2017, Vol. 19
2. 扬州市职业大学，江苏 扬州 225009
2. Yangzhou Vocational University, Yangzhou 225009, Jiangsu Province, China
螺虫乙酯 (spirotetramat) 作为一种新型季酮酸衍生物类杀虫剂，具有在植物木质部和韧皮部双向内吸传导性能[1]。作为乙酰辅酶A羧化酶的抑制剂，螺虫乙酯通过干扰昆虫脂肪的生物合成，可有效防治蔬菜、棉花及果树上的刺吸式口器害虫，如对菠菜斑潜蝇、棉蚜、梨木虱、葡萄根瘤蚜、蓟马和螨虫等均有很好的防治效果[2-8]。螺虫乙酯在环境中的代谢物主要为BYI08330-烯醇 (B-enol)、BYI08330-醇酮 (B-keto)、BYI08330-羟基 (B-mono) 和BYI08330-烯醇糖苷 (B-glu)。螺虫乙酯及4种代谢物的结构式见Scheme 1。中国国家标准中将螺虫乙酯及烯醇类代谢物 (B-enol) 之和定义为目标残留物，规定了其在叶菜类蔬菜 (芹菜除外) 上的最大残留限量 (MRL) 值为7.0 mg/kg[9]，该残留限量标准与国际食品法典委员会 (CAC) 标准[10]相同；而欧盟规定螺虫乙酯及其烯醇类代谢物 (B-enol) 在叶菜类蔬菜中的MRL值仅为0.1 mg/kg[11]。
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图式 1 螺虫乙酯及4种代谢物化学结构式 Scheme1 Chemical structures of spirotetramat and its four metabolites |
目前关于螺虫乙酯及代谢物残留分析方法的研究报道较少。Mohapatra等[12]及Singh等[13]采用乙腈作为提取溶剂，分别建立了螺虫乙酯及B-enol在芒果、甘蓝、辣椒和土壤等样品中残留的HPLC检测方法，但仅建立了螺虫乙酯及1种代谢物 (B-enol) 的检测方法，且其定量限分别为0.05 mg/kg及0.03 mg/kg，无法满足农产品安全检测分析的要求。Zhu等[14]采用UPLC-MS/MS建立了多种蔬菜和水果中螺虫乙酯及4种代谢物残留的检测方法，与前人的研究[12-13]相比，该方法有效提高了对螺虫乙酯及4种代谢物检测的灵敏度及准确度 (定量限为0.003 0~0.009 0 mg/kg)，但未对样品前处理过程进行系统的优化，导致基质效应干扰较大。此外，相关研究表明，螺虫乙酯在环境中的主要水解产物为B-enol[15-16]，其毒性与母体化合物相近，均会引起雄性大鼠的生殖毒性，对水生生物也具有一定的毒性[17]。为了有效研究螺虫乙酯及代谢物在蔬菜、水果、土壤和水体等环境介质中的残留和归趋，评估螺虫乙酯在农产品上使用的安全性，亟待建立一套准确、可靠的检测方法，实现对螺虫乙酯及代谢物的有效监测。但目前关于螺虫乙酯及代谢物在水体中的残留检测方法尚未见报道。本研究采用QuEChERS及固相萃取法，拟通过优化螺虫乙酯及4种代谢物的LC-MS/MS检测条件及样品前处理方法，建立菠菜、土壤及水体中螺虫乙酯及4种代谢物残留的LC-MS/MS检测方法，以期为系统评估螺虫乙酯的环境风险及农产品安全检测提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂Agilent 1200-6460型三重串联四极杆液相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；BS210S型电子天平 (精确至0.000 1 g)，德国Sartorius公司；H/T-16MM台式高速离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；Milli-Q超纯水器，美国Millipore公司；SB25-12DTN型超声波清洗机，宁波新芝生物科技有限公司。Oasis HLB固相萃取柱 (1 g/6 mL)，沃特世科技 (上海) 有限公司；ProElut-NH2固相萃取柱 (1 g/6 mL) 及ProElut-C18固相萃取柱 (1 g/6 mL)，迪马科技有限公司。
螺虫乙酯 (spirotetramat，纯度99.2%) 及其代谢物B-enol (纯度99.1%)、B-keto (纯度94.8%)、B-mono (纯度98.2%) 和B-glu (纯度98.6%) 标准品，美国Sigma-Aldrich公司；N-丙基乙二胺 (PSA)、石墨化炭黑 (GCB)、甲醇、乙腈 (色谱纯)，美国Tedia公司；二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、无水硫酸镁和氯化钠 (分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；试验用水均由Milli-Q超纯水器制备。
1.2 标准溶液配制单个标准溶液的配制：分别准确称取5.0 mg螺虫乙酯及4种代谢物标准品，用乙腈溶解，配成质量浓度为100 μg/mL的标准储备液，于–18 ℃保存，备用。
混合标准溶液的配制：分别移取5 mL上述单个标准储备液，用乙腈稀释，配制成10 mg/L的混合标准溶液，之后用乙腈逐级稀释，分别配成1、0.5、0.05、0.01和0.002 mg/L的混合标准溶液，用于绘制标准曲线，并于–18 ℃保存，备用。
基质匹配标准溶液的配制：分别移取5 mL上述单个标准储备液，用乙腈稀释，配成10 mg/L的混合标准溶液，之后用空白样品提取液逐级稀释，分别配成1、0.5、0.05、0.01和0.002 mg/L的混合基质匹配标准溶液，用于绘制基质匹配标准曲线。
1.3 菠菜、土壤及水体样品前处理方法菠菜及土壤：均采自扬州大学试验农场，未检出目标化合物，采用QuEChERS法制备、净化样品[18-19]。分别称取5.0 g菠菜或土壤样品于50 mL塑料离心管中，冷冻干燥24 h，加入5 mL 0.1%甲酸-乙腈溶液，漩涡3 min后，添加1.5 g氯化钠和6 g无水硫酸镁，于4 000 r/min下离心5 min；取2 mL上层清液，加入150 mg无水硫酸镁和50 mg的m (PSA) : m (GCB) = 1 : 1，于4 000 r/min下离心5 min；取1 mL上清液，浓缩干燥，用1 mL的V (乙腈) : V (水) = 95 : 5溶液溶解，过0.22 μm有机滤膜，在多反应监测 (MRM) 模式下进行LC-MS/MS检测分析。
水样：采自扬州大学试验农场池塘，未检出目标化合物，采用固相萃取法制备、净化样品。用5 mL V (二氯甲烷) : V (乙酸乙酯) = 1 : 1的混合溶液活化NH2固相萃取柱后，逐滴加入5 mL水样，再用5 mL V (二氯甲烷) : V (乙酸乙酯) = 1 : 1的混合溶液淋洗2次，最后用10 mL二氯甲烷洗脱；收集洗脱液，用氮气吹干，再用1 mL V (乙腈) : V (水) = 95 : 5溶液溶解，过0.22 μm有机滤膜，在多反应监测 (MRM) 模式下进行LC-MS/MS检测分析。
1.4 螺虫乙酯及4种代谢物在菠菜、土壤及水体中的添加回收试验分别称取5.0 g空白菠菜样品或土壤样品于50 mL离心管中，各加入一定量的螺虫乙酯及4种代谢物的混合标准溶液，添加水平分别为0.05、0.5和1 mg/kg。同时设置空白对照，每处理重复6次。计算添加回收率及相对标准偏差。
准确称取5.0 mL水样于50 mL离心管中，加入一定量的螺虫乙酯及4种代谢物的混合标准溶液，添加水平分别为0.005、0.05和0.5 mg/L。同时设置空白对照，每处理重复6次。计算添加回收率及相对标准偏差。
1.5 螺虫乙酯及4种代谢物的LC-MS/MS检测条件色谱条件：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱 (4.6 mm × 150 mm，5 μm)，柱温25 ℃；进样量5 μL。流动相：乙腈-0.5%甲酸水 (V/V) 溶液，采用梯度洗脱：0 min，5%乙腈；3 min，95%乙腈；15 min，5%乙腈；16 min，95%乙腈；20 min，95%乙腈。流速0.3 mL/min。
质谱条件：去簇电压为–120 V，干燥气体温度300 ℃，干燥气体流速10 L/min，雾化气压力103.4 kPa (15 psi)，鞘气温度250 ℃，鞘气流量7 L/min，毛细管电压4 kV，喷嘴电压500 V。负离子扫描；多反应监测模式 (MRM)。
1.6 数据分析根据公式 (1) 计算螺虫乙酯及4种代谢物的残留量。
| $W = \frac{{{c_{_{\rm S}}} \times {A_{\rm x}} \times V}}{{{A_{_{\rm S}}} \times {m}}}$ | (1) |
式中：W为螺虫乙酯及4种代谢物的残留量 (mg/kg)，cS为标准溶液中螺虫乙酯及4种代谢物的质量浓度 (mg/L)，As为混合标准溶液中螺虫乙酯及4种代谢物定量离子的峰面积，V为提取液体积 (L)，Ax为样品溶液中螺虫乙酯及4种代谢物定量离子的峰面积，m为样品质量 (kg)。
2 结果与分析 2.1 螺虫乙酯及4种代谢物LC-MS/MS检测条件优化2.1.1 流动相的选择 分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.5%甲酸水溶液3组流动相体系对螺虫乙酯及代谢物的分离效果。结果表明：选用甲醇-水作为流动相时，目标化合物的峰形拖尾现象明显，且个别化合物出现分叉；以乙腈-水作为流动相时，目标化合物峰形和分离度虽较好，但个别目标化合物响应值偏低；而选用乙腈-0.5%甲酸水溶液作为流动相时，色谱峰形和分离度最好 (图1)，保留时间分别为：B-glu 9.98 min，B-mono 12.40 min，B-enol 12.92 min，B-keto 13.33 min，螺虫乙酯15.25 min，且目标化合物在0.05 mg/L下均获得较好的响应值。因此选择乙腈-0.5%甲酸水溶液作为螺虫乙酯及4种代谢物LC-MS/MS检测的流动相体系。
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图 1 螺虫乙酯及4种代谢物总离子流色谱图 (0.05 mg/L) Fig. 1 Total ion chromatogram of spirotetramat and its four metabolites (0.05 mg/L) |
2.1.2 质谱条件优化 以乙腈-0.5%甲酸水溶液为流动相，采用流动注射方式将螺虫乙酯及代谢物混合标准溶液直接进样，通过负离子扫描，多反应监测模式，选择相对丰度较高的离子对，确定为定性、定量离子对，并优化去簇电压、碰撞电压等质谱参数。相关LC-MS/MS检测参数见表1。
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表 1 螺虫乙酯及4种代谢物的LC-MS/MS检测参数 Table 1 The LC-MS/MS parameters for spirotetramat and its four metabolites |
2.2 方法的线性范围及检测限
采用外标法定量，按1.5节的条件测定。分别以螺虫乙酯及4种代谢物的质量浓度为x轴，以其定量离子峰面积为y轴，绘制标准曲线。结果 (表2) 表明：在0.002~1 mg/L范围内，螺虫乙酯及4种代谢物的质量浓度与对应的峰面积间呈现良好的线性关系，r在0.996 7~0.999 7之间。分别以各化合物色谱峰3倍信噪比 (S/N = 3) 和10倍信噪比 (S/N = 10) 得到该检测条件下各化合物的检出限 (LOD) 和定量限 (LOQ) 见表2。
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表 2 螺虫乙酯及4种代谢物的线性方程、检出限及定量限 Table 2 Linear equation, LOD and LOQ for spirotetramat and its four metabolites |
2.3 菠菜及土壤样品前处理方法优化
菠菜及土壤基质成分复杂，不仅干扰目标化合物的提取效率，而且会影响目标化合物的测定及对色谱柱产生影响，因此本研究考察了不同提取溶剂、吸附剂及其用量对菠菜及土壤样品中螺虫乙酯及4种代谢物提取及净化效率的影响，在0.05 mg/kg添加水平下对菠菜及土壤样品前处理方法进行了优化。
2.3.1 提取溶剂的选择 分别考察了甲醇、乙腈以及0.1%甲酸-乙腈溶液作为提取溶剂对螺虫乙酯及4种代谢物提取效果的影响。结果 (图2) 表明：3种提取溶剂对螺虫乙酯及4种代谢物的提取能力依次为甲醇 < 乙腈 < 0.1%甲酸-乙腈溶液；不同提取溶剂下，螺虫乙酯及4种代谢物在菠菜及土壤样品中的平均添加回收率分别为74%和73% (甲醇)，86%和85% (乙腈)，92%和89% (0.1%甲酸-乙腈溶液)。适当改变溶液的酸碱度，可提高溶剂的提取效率。综合考虑，采用0.1%甲酸-乙腈溶液作为菠菜及土壤样品前处理方法的提取溶剂。
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图 2 提取溶剂对螺虫乙酯及代谢物添加回收率的影响 Fig. 2 Effects of extract solvents on the recoveries of spirotetramat and its metabolites |
2.3.2 吸附剂及其用量选择 在采用0.1%甲酸-乙腈溶液作为提取溶剂条件下，研究了不同吸附剂[PSA、GCB及m (PSA) : m (GCB) = 1 : 1]及其不同添加量 (25、50、75、100 mg) 对样品中目标物提取效率及色素等杂质去除效果的影响。结果表明：3种吸附剂均能够去除样品中色素等杂质，但去除效果各不相同，其中m (PSA) : m (GCB) = 1 : 1净化效果最佳。随吸附剂添加量的增加，样品中杂质去除效率提高，但螺虫乙酯及代谢物的回收率降低，当添加量为100 mg时，各处理中螺虫乙酯及代谢物的回收率均低于80% (图3和图4)。综合考虑，采用m (PSA) : m (GCB) = 1 : 1作为菠菜及土壤样品前处理中的吸附剂，最适用量为50 mg。
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图 3 吸附剂及其用量对菠菜中螺虫乙酯及代谢物添加回收率的影响 Fig. 3 Effects of different absorbents and its dosage on the recoveries of spirotetramat and its metabolites in spinach |
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图 4 吸附剂及其用量对土壤中螺虫乙酯及代谢物添加回收率的影响 Fig. 4 Effects of different absorbents and its dosage on the recoveries of spirotetramat and its metabolites in soil |
2.4 水样前处理方法优化
由于目标化合物在水体中的含量较低，且水体中基质较为复杂。为有效提高水样中目标化合物的准确度及精密度，采用固相萃取法进行富集浓缩和净化处理，考察了不同固相萃取柱、洗脱溶剂及其用量对水体中螺虫乙酯及4种代谢物提取及净化效率的影响，在0.05 mg/kg添加水平下对水体样品前处理方法进行了优化。
2.4.1 固相萃取柱的选择 分别考察了NH2、C18和HLB固相萃取柱对水体中螺虫乙酯及4种代谢物的提取效率和净化效果。其中，NH2柱经5 mL V (二氯甲烷) : V (乙酸乙酯) = 1 : 1混合溶液活化[20]，C18和HLB柱依次经5 mL甲醇和5 mL水活化。加入5 mL水样，分别用5 mL V (二氯甲烷) : V (乙酸乙酯) = 1 : 1混合溶液淋洗柱2次，最后用5 mL二氯甲烷进行洗脱[21]。按照Matuszewski等[22]的方法，就3种固相萃取柱对水体中螺虫乙酯及代谢物的基质效应进行分析。结果 (表3) 表明，HLB柱虽能有效去除样品中基质效应，但目标化合物的添加回收率较低，其中B-glu的添加回收率仅为63%；NH2及C18柱对目标化合物的回收率均大于80%，但C18柱对水样中杂质的去除效果较差，基质效应明显。因此选择NH2固相萃取柱用于水体样品前处理。
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表 3 固相萃取柱对水体中螺虫乙酯及代谢物基质效应和添加回收率的影响 Table 3 Influence of solid phase extraction columns on the matrix effects and recoveries of spirotetramat and its metabolites in water |
2.4.2 洗脱剂及其用量选择 在以NH2柱作为水体样品前处理的固相萃取柱条件下，研究了不同洗脱剂 (二氯甲烷、乙酸乙酯及正己烷) 及其不同添加量 (5、10、15及20 mL) 对样品中目标化合物洗脱效率的影响。结果表明：二氯甲烷的洗脱效果最明显，添加回收率均大于80%，显著高于正己烷；随洗脱剂用量的增加，其添加回收率不断提高，但当洗脱剂用量高于10 mL时目标化合物的添加回收率无明显变化 (图5)。综合考虑，选用二氯甲烷作为水体样品固相萃取的洗脱剂，其用量为10 mL。
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图 5 洗脱剂及其用量对水体中螺虫乙酯及代谢物添加回收率的影响 Fig. 5 Effects of different elution solvent and its dosage on the recoveries of spirotetramat and its metabolites |
2.5 方法的准确度与精密度
结果表明：在0.05、0.5和1 mg/kg添加水平下，螺虫乙酯及4种代谢物在菠菜中的回收率为81%~103%，相对标准偏差 (RSD) 为1.7%~7.9%；在土壤中的回收率为82%~98%，RSD为1.9%~7.6% (表4)。在0.005、0.05和0.5 mg/L添加水平下，螺虫乙酯及4种代谢物在水体中的回收率为82%~95%，RSD为1.5%~6.2% (表5)。结果符合农药残留检测要求[9]。
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表 4 螺虫乙酯及代谢物在菠菜及土壤中的添加回收率及相对标准偏差 (n = 6) Table 4 The recoveries of spirotetramat and its metabolites from spinach and soil samples (n = 6) |
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表 5 螺虫乙酯及代谢物在水体中的添加回收率及相对标准偏差 (n = 6) Table 5 The recoveries and RSDs of spirotetramat and its metabolites from the water (n = 6) |
3 结论与讨论
本研究采用QuEChERS及固相萃取样品前处理方法，结合液相色谱-三重四极杆串联质谱技术，以及负离子扫描和多反应监测模式，建立了菠菜、土壤及水体中螺虫乙酯及4种代谢物残留的检测方法。通过对质谱检测条件的优化表明，以乙腈-0.5%甲酸水溶液作为流动相时，采用梯度洗脱，色谱分离度及灵敏度最好。通过对样品前处理条件的考察，以0.1%甲酸-乙腈作为提取溶剂，经50 mg m (PSA) : m (GCB) = 1 : 1净化处理后，在0.05、0.5和1 mg/kg添加水平下，螺虫乙酯及4种代谢物在菠菜中的回收率为81%~103%，相对标准偏差 (RSD) 为1.7%~7.9%；在土壤中的回收率为82%~98%，RSD为1.9%~7.6%，符合农药残留检测要求[9]；采用NH2柱作为固相萃取柱，10 mL二氯甲烷进行洗脱，螺虫乙酯及4种代谢物在水体中的添加回收率为82%~95%。本方法与Mohapatra及Singh等[12-13]的方法相比，在结合螺虫乙酯自身理化性质的同时，通过适当提高提取溶剂的酸度，有效提高了目标化合物的提取效率；与Zhu等[14]的方法相比，在吸附剂的选择上，采用PSA与GCB相结合，提高了净化效率，有效减弱了样品基质效应的干扰。综上所述，本方法具有检测限低、线性关系良好和回收率高等优点，适用于菠菜、土壤及水体中螺虫乙酯及4种代谢物残留的同时检测。
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