2017, Vol. 19
避蚊胺 (diethyltoluamide，以下简称 DEET) 是酰胺类化学合成驱避剂，具有广谱性、高效性和安全低毒等特点，已被广泛应用 60 余年[1]。但由于 DEET 本身具有亲油性，水中溶解性差，所以市售避蚊胺大多以乙醇作溶剂，主要用作熏蒸趋避目的，如果直接涂抹在身上，产品易挥发，对皮肤刺激也强，且实际驱蚊效果一般只有 4~6 h，不能提供长时间的有效保护，因此，有必要制备一种安全的水溶性 DEET 缓释产品。
β-环糊精 (β-cyclodextrin，以下简称 β-CD) 是由 α-1,4-糖苷键连接 7 个葡萄糖组成的无毒环状寡糖，具有疏水性内部空腔和亲水性外部结构[2-4]。这一独特结构允许客体 (疏水分子或疏水部分) 通过非共价键被包合进空腔而形成水溶性包合物，进而起到增溶、缓释和增加稳定性的作用[5]。O-羧甲基壳聚糖 (O-carboxymethyl chitosan，以下简称 O-CMC) 是壳聚糖的两性乙醚衍生物，由于其具有无毒性、生物可降解性及生物相容性而被关注[6-8]。此外，O-CMC 在中性及碱性环境下水溶性好，安全性高，由其所制备的纳米胶囊具有较好的缓释作用[9]。基于此，本研究采用饱和溶液法先制备 DEET/β-CD 包合物，再采用离子交联法将其包入 O-CMC 与交联剂氯化钙 (CaCl2) 形成的纳米胶囊内，制备了 DEET/β-CD/O-CMC 亲水性纳米胶囊，对其结构进行表征，并进行了缓释性能研究，以期实现 DEET 更安全和长效的释放。
1 材料与方法 1.1 材料与仪器O-羧甲基壳聚糖 (O-CMC)，青岛弘海生物技术有限公司 (取代度 > 80%)；DEET (纯度 > 98%)，Aladdin Reagent；β-CD (纯度 > 99%)，成都市科龙化工试剂厂。其余试剂均为分析纯。
T6 系列紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；Zetasizer Nano ZS90 激光粒度分析仪，英国马尔文公司；DSC 404 F3 差示扫描量热仪 (DSC) 和 XRD6000 X-射线衍射仪，日本岛津制作所；Tecrai 10 扫描电子显微镜 (SEM)，日本日立制作所。
1.2 试验方法1.2.1 DEET 标准曲线的绘制 准确称取 0.01 g (精确至 0.000 1 g) DEET，用质量分数为 80% 的乙醇溶液定容至 100 mL，即得质量浓度为 0.1 mg/mL 的 DEET 储备液。分别量取 DEET 储备液 1.0、1.5、2.0、2.5 和 3.0 mL 至 10 mL 容量瓶中，用质量分数为 80% 乙醇溶液定容，混合均匀得 10.0、15.0、20.0、25.0 和 30.0 μg/mL 的 DEET 标准溶液。以 80% 乙醇溶液为参比溶液，在 265 nm 波长处，分别测定不同浓度 DEET 标准溶液的紫外吸光度值，以 DEET 质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制 DEET 的标准曲线。
1.2.2 β-CD 对 DEET 的增溶作用测定 准确称取 2.775 g β-CD，溶于 150 mL 蒸馏水中，获得 β-CD 储备液。分别向含有 15.0、20.0、25.0、30.0 和 35.0 mL β-CD 储备液的 50 mL 烧杯中加入 0.998 g DEET，每个烧杯均补水至 35 mL，置于 30 ℃ 水浴恒温振荡器中振荡 48 h。分别取出 5.0 mL 样品过滤后测定紫外吸光度值，根据标准曲线绘制相溶解度图，并研究 β-CD 的增溶作用。
1.2.3 DEET/β-CD 包合物的制备 采用饱和溶液法[10]制备。准确称取 0.925 0 g β-CD 于 50 mL 蒸馏水中配制成饱和溶液，在搅拌下加入由相溶解度图确定的 DEET 乙醇溶液，置于恒温 30 ℃ 磁力搅拌器上搅拌 3 h，于 4 ℃ 冷藏 12 h，12 000 r/min 下离心，分离沉淀，冷冻干燥，即得 DEET/β-CD 包合物。
1.2.4 DEET/β-CD 包合物的表征
1.2.4.1 包封率和载药量的测定 将 DEET/β-CD 包合物于 12 000 r/min 下离心，收集上清液，于紫外-可见分光光度计下测定吸光度值，通过标准曲线计算上清液中 DEET 的含量 (mB)。按公式 (1) 和 (2) 计算包合物载药量 (Lc) 及包封率 (Ee)。
| ${L_{\rm{c}}}/\text{%} = \frac{{{m_{\rm A}} - {m_{\rm B}}}}{{{m_{\rm S}}}} \times 100$ | (1) |
| ${E_{\rm e}}/ \text{%}= \frac{{{m_{\rm A}} - {m_{\rm B}}}}{{{m_{\rm A}}}} \times 100 $ | (2) |
式中：mA 为初始投药量，mB 为上清液中含药量，mS 为冷冻干燥后的包合物的质量。
1.2.4.2 DEET/β-CD 包合物的 DSC 分析 分别对 β-CD、DEET、DEET 与 β-CD 的物理混合物和 DEET/β-CD 包合物进行 DSC 表征，扫描范围为 T = 40~360 ℃。
1.2.4.3 DEET/β-CD 包合物的 XRD 分析 用 XRD 对 β-CD、DEET/β-CD 包合物进行表征，扫描范围为 2θ = 2°~45°。
1.2.5 DEET/β-CD/O-CMC 亲水性纳米胶囊的制备 采用离子交联法制备[11]。取 2 mg/mL 的 O-CMC 溶液 20 mL，用 0.1 mol/L 的盐酸溶液调节 pH 为 7.4，加入 1.96 mL DEET/β-CD 包合物溶液 [m(DEET) : m (O-CMC) = 3:20]，滴加 4 mg/mL 的交联剂 CaCl2 溶液 2.5 mL (m (CaCl2) : m (O-CMC) = 1 : 4)，搅拌 30 min 后得到纳米胶囊混悬液，于 12 000 r/min 下离心，得到沉淀，冷冻干燥，即得纳米胶囊。
1.2.6 纳米胶囊的表征
1.2.6.1 包封率和载药量的测定 DEET/β-CD/O-CMC 纳米胶囊混悬液的处理及载药量 (Lc)、包封率 (Ee) 的计算公式同 1.2.4 节。
1.2.6.2 粒径、PDI 以及 Zeta 电位的测定 用粒径电位仪测定纳米胶囊混悬液的粒径、PDI 和 Zeta 电位。
1.2.6.3 表面形态观察 适当用蒸馏水稀释纳米胶囊混悬液，滴在单晶硅片上，晾干后用 SEM 观察其形态。
1.2.7 载药缓释性能研究 分别将 DEET、DEET/β-CD 包合物和 DEET/β-CD/O-CMC 纳米胶囊溶于 0.05 mol/L 的 Tris-HCl (pH = 7.4) 缓冲液中，置于 37 ℃ 恒温振荡器中振荡，定时取样，测定吸光度值，按 (3) 式计算 DEET 的累积释放率 (Er)[12]。
| ${E_{\rm r}}/\text{%} = \frac{{{V_{\rm e}}\mathop \sum \nolimits_{i = 1}^{n - 1} {C_i} + {V_0}{C_n}}}{{{m_{\rm {drug}}}}} \times 100$ | (3) |
式中：Er 表示累积释放率，Ve 为每次取样体积，V0 为总体积，Cn 为 DEET 取样浓度，mdrug 为 DEET 总量。
2 结果与讨论 2.1 DEET 的标准曲线测定结果表明，DEET 在质量浓度 (ρ) 为 10.0~30.0 μg/mL 范围内与吸光度 (A) 呈较好的线性关系，其线性回归方程为 A = 0.020 22ρ–0.003，决定系数 R2 = 0.999 0。
2.2 β-CD 对 DEET 的增溶作用由图 1 可知，DEET 的溶解度与 β-CD 的浓度呈线性关系，即随着 β-CD 浓度的增加，DEET 的溶解度增大。据文献[13]报道，相溶解度图呈现 AL 型，这表明包合物的形成是 DEET 与 β-CD 以 1 : 1 的物质的量之比进行了包埋。
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图 1 β-CD 对 DEET 溶解度的影响 Fig. 1 Effect of β-CD on the solubility of DEET |
DEET 在水中的溶解度约为 0.99 mg/mL，按 1.2.3 节饱和溶液法制备的 DEET/β-CD 包合物 (DEET 与 β-CD 物质的量之比为 1 : 1)，其溶解度增加至 27.70 mg/mL，表明 β-CD 的加入，使 DEET 溶解度增加了约 27 倍。
2.3 DEET/β-CD 包合物的表征2.3.1 包封率和载药量 结果表明，本研究所制备的 DEET/β-CD 包合物的包封率为 (81.69 ± 1.07)%，载药量为 (20.60 ± 0.33)%。
2.3.2 DEET/β-CD 包合物的 DSC 分析 图 2 为 DEET (a)、β-CD (b)、β-CD 与 DEET 物理混合物 (物质的量之比 1 : 1)(c) 及 DEET/β-CD 包合物 (物质的量之比 1 : 1)(d) 的 DSC 图。可以看出：纯 DEET (a) 在 166.2 ℃ 有一个强吸收峰，纯 β-CD (b) 在 119.9 ℃ 处有一个很强的吸收峰；二者的物理混合物 (c) 在 166.2 ℃ 和 112.8 ℃ 出现强吸收峰，基本是 β-CD 和 DEET 吸收峰的叠加；而 DEET/β-CD 包合物 (d) 在 166.2 ℃ 处的吸收峰完全消失。表明 DEET 通过非共价键进入了 β-CD 空腔形成水溶性包合物，破坏了原来的 DEET 晶形结构。
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图 2 DEET (a)、β-CD (b)、β-CD 与 DEET 物理混合物 (c) 及 DEET/β-CD 包合物 (d) 的 DSC 图 Fig. 2 DSC thermograms of DEET (a), β-CD (b), physical mixture of DEET and β-CD (c), and DEET/β-CD inclusion compound (d) |
2.3.3 DEET/β-CD 包合物的 XRD 分析 由图 3 可以看出：β-CD (a) 在 2θ = 32.5° 处有强烈的尖峰；而 DEET/β-CD 包合物 (b) 的衍射峰有明显变化，在 2θ=5.6°、10.8°、17.5° 和 20.4° 处均有尖峰存在，这表明 DEET 与 β-CD 之间不是发生了简单包埋，也可能发生了一定的相互作用。
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图 3 β-CD (a)、DEET/β-CD 包合物 (b) 的 XRD 图谱 Fig. 3 XRD patterns of β-CD (a) and DEET/β-CD inclusion compound (b) |
2.3.4 DEET/β-CD/O-CMC 纳米胶囊的表征
2.3.4.1 包封率和载药量 通过离子交联法制备得到的 DEET/β-CD/O-CMC 纳米胶囊的包封率为 (79.93 ± 2.08) %，载药量为 (12.11 ± 0.09) %。
2.3.4.2 纳米胶囊粒径、PDI 及 Zeta 电位 从图 4 可以看出，该纳米胶囊平均粒径为 (230.50 ± 11.34) nm，Zeta 电位为 (–19.08 ± 0.99) mV，PDI 为 0.055。说明所得纳米胶囊粒径分布较窄，而且纳米胶囊稳定性良好。
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图 4 DEET/β-CD/O-CMC 纳米胶囊粒径 (a) 及 Zeta 电位分布图 (b) Fig. 4 Particles size and Zeta potential distribution of DEET/β-CD/O-CMC nanocapsules |
2.3.4.3 纳米胶囊 SEM 观察 SEM 观察发现，DEET/β-CD/O-CMC 纳米胶囊呈椭圆形，平均粒径在 200~300 nm (图 5)，这与激光粒度仪所得结果相符合。
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图 5 DEET/β-CD/O-CMC 纳米胶囊的 SEM 图 Fig. 5 SEM micrographs of DEET/β-CD/O-CMC nanocapsules |
2.3.5 载药缓释性能研究 图 6 为 DEET、DEET/β-CD 包合物和 DEET/β-CD/O-CMC 纳米胶囊的缓释行为。可以看出：纯 DEET (a) 在 40 min 时已完全释放；而 DEET/β-CD 包合物 (b) 和 DEET/β-CD/O-CMC 纳米胶囊 (c) 中的 DEET，在 6 h 时的累积释放率分别为 24.87% 和 14.39%，12 h 时分别为 30.67% 和 19.86%，24 h 时分别为 38.10% 和 27.04%。可见相较于 DEET/β-CD 包合物，DEET/β-CD/O-CMC 纳米胶囊具有更好的缓释性。
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图 6 Tris-HCl 缓冲液下纯 DEET (a)、DEET/β-CD 包含物 (b) 及 DEET/β-CD/O-CMC 纳米胶囊 (c) 里 DEET 的累积释放率 Fig. 6 Accumulated release rate of DEET (a), DEET/β-CD inclusion compound (b), DEET/β-CD/O-CMC nanocapsules (c) in Tris-HCl |
3 结论
本研究采用饱和溶液法制备了 DEET/β-CD 包合物，并通过离子交联法制备了 DEET/β-CD/O-CMC 纳米胶囊。DSC、XRD 分析结果表明，DEET 已成功包合进入 β-CD 空腔中，而且通过 β-CD 的增溶作用，可使 DEET 在水中的溶解度增加约 27 倍。所制备的 DEET/β-CD/O-CMC 纳米胶囊的包封率和载药量分别为 (79.93 ± 2.08) % 和 (12.11 ± 0.09) %，且分散性和稳定性良好，粒径为 (230.50 ± 11.34) nm。体外释放 24 h 发现，包合物和纳米胶囊中 DEET 累积释放率分别为 38.10% 和 27.04%。表明 DEET/β-CD/O-CMC 纳米胶囊具有很好的缓释性。
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