苏省44株，采集田块在之前均未曾使用过SDHIs杀菌剂。测定各菌株的敏感性时，氯苯醚酰胺的质量浓度分别设为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 mg/L^[11]，对于少数几个EC₅₀值高于3.2 mg/L的菌株，试验重复时增加了6.4 mg/L的处理。各菌株在PDA平板上预培养3 d后，同样采用菌丝生长速率法^[4-5]测定，每处理重复3次，于25 ℃下黑暗培养，3 d后测量各处理菌落直径 (cm)，求出毒力回归方程及EC₅₀值。将供试药剂对病原菌群体的EC₅₀值按从高到低分成约10个左右区间，统计各区间菌株的频率 (%)，以EC₅₀值为x轴，相应的频率 (%) 为y轴，绘制敏感性频率分布图^[4-5]。

2 结果与分析 2.1 抗菌谱

氯苯醚酰胺对供试10种植物病原真菌菌丝生长的影响不同 (表1)。其中对立枯丝核菌和齐整小核菌的抑制活性最强，EC₅₀值分别为0.008和0.015 mg/L；对灰葡萄孢、稻梨孢、麦根腐双极蠕孢、链格孢和核盘菌也有较好的抑制活性，EC₅₀值在1.727~6.635 mg/L之间；对胶孢炭疽、葡萄座腔菌和藤仓镰孢有一定的抑制活性；表明氯苯醚酰胺具有较广的杀真菌谱。但其对辣椒疫霉和链状腐霉两种卵菌的抑制活性均较差，32 mg/L处理的抑制率分别仅为27.8%和37.3%，故没有继续提高浓度测定其EC₅₀值。

2.2 田间防治效果

田间试验表明，氯苯醚酰胺对水稻纹枯病的防治效果与噻呋酰胺相当 (表2)。在宁波试验点，5%氯苯醚酰胺EC有效剂量 37.5 g/hm²处理的效果显著优于240 g/L噻呋酰胺SC有效剂量 75 g/hm² (P = 0.05)；绍兴试验点，相同有效剂量 (75 g/hm²) 下，5%氯苯醚酰胺EC的防效与240 g/L噻呋酰胺SC无显著差异 (P = 0.05)。

2.3 水稻纹枯病菌对氯苯醚酰胺的敏感性基线

供试125株水稻纹枯病菌对氯苯醚酰胺的敏感性频率分布见图1。其中EC₅₀值最高为0.259 mg/L，最低为0.002 mg/L，相差约128倍，平均EC₅₀值为 (0.021 ± 0.008) mg/L。从图1中可看出，供试水稻纹枯病菌群体对氯苯醚酰胺的敏感性呈连续性分布，其频率分布为近似正态的单峰曲线，因此，可将其平均EC₅₀值作为水稻纹枯病菌对氯苯醚酰胺敏感性基线的参考值，用于监测其田间抗药性的演化。

3 讨论

20世纪70年代推出的以萎锈灵和氧化萎锈灵为代表的早期酰胺类化合物主要对担子菌具有高活性，防病谱窄；2003年上市的啶酰菌胺则是该类化合物发展的里程碑，其对灰霉病等子囊菌病害有优异的防治效果。2009年，国际杀菌剂抗药性行动委员会 (FRAC) 根据作用机理将此类化合物统一归为琥珀酸脱氢酶抑制剂类 (succinate dehydrogenase inhibitors，SDHIs)^[9]。近年来新推出的SDHIs化合物具有高活性、抗菌谱不断拓展等特点，已成为杀菌剂研发的热点领域^{[2, 7, 12]} 。

氯苯醚酰胺是华中师范大学基于药效团连接碎片虚拟筛选策略 (PFVS) 快速发现的新型SDHIs化合物，目前已进行产业化开发，并已进入农药产品登记阶段。本研究发现，氯苯醚酰胺对多种植物病原真菌均有较强的抑制活性，其中对立枯丝核菌、齐整小核菌活性最强，对灰葡萄孢、稻梨孢、麦根腐双极蠕孢及链格孢也有显著的抑制活性，综合具备了噻呋酰胺和啶酰菌胺的抗菌谱特点^[4-7]；同时其对田间水稻纹枯病也有很好的防治效果；表明氯苯醚酰胺在水稻纹枯病防治上具有较好的应用前景。关于氯苯醚酰胺在齐整小核菌、灰葡萄孢及稻梨孢等所致病害防治上的应用还有待进一步研究。

由于SDHIs属于单作用位点专化性杀菌剂，抗性风险较高，为保证氯苯醚酰胺以后能够在水稻纹枯病防治中得到大规模应用，必需尽早开展相关的抗药性监测与预防工作^[13]。本研究同时测定了田间水稻纹枯病菌群体 (n = 125) 对氯苯醚酰胺的敏感性，结果表明，氯苯醚酰胺抑制水稻纹枯病菌菌丝生长的EC₅₀ 值在0.022~0.259 mg/L之间，菌株敏感性频率呈连续性分布，因此可将其平均EC₅₀值0.021 mg/L作为水稻纹枯病菌对氯苯醚酰胺的敏感性基线参考值，用于后续的敏感性变化监测。另外，关于氯苯醚酰胺的抗性风险也还需开展全面的风险评价研究及应用后的抗性监测等工作。