2017, Vol. 19
2. 西北农林科技大学 陕西省植物源农药研究与开发重点实验室，陕西 杨凌 712100
2. Shaanxi Province Key Laboratory Research & Development on Botanical Pesticides, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China
从植物内生菌次生代谢物中筛选抗菌、杀虫和除草活性农用抗生素，是新型生物农药研发的一个重要途径[1-2]。前期研究中，笔者所在课题组从冬青卫矛中分离鉴定出一株内生真菌Cylindrocarpon olidum W1，发现其代谢产物对多种植物病原细菌和真菌均有明显的抗菌活性[3]。Cylindrocarpon (柱孢属) 真菌是人参和西洋参锈腐病的重要病原菌，其主要代谢产物为具有抗癌活性的酚醛倍半萜类化合物[4]。为了明确C. olidum W1活性代谢物的结构，在抑菌活性追踪指导下，笔者从其代谢产物中分离鉴定出8个具有抑菌活性化合物，经高分辨质谱、核磁共振波谱等技术将其鉴定为壳二孢氯素 (ascochlorin) 及其类似物。现将部分结果报道如下。
1 材料与方法 1.1 供试材料1.1.1 菌株 Cylindrocarpon olidum W1，保存于西北农林科技大学农药研究所。
1.1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，用于C. olidum W1菌株斜面、平板培养及病原真菌培养；
马铃薯葡萄糖液体培养基：土豆200 g，蛋白胨0.5 g，葡萄糖10 g，乙酸钠1.66 g，蔗糖10 g，MgSO4·7H2O 1.02 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，用于C. olidum W1菌株摇瓶发酵；
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10 g、氯化钠5.0 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.0~7.2及Mueller-Hinton肉汤培养基 (杭州大和微生物试剂有限公司) 用于病原细菌培养。
所有培养基在121 ℃、1 × 105 Pa下灭菌30 min，备用。
1.1.3 供试病原细菌 白菜软腐病菌Erwinia carotovora、猕猴桃溃疡病菌Pseudomonas syringae和水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzae由西北农林科技大学植物病理研究室提供；烟草青枯病菌Ralstonia solanacearum由西南大学植物保护学院提供。将病原细菌接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，于37 ℃下培养1 d。
1.1.4 供试病原真菌 番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、苹果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、玉米弯孢病菌Curvularia lunata、烟草赤星病菌Alternaria alternate、茄子黄萎病菌Verticillium dahlia、油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum和苹果树腐烂病菌Valsa mali由西北农林科技大学农药研究所提供；棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum由西北农林科技大学植物病理研究室提供。将病原真菌接种于PDA培养基，于25 ℃下培养3~7 d。
1.1.5 主要仪器及试剂 分析型HPLC系统：Shimadzu LC-6AD高效液相色谱仪，具二极管阵列检测器，日本岛津公司；制备型HPLC系统：LC3000高效液相色谱仪，配紫外检测器，北京创新通恒科技有限公司；Bruker APEX Ⅱ质谱仪和Bruker RPX 500 MHz核磁共振仪，德国布鲁克公司；WPR熔点仪，上海精科仪器有限公司；Synergy超纯水系统，美国密理博公司。
甲醇 (HPLC级)(美国Tedia公司)；200~300目 (粒径54~74 μm) 硅胶 (青岛海洋化工厂)；氨苄青霉素 (USP级)(上海国药集团化学试剂有限公司)；嘧菌酯 (azoxystrobin)，(百灵威科技有限公司)；石油醚、乙酸乙酯均为市售分析纯。
1.2 试验方法1.2.1 种子液制备 将斜面保存的W1菌株接种于PDA平板培养基上，于25 ℃恒温培养7 d，无菌条件下，将活化好的平板制成3 cm × 3 cm菌饼接种于100 mL马铃薯葡萄糖液体培养基中，于180 r/min、25 ℃振荡培养16 h。
1.2.2 发酵液制备 将制备好的种子液以体积分数为20%的量接种于100 mL马铃薯葡萄糖液体培养基中，于180 r/min、25 ℃振荡培养12 d。
1.2.3 活性成分的分离及鉴定 将50 L发酵液用多层纱布过滤后收集菌体，置于 –70 ℃冰箱中冷冻24 h，转移至冻干机中冻干。冻干后的菌丝体以甲醇为溶剂超声提取2次，每次1 h；合并有机相，减压浓缩，浓缩液用少量硅胶拌匀晾干后进行硅胶柱层析，依次用V (石油醚):V (乙酸乙酯)=9:1~1:1、乙酸乙酯、V (乙酸乙酯):V (甲醇)=9:1~1:1及甲醇梯度洗脱。每200 mL收集1份，经薄层层析 (TLC) 检测后合并相同组分，共得6个馏分Fr01-Fr06，其中Fr02为一纯化合物W1-6 (10.5 g)。以烟草青枯病菌R. solanacearum 为活性指示菌，采用滤纸片法进行抑菌活性追踪测试，将活性组分Fr01 (2.34 g) 和Fr03 (1.21 g) 采用反相高效液相色谱进行制备纯化，分别得化合物W1-1~W1-5 (214、389、154、261和94 mg)、W1-7 (394 mg) 和W1-8 (287 mg)。采用1 H NMR、13 C NMR和ESI-MS等技术对其进行结构鉴定。
1.2.4 抑菌活性测定
1.2.4.1 对病原细菌的抑制作用 采用微量稀释法[5]。从琼脂培养基中挑取4~5个相同形态的供试菌菌落，接入1.0 mL灭菌的Mueller-Hinton肉汤中，于35 ℃培养至轻度混浊后转入0.9%生理盐水中，调整到麦氏浊度为0.5，再用Mueller-Hinton肉汤稀释200倍，其接种量相当于7.5 × 105 cfu/mL。将稀释好的接种液转入96孔板中，每孔100 μL，再分别加入100 μL不同质量浓度的药液，使最终浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78和0.39 μg/mL，每板另设不加药剂的空白对照、氨苄青霉素 (Ampicillin) 阳性对照和加药不接菌阴性对照。每处理重复3次。于35 ℃培养20 h，记录药剂对供试细菌的最低抑菌浓度 (MIC)。
1.2.4.2 对病原真菌的抑制作用 采用菌丝生长速率法[6]。准确称取10 mg待测化合物，先用500 μL二甲基亚砜 (DMSO) 溶解后，用无菌水配制成质量浓度为10 mg/mL的母液。用无菌水将供试药液母液进行梯度稀释，得到系列浓度药液。将1.0 mL药液与9.0 mL融化的PDA培养基混匀，倒入无菌培养皿中制成带药培养基平板。待培养基凝固后，在每个培养基平面接入1个供试真菌菌饼 (直径为4 mm)，使带菌丝的一面贴在培养基表面。每处理3次重复。于25 ℃恒温箱中培养72~96 h，用十字交叉法测量菌落生长直径，按 (1) 式计算菌丝生长抑制率。
| ${\text{菌丝生长抑制率}}/{\text{%}} =\frac{\text{对照菌落直径} - \text{处理菌落直径}}{\text{对照菌落直径} - \text{菌饼直径}} \times 100$ | (1) |
所得数据用SPSS软件求出毒力回归方程及抑制中浓度 (EC50值) 及相关性分析。
2 结果与分析 2.1 活性成分分离及结构鉴定以抑菌活性追踪为指导，经大孔吸附树脂吸附，甲醇解析，硅胶柱层析等方法从菌株C. olidum W1发酵产物中分离出8个活性化合物W1-1~W1-8，经高分辨质谱、核磁共振波谱等技术将其鉴定为壳二孢氯素及其类似物，其结构见图式1，相关核磁共振氢谱和碳谱数据见表1和表2。
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图式 1 Ascochlorin及其类似物的结构 Scheme1 Structure of Ascochlorin and its analogues |
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表 1 化合物W1-1~W1-8的核磁共振氢谱数据 Table 1 1H NMR data of W1-1–W1-8 in CDCl3 |
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表 2 化合物W1-1~W1-8的核磁共振碳谱数据 Table 2 13C NMR data of W1-1–W1-8 |
W1-1，淡黄色晶体，C23H31ClO3，熔点：71~72 ℃ (文献值[7]：72~72.5 ℃)；UV (λMeOH)：202，229，293，368 nm；HRMS：[M–H]–，m/z 389.187 9 (计算值：389.188 3)，相对分子质量为390。1H、13C NMR数据与Hosono等[8]报道的Ilicicolin A基本一致，故将化合物W1-1鉴定为Ilicicolin A。
W1-2，淡黄色粉末，C18H23ClO3，熔点：88.1~88.4 ℃ (文献值[9]：88 ℃)；UV(λMeOH)：204，228，293 nm；HRMS：[M–H]–，m/z 321.126 1 (计算值：321.125 7)，相对分子质量为322。1H、13C NMR数据与Singh等[4]报道的5-chlorocolletorin B基本一致，故将化合物W1-2鉴定为5-chlorocolletorin B。
W1-3，淡黄色粉末，C23H31O3，熔点：97~98 ℃ (文献值[7]：97~98.5 ℃)；UV(λMeOH)：206，298 nm；HRMS：[M–H]–，m/z 354.219 9 (计算值：354.219 5)，相对分子质量为355。1H、13C NMR数据与Guo等[10]报道的Ilicicolin B基本一致，故将化合物W1-3鉴定为Ilicicolin B。
W1-4，无色晶体，C23H31ClO5，熔点：136.5~138.1 ℃ (文献值[11]：138 ℃)；UV(λMeOH)：206，228，293，337 nm；HRMS：[M–H]–，m/z 421.177 9 (计算值：421.178 2)，相对分子质量为422。1H、13C NMR数据与Seephonkai等[12]报道的Deacetylchloronectrin基本一致，故将化合物W1-4鉴定为Deacetylchloronectrin。
W1-5，淡黄色晶体，C23H31ClO4，熔点：135.1~136.5 ℃ (文献值[7]：134~136 ℃)；UV(λMeOH)：206，228，294 nm；HRMS：[M–H]–，m/z 405.183 0 (计算值：405.183 3)，相对分子质量为406。1H、13C NMR数据与Gutiérrez等[13]报道的Ilicicolin C基本一致，故将化合物W1-5鉴定为Ilicicolin C。
W1-6，C23H29ClO4，淡黄色晶体，熔点：151~153 ℃ (文献值[7]：153~154 ℃)；UV (λMeOH)：206，222，298 nm；HRMS：[M–H]–，m/z 406.167 9 (计算值：403.167 6)，相对分子质量为404。1H、13C NMR数据与Takamatsu等[14]报道的Ascochlorin基本一致，故将化合物W1-6鉴定为Ascochlorin。
W1-7，无色油状，C28H39ClO6，UV(λMeOH)：209，225，291 nm；HRMS：[M–H]–，m/z 505.235 5 (计算值：505.235 7)，相对分子质量为506。1H、13C NMR数据与Singh等[4]报道的Cylindrol A4基本一致，故将化合物W1-7鉴定为Cylindrol A4。
W1-8，无色油状，C23H30O4，UV(λMeOH)：205，222，298 nm；HRMS：[M–H]–，m/z 369.207 0 (计算值：369.206 6)，相对分子质量为370。1H、13C NMR数据与Singh等[4]报道的Cylindrol B基本一致，故将化合物W1-8鉴定为Cylindrol B。
2.2 化合物的抑菌活性2.2.1 对病原细菌的抑制作用 由表3可以看出，W1-1~W1-8对供试4种农业病原细菌的抑菌活性差异较大，其中，对烟草青枯病菌的抑制活性较为明显，其MIC值分别为6.25、3.13、> 100、3.13、6.25、12.5、25 和25 μg/mL，对白菜软腐病菌抑菌活性较差，其MIC值均 ≥ 50 μg/mL。化合物W1-2、W1-4和W1-5的抑菌活性优于其余化合物。
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表 3 目标化合物对4种农业病原细菌的MIC值 Table 3 MIC values of target compounds against four strains of agricultural bacteria |
2.2.2 对植物病原真菌的抑制作用 由表4可以看出，目标化合物对供试的9种植物病原真菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用，其中对番茄灰霉病菌和油菜菌核病菌菌丝生长的抑制作用尤为明显。与抗细菌活性类似，化合物W1-2、W1-4和W1-5的抗真菌活性亦明显高于其余化合物。进一步毒力测定结果表明 (表5)，化合物W1-2、W1-4及W1-5对番茄灰霉病菌的IC50值分别为36.45、21.60和26.69 μg/mL；对油菜菌核病菌的IC50值分别为20.21、16.79 和12.11 μg/mL。
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表 4 目标化合物对9种供试病原真菌菌丝生长的抑制作用 (100 μg/mL) Table 4 Inhibition effect of target compounds against the mycelial growth of nine tested fungi (100 μg/mL) |
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表 5 目标化合物对供试植物病原真菌的毒力 Table 5 Toxicity of target compounds against tested fungi |
3 讨论
壳二孢氯素属于异戊烯酚类抗生素，研究发现，该类抗生素具有多种生物学活性，如抗真菌、杀灭疟原虫和杰氏肺囊虫、抑制肿瘤细胞增殖等[15]。壳二孢氯素最初由日本学者Tamura[16]于1968年从丝孢纲壳二孢属真菌蚕豆壳二孢的代谢产物中分离得到。1994年，Takamatsu[14]又于日本静冈土壤真菌Verticillium sp. FO-2787的菌丝体中分离得到该化合物。壳二孢氯素作用于真菌线粒体，通过抑制微生物的呼吸作用破坏其能量代谢，与目前大多数呼吸电子链抑制剂仅选择性地作用于Q0或Qi位点不同，壳二孢氯素同时可结合于Q0和Qi两个作用位点[17]。作用靶标单一的杀菌剂面临的重要问题就是抗性问题，如甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。从作用机理上来看，壳二孢氯素属于多靶点杀菌剂，与大多数呼吸抑制剂相比更不容易产生抗药性。本研究从冬青卫矛内生真菌C. olidum W1中分离鉴定出壳二孢氯素及多个类似物，首次系统评价了其对多种农业致病细菌和致病真菌的抑菌活性，丰富了壳二孢氯素及其类似物的农用生物活性。结果表明，该类化合物的抑菌活性与其侧链异戊烯基的长短有关 (如化合物W1-2抑菌活性明显高于W1-1)，同时受侧链C11-C12化学键类型影响较大，C11-C12为不饱和碳碳双键时活性较差，为饱和碳碳单键时抑菌活性明显提高 (W1-4和W1-5抑菌活性明显高于W1-6)。这一结果为新型微生物农药的开发提供了素材和理论依据。
| [1] |
曹艳, 魏少鹏, 姬志勤. 冬青卫矛内生放线菌Streptomyces flavofuscus G1发酵液中抑菌活性成分研究
[J]. 农药学学报, 2015, 17(5): 616–621.
CAO Y, WEI S P, JI Z Q. Investigation on antimicrobial compounds from fermentation broth of Streptomyces flavofuscus G1, an endophyte isolated from Euonymus japonicas [J]. Chin J Pestic Sci, 2015, 17(5): 616–621. |
| [2] |
俞晓平, 陈列忠, 申屠旭萍. 植物内生菌及其代谢物在生物农药创制中的应用[J]. 浙江农业学报, 2006, 18(5): 289–293.
YU X P, CHEN L Z, SHENTU X P. Review on plant endophyte and its secondary metabolites in the application of producing bio-pesticides[J]. Acta Agric Zhejiangensis, 2006, 18(5): 289–293. |
| [3] |
曹艳. 冬青卫矛内生菌的分离及其活性代谢物研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2016.
CAO Y. Investigation on endophytes of Euonymus japonicas and its bioactive metabolites[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2016. |
| [4] | SINGH S B, BALL R G, BILLS G F, et al. Chemistry and biology of cylindrols: novel inhibitors of ras farnesyl-protein transferase from Cylindrocarpon lucidum [J]. J Org Chem, 1996, 61(22): 7727–7737. doi:10.1021/jo961074p |
| [5] | Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for Bacteria that grow aerobically; approved standard[S]. 8th ed. Wayne, PA, USA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2009. |
| [6] |
吴文君. 植物化学保护实验技术导论[M]. 西安: 陕西科学与技术出版社, 1988.
WU W J. Introduction to experimental techniques of plant chemical protection[M]. Xi’an: Shanxi Scientific & Technical Press, 1988. |
| [7] | HAYAKAWA S, MINATO H, KATAGIRI K. The ilicicolins, antibiotics from Cylindrocladium ilicicola [J]. J Antibiot, 1971, 24(9): 653–654. doi:10.7164/antibiotics.24.653 |
| [8] | HOSONO K, OGIHARA J, OHDAKE T, et al. LL-Z1272α epoxide, a precursor of ascochlorin produced by a mutant of Ascochyta viciae [J]. J Antibiot, 2009, 62(10): 571–574. doi:10.1038/ja.2009.80 |
| [9] | HUSSAIN H, DROGIES K HHeinz, AL-HARRASI A, et al. Antimicrobial constituents from endophytic fungus Fusarium sp. [J]. Asian Pac J Trop Dis, 2015, 5(3): 186–189. doi:10.1016/S2222-1808(14)60650-2 |
| [10] | GUO R H, ZHANG Y T, DUAN D, et al. Fibrinolytic evaluation of compounds isolated from a marine fungus Stachybotrys longispora FG216 [J]. Chin J Chem, 2016, 34(11): 1194–1198. doi:10.1002/cjoc.v34.11 |
| [11] | SASAKI H, HOSOKAWA T, NAWATA Y, et al. Isolation and structure of ascochlorin and its analogs[J]. Agric Biol Chem, 1974, 38(8): 1463–1466. doi:10.1080/00021369.1974.10861351 |
| [12] | SEEPHONKAI P, ISAKA M, KITTAKOOP P, et al. A Novel ascochlorin glycoside from the insect pathogenic fungus Verticillium hemipterigenum BCC 2370 [J]. J Antibiot, 2004, 57(1): 10–16. doi:10.7164/antibiotics.57.10 |
| [13] | GUTIEÁRREZ M, THEODULOZ C, RODRIÁGUEZ J, et al. Bioactive metabolites from the fungus Nectria galligena, the main apple canker agent in Chile [J]. J Agric Food Chem, 2005, 53(20): 7701–7708. doi:10.1021/jf051021l |
| [14] | TAKAMATSU S, RHO M C, MASUMA R, et al. A novel testosterone 5α-reductase inhibitor, 8′, 9′-dehydroascochlorin produced by Verticillium sp. FO-2787 [J]. Chem Pharm Bull, 1994, 42(4): 953–956. doi:10.1248/cpb.42.953 |
| [15] |
刘小宇. 两株真菌的次生代谢产物结构鉴定及生物学活性研究[D]. 上海: 第二军医大学, 2016.
LIU X Y. Researches on structure elucidation and biological activities investigation of secondary metabolites of two polar fungi[D]. Shanghai: The Second Military Medical University, 2016. |
| [16] | TAMURA G, SUZUKI S, TAKATSUKI A, et al. Ascochlorin, a new antibiotic, found by paper-disc agar-diffusion method. I: isolation, biological and chemical properties of ascochlorin (studies on antiviral and antitumor antibiotics. I)[J]. J Antibiot, 1968, 21(9): 539–544. doi:10.7164/antibiotics.21.539 |
| [17] | BERRY E A, HUANG L S, LEE D W, et al. Ascochlorin is a novel, specific inhibitor of the mitochondrial cytochrome bc1 complex [J]. Biochim Biophys Acta, 2010, 1797(3): 360–370. doi:10.1016/j.bbabio.2009.12.003 |