透骨草 Phryma leptostachya L.为透骨草科透骨草属多年生草本植物，全草及根有毒，能清热，治黄水疮、疥癣及虫疮毒。根可杀蝇蛆，全草能杀灭蔬菜菜青虫^[1]。双氧木脂素 E (结构式见图式 1^[2]) 是从透骨草中分离出的一个具有二氧双环辛烷新骨架的木脂素，对东方粘虫 Mythimna separata、家蝇 Musca domestica、淡色库蚊 Culex pipiens pallens 及槐尺蠖 Semiothisa cinerearia 等具有很强的胃毒及触杀活性^[1-2]。症状学观察发现，双氧木脂素 E 可使试虫软瘫麻痹，对外界刺激反应逐渐降低，最后麻痹直至死亡^[3]，其症状类似于作用于肌肉系统的天然产物鱼尼丁^[4]。为了明确双氧木脂素 E 是否作用于肌肉系统，笔者以东方粘虫为供试昆虫，通过电镜观察和 ATP 酶活性测定，研究了双氧木脂素 E 对东方粘虫幼虫体壁肌超微结构及 Na⁺-K⁺-ATPase、Ca²⁺-ATPase 活力的影响，旨在为进一步明确双氧木脂素 E 杀虫活性的作用机理提供依据。

1 材料与方法 1.1 供试材料及主要仪器

东方粘虫 Mythimna separata (由西北农林科技大学农药研究所提供)，为室内以小麦或玉米叶片于温度 22~25 ℃、相对湿度 70%~80% 下人工累代饲养的敏感品系，挑选蜕皮后 2 d 的 5 龄粘虫幼虫供试。双氧木脂素 E，由透骨草分离获得，纯度 ≥ 98%，配制成 1.0 mg/mL 的丙酮溶液供试。EJEM-2000EX 透射电镜 (日本电子光学公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 试虫处理 采用载毒叶片饲虫法^[5]。用 1 μL 微量点滴器将供试药液涂布在 0.5 cm × 0.5 cm 小麦叶片上，以等量丙酮为对照。待溶剂挥发后，将叶片放入 24 孔板中，每孔 1 片并接 1 头饥饿 24 h 的 5 龄粘虫幼虫。每处理 24 头试虫，重复 3 次，用湿纱布保湿，于 22~25 ℃、相对湿度 70%~80% 的养虫室内饲养。

1.2.2 超微结构观察

1.2.2.1 体壁肌肉样品的处理^[6]　将处理后蜕皮 2 d 的 5 龄粘虫幼虫，分别于麻痹初期 (处理后 4 h) 和深度麻痹期 (处理后 6 h) 取幼虫腹部第 2~6 节间体壁肌。低温下用 4% 戊二醛进行前固定，1% 锇酸后固定，再经系列丙酮 (50%→70%→80%→90%→100%) 脱水后，用 Epon812 包埋剂浸透包埋，于 35、45 和 60 ℃ 下各聚合 1 d，用 LKBV 型超薄切片机切片，再以醋酸铀和柠檬酸铅双重染色。

1.2.2.2 电镜观察　用透射电镜观察肌细胞并拍照，加速电压为 80 kV。

1.2.3 酶活力测定

1.2.3.1 酶液制备　供试幼虫分别于处理后无症状期 (处理后 2 h)、麻痹初期 (处理后 4 h)、深度麻痹期 (处理后 6 h) 取腹部体壁肌，称量后，分别加入 9 倍体积冰冷的 0.1 mol/L pH 7.4 的 Tris-HCl 缓冲液，冰浴匀浆，在 4 ℃、3 200 × g 下离心 10 min，取上清液，再于 4 ℃、13 000 × g 下离心 30 min，取沉淀用 Tris-HCl 缓冲液稀释，作为酶源备用。

1.2.3.2 Na⁺-K⁺-ATP 酶活力测定　参照伦才智等^[7]方法进行。

1.2.3.3 Ca²⁺-ATP 酶活力测定　参照何运转等^[8]方法进行。

1.2.3.4 蛋白质含量测定　参照 Bradford^[9]方法进行。

2 结果与分析 2.1 双氧木脂素 E 对粘虫幼虫肌肉细胞的影响

粘虫取食双氧木脂素 E 后逐渐麻痹。电镜观察显示，随着麻痹程度加深，肌细胞呈渐进性病变。对照组幼虫体壁肌细胞核呈椭圆形、染色质分布均匀 (图 1A)。处理组幼虫在麻痹初期，肌细胞细胞核开始皱缩变形，染色质浓缩，聚合在核膜附近的边缘 (图 1B)；在深度麻痹期，细胞核进行性皱缩变形, 染色质进一步浓缩 (图 1C)。对照组肌原纤维排列规则有序，Z-线致密清晰 (图 1D)；处理组幼虫随着中毒症状逐渐加深，肌原纤维 Z-线先弥散呈间断点状排列 (图 1E), 继而肌原纤维排列紊乱 (图 1F)。对照肌质网结构完好致密 (图 1G)，而处理组幼虫随着麻痹程度加深, 肌质网渐进性扩张 (图 1I、J、M)。对照组幼虫线粒体结构完整清晰，内、外膜和嵴清晰可见 (图 1G、H)。处理组幼虫在麻痹初期，线粒体肿胀、嵴紊乱、出现空白亮区 (图 1F、I)；在深度麻痹期，线粒体空泡化严重、出现大片空白亮区，结构被严重破坏 (图 1K、L)，同时细胞质内出现大量多泡体 (图 1N、O)。

2.2 双氧木脂素 E 对 Na⁺-K⁺-ATPase 和 Ca²⁺-ATPase 活力的影响

酶活力测定结果表明：双氧木脂素 E 能明显抑制 5 龄粘虫幼虫体壁肌 Na⁺-K⁺-ATPase 和 Ca²⁺-ATPase 活力，且随着中毒程度加深，抑制作用亦逐渐加强。在取食大约 2 h 后 (无症状期)、麻痹初期及深度麻痹期对 Na⁺-K⁺-ATPase 的抑制率分别为 6.82%、27.16% 和 44.83%。对 Ca²⁺-ATPase 的抑制率分别为 3.61%、34.08% 和 55.33%。在无症状时对两种酶的抑制作用与对照差异不显著，在麻痹初期和深度麻痹期与对照差异显著 (图 2)。

3 讨论

Ozoe 等报道，双氧木脂素 A 和其他没有杀虫活性的透骨草类同系物均可抑制 γ-氨基丁酸受体与非竟争性抑制剂[³⁵S]t-butylbicyclophosphorothionate (TBPS) 的特异性结合，因此证明此抑制作用并不是对昆虫的致毒机理^[10]。另有研究显示，双氧木脂素 A 延长了果蝇神经-肌肉诱发兴奋性接点电位 (EJP) 的衰减频率，并使神经-肌肉自发性接点电位 (mEJP) 的频率极大地增加，出现重复簇状发放，从而导致神经递质的耗竭，阻断神经肌肉的传导，致使试虫软瘫麻痹^[11]。研究还发现，双氧木脂素 A 作用于昆虫钠离子通道，可引起电压依赖性钠离子通道发生显著性超极化改变，从而导致快速失活^[11]。本研究发现，双氧木脂素 A 的同系物，同样具有强杀虫活性的双氧木脂素 E 还作用于具有收缩功能的肌肉组织，引起试虫肌细胞中线粒体结构严重破坏、肌质网扩张、肌原纤维排列紊乱，细胞质中出现大量多泡体。

线粒体是细胞中的产能细胞器，依靠 ATP 酶催化 ATP 末端磷酸水解产生能量，对维持 Na⁺、K⁺、Ca²⁺ 等离子浓度的相对恒定及渗透压的平衡，保证细胞正常的信息传导、物质吸收及维持肌肉的兴奋性与收缩性具有重要意义^[12-14]。粘虫幼虫取食双氧木脂素 E 后, 肌细胞中线粒体被严重破坏, 三羧酸循环和氧化磷酸化中关键性酶系的活性均有下降，ATP 合成受阻，生成量减少，依赖 ATP 供给能量的 Na⁺-K⁺-ATP、Ca²⁺-ATP 酶活力也随之下降。本研究中发现，取食双氧木脂素 E 后，粘虫体内 Na⁺-K⁺-ATP、Ca²⁺-ATP 酶活力随着麻痹程度增加而逐渐降低，这一变化趋势也与肌细胞病理变化基本一致。

细胞在某些病理状态或毒物作用下会出现钙平衡紊乱，可使细胞内游离 Ca²⁺ 浓度异常，胞内 Ca²⁺ 浓度过高或过低都会影响细胞的结构和功能，并可最终导致细胞的凋亡或坏死^[15-18]。天然产物鱼尼丁和酰胺类杀虫剂属肌肉毒剂，作用于肌质网上的 Ca²⁺ 通道—鱼尼丁受体通道 (RyR)，使肌质网中 Ca²⁺ 大量释放到细胞质中，进而致使胞质中 Ca²⁺ 浓度过高而使试虫麻痹死亡^[19-20]，双氧木脂素 E 致毒症状与其类似。用双氧木脂素 E 处理粘虫幼虫后，Na⁺-K⁺-ATPase 活性下降可引起继发性 Na⁺/Ca²⁺ 交换增加，钙内流增加^[21]；而 Ca²⁺-ATPase 活性降低，不能将多余的钙泵出细胞外，或者泵入细胞内钙库中，引起钙库内 Ca²⁺ 缺乏而使试虫软瘫麻痹死亡。但是否因为肌质网扩张、结构损伤而作用于肌质网上的 Ca²⁺ 释放通道—三磷酸肌醇受体 (IP₃R) 或 RyR，还有待进一步研究。

另外，在双氧木脂素 E 作用下，肌原纤维排列紊乱，也可直接导致肌肉不能正常收缩而使试虫软瘫麻痹。电镜观察还发现，试虫在深度麻醉期，胞质中出现大量多泡体。推测当细胞器损伤较多时，细胞清除能力增强，初级溶酶体与受损细胞器融合形成次级溶酶体^[22]，经消化最终形成残余体汇集一起形成多泡体，该类结构增多说明细胞病理变化程度提高，但具体原因尚需进一步探讨。