2017, Vol. 19
苹果树腐烂病致病菌为 Valsa mali， 是一种分布广、危害重的果树真菌病害[1]。2014 年，薛应钰等[2]对中国甘肃省 12 个县、区 74 个不同树龄苹果园的调查发现，甘肃省苹果树腐烂病发生十分普遍，发病率达到 41.09%，严重影响了该省苹果产业的健康发展。目前，化学防治仍是该病害最常用的控制方法之一[1]，但长期使用化学农药，不仅易污染环境和农产品，而且有可能危害到人体健康[3]。因此，研制开发高效环保的苹果树腐烂病生防制剂已成为植物保护学者关注的热点。
目前，中国已成功开发并投入生产的商品化生防制剂有百抗、麦丰宁、纹曲宁和亚宝等[4]，但针对苹果树腐烂病防治的生物制剂较少。高克祥等[5]和徐涛等[6]研究发现，哈茨木霉 Trichoderma harzianum 及链格孢属 (Alternaria spp.) 真菌对腐烂病菌的生长有抑制作用。薛应钰等[7]从土壤中分离出了对苹果树腐烂病菌有显著抑制效果的放线菌菌株。王卫雄等[8]分离并鉴定了苹果树腐烂病菌的拮抗菌株解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens TS-1203。然而，已有研究均主要集中在生防微生物对苹果树腐烂病菌的抑制作用上，尚未见对生防制剂中助剂和载体的筛选和优化等方面的研究报道。因此，本研究以苹果树腐烂病菌拮抗菌株解淀粉芽孢杆菌 TS-1203 为材料，拟通过对其生防制剂中最佳助剂及载体的筛选，为苹果树腐烂病的生物防治提供参考。
1 材料与方法 1.1 供试材料1.1.1 菌株 苹果树腐烂病菌 Valsa mali 和解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens TS-1203 均由甘肃农业大学植物保护学院植物病原学实验室保存并提供。
1.1.2 离体苹果枝条 采集于甘肃省兰州市西固区苹果园“新红星”健康枝条。
1.1.3 药剂及试剂
表面活性剂：吐温-20 和吐温-80、OP 乳化剂及十二烷基磺酸钠 (SDS)，均为分析纯，分别购自北京 Solarbio 科技有限公司、无锡亚泰联合化工有限公司和北京 Coolaber 科技有限公司。
紫外保护剂：山梨醇-D、木质素磺酸钠和抗坏血酸，均为分析纯，购自天津天辰化工有限公司。
防腐剂：尼泊金甲酯和尼泊金乙酯、凯松及柠檬酸钠，均为分析纯，分别购自天津光复精细化工有限公司、普隆国际贸易 (上海有限公司) 和天津天辰化工有限公司。
载体：有机膨润土，工业纯，河南云创化工产品有限公司；聚乙烯醇 (PVA) 和羟甲基纤维素钠，分析纯，天津光复精细化工有限公司；硅藻土，分析纯，济南智恒致远化工科技有限公司；海藻酸钠和液体石蜡，化学纯，天津方正化学试剂厂和国药集团化学试剂有限公司。
琼脂，北京 Solarbio 科技有限公司；葡萄糖，分析纯，天津光复精细化工有限公司；牛肉浸膏、蛋白胨和酵母浸粉，生物试剂纯，北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.1.4 培养基
营养琼脂 (NA) 培养基[9]：牛肉浸膏 3.0 g，蛋白胨 5.0 g，葡萄糖 2.5 g，琼脂 18 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.2。
普通酵母牛肉蒸馏水 (NYBD) 培养基[9]：牛肉浸膏 8.0 g，酵母浸粉 5.0 g，葡萄糖 10.0 g，蒸馏水 1 000 mL。
马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 培养基[9]：去皮马铃薯 200 g，葡糖糖 20 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 6.5。
1.1.5 主要仪器 ELx 800 酶标仪，Gene Company Limited 公司。
1.2 试验方法1.2.1 解淀粉芽孢杆菌种子液制备 采用何红等[10]的方法。将 TS-1203 菌株在 NA 培养基上于 28 ℃ 活化培养 12~24 h 后，接种于装有 65 mL NYBD 培养基的 150 mL 三角瓶中，于 180 r/min、28 ℃ 振荡培养 12 h，备用。
1.2.2 助剂对 TS-1203 菌株生长的影响 参考贾宇[11]的方法和助剂浓度设定，并略作修改。将不同种类助剂分别按设定浓度 (表 1) 加入到 60 mL 已添加 5 mL TS-1203 种子液的 NYBD 液体培养基中，混合均匀，于 180 r/min、28 ℃ 振荡培养。以未加种子液并分别加入同等浓度各助剂的 NYBD 培养基 (65 mL) 为对照。利用酶标仪测定各处理和对照的吸光度值 (OD 600)。每隔 4 h 测定 1 次，连续测定 13 次。试验重复 3 次。
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表 1 解淀粉芽孢杆菌 TS-1203 生防制剂供试助剂 Table 1 The chemical additives for the bio-control agents B. amyloliquefaciens TS-1203 |
1.2.3 助剂对 TS-1203 抑菌活性的影响 采用贾宇[11]的方法。将不同助剂分别按设定浓度 (表 1) 加入到 60 mL 已添加 5 mL TS-1203 种子液的 NYBD 液体培养基中，混合均匀，于 180 r/min、28 ℃ 振荡培养。从培养开始计时，分别于 8、24、32 和 48 h 时各取 500 μL 培养液于 1 mL 无菌离心管中，4 ℃ 保存备用。采用“牛津杯”法[12]分别测定各培养液对苹果树腐烂病菌的抑制活性。在活化 5 d 后的菌落边缘打取直径 5 mm 的菌饼，接种于 PDA 平板中央，并在距平板中央 2.5 cm 处对称放置两个无菌牛津杯。分别吸取 200 μL 培养液于牛津杯中，置于 25 ℃ 培养箱中恒温黑暗培养，5 d 后测量菌落直径，计算各处理的抑制率。以无菌水代替培养液作为对照，试验重复 3 次。
1.2.4 TS-1203 生防制剂最佳助剂响应面优化 参照陈欣等[13]的方法。根据单因素试验结果筛选出各因素的适宜浓度，并以 TS-1203 对苹果树腐烂病菌的抑制率为响应值，采用 Box-Behnken 方法对该生防制剂的适宜助剂及浓度进行响应面法试验，建立最佳助剂条件并进行验证。
1.2.5 载体对 TS-1203 菌株生长的影响及制剂状态观察 参照汤坚等[14]的方法。按表 2 中比例分别将不同剂量载体加入到发酵液中，搅拌均匀后于 180 r/min、28 ℃ 振荡培养 48 h。吸取 1 mL 培养液并经无菌水稀释至 105 倍，吸取 200 μL 稀释液涂布接种于 NA 培养基上，于 28 ℃、黑暗培养 24 h 后统计菌落数量。以未加载体的发酵液为对照，试验重复 3 次。
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表 2 解淀粉芽孢杆菌 TS-1203 生防制剂供试载体 Table 2 The selected carrier for the bio-control agents B. amyloliquefaciens TS-1203 |
1.3 数据处理
应用 Excel 2007 和 DPS 6.5 软件对数据进行统计分析，并采用 Duncan’s 新复极差法进行差异显著性检验 (P < 0.05)。
2 结果与分析 2.1 TS-1203 生防制剂表面活性剂筛选2.1.1 表面活性剂对 TS-1203 菌株生长的影响 筛选能够保护微生物活性和提高药效的助剂是微生物农药研制的核心[15]。结果表明，不同浓度和不同类型表面活性剂对 TS-1203 菌株生长的影响存在明显差异 (图 1)。其中，OP 乳化剂与 SDS 对 TS-1203 生长的抑制作用较为显著；吐温-20 和吐温-80 对菌株生长呈现先促进后抑制的趋势，但其抑制作用不显著，当吐温-80 质量分数为 0.50% 时，48 h 后 TS-1203 菌株的 OD 600 值为 1.176，显著高于对照 (1.084)。
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A: 吐温-20；B: 吐温-80；C: OP 乳化剂；D: 十二烷基磺酸钠。 A : Tween-20; B: Tween-80; C: Emulsifier OP; D: SDS. 图 1 不同浓度及不同类型表面活性剂对解淀粉芽孢杆菌 TS-1203 菌株生长的影响 Fig. 1 Effect of different types and concentrations of surfactants on Bacillus amyloliquefaciens TS-1203 growth |
2.1.2 表面活性剂对 TS-1203 抑菌活性的影响 供试 4 种不同类型及不同浓度表面活性剂对 TS-1203 抑菌活性的影响均存在差异性 (图 2)。与对照相比，除质量分数为 2.50% 的 SDS 外，OP 乳化剂和 SDS 其余各浓度处理均可显著降低 TS-1203 对苹果树腐烂病菌的抑菌活性，且不受处理时间影响。吐温-20 和吐温-80 各处理也均可降低 TS-1203 的抑菌活性，且不同浓度间差异不明显；随培养时间延长，吐温-20 和吐温-80 各处理组 TS-1203 的抑菌活性均不同程度下降，其中吐温-20 表现更为明显；当吐温-80 质量分数为 0.50% 时，TS-1203 对苹果树腐烂病菌的抑制率最高 (88.90%)，与对照差异不显著，且不受培养时间影响。
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A: 吐温-20； B: 吐温-80； C: OP 乳化剂；D: 十二烷基磺酸钠。A: Tween-20; B: Tween-80; C: Emulsifier OP; D: SDS. 注：图柱上不同小写字母代表不同处理间在 P < 0.05 水平差异显著。Note: Different letters indicate significant difference at P < 0.05 level between the different treatment. 图 2 不同浓度及类型表面活性剂对解淀粉芽孢杆菌 TS-1203 抑菌活性的影响 Fig. 2 The influence of different surfactants and different concentrations on the inhibition rate of B. amyloliquefaciens TS-1203 |
综合上述结果，表明吐温-80 可作为 TS-1203 生防助剂的最适表面活性剂，且其适宜的质量分数为 0.50%。
2.2 TS-1203 生防制剂防腐剂筛选2.2.1 防腐剂对 TS-1203 菌株生长的影响 防腐剂能够延长生防制剂的贮藏期[15]。通过测定各处理菌株生长 (OD 600 值) 随时间变化的趋势，发现不同浓度及不同防腐剂对 TS-1203 菌株生长影响明显 (图 3)，且主要表现为抑制作用，但该抑制作用与防腐剂浓度间无明显相关性。相比较而言，柠檬酸三钠对 TS-1203 菌株生长的抑制作用最弱，当其质量分数分别为 0.05% 和 0.10% 时，菌株 OD 600 值与对照接近，分别为 1.311 和 1.355。凯松虽然在低浓度下抑制作用弱，但其他各浓度下均可明显抑制菌株生长。
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A：尼泊金甲酯；B：尼泊金乙酯；C：柠檬酸三钠；D：凯松。 A: Methylparaben; B: Ethylparaben; C: Sodium citrate; D: Kathon. 图 3 不同防腐剂各浓度下对解淀粉芽孢杆菌 TS-1203 菌株生长的影响 Fig. 3 The influence of different preservatives and different concentrations on the growth of B. amyloliquefaciens TS-1203 |
2.2.2 防腐剂对 TS-1203 抑菌活性的影响 由图 4 可看出，4 种防腐剂中除柠檬酸三钠表现为增强作用，0.05% 凯松无明显影响外，其他各浓度防腐剂均不同程度地降低了 TS-1203 的抑菌活性，其中尼泊金乙酯的降低作用最为明显。由于柠檬酸三钠反而能够增强 TS-1203 的抑菌活性，且不受培养时间影响，当其质量分数为 0.10%、培养 48 h 时，TS-1203 对苹果树腐烂病菌的抑制率达 93.39%，显著高于对照 (P < 0.05)。
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A：尼泊金甲酯；B：尼泊金乙酯；C：柠檬酸三钠；D：凯松。A: Methylparaben; B: Ethylparaben; C: Sodium citrate; D: Kathon. 注：图柱上不同小写字母代表不同处理间在 P < 0.05 水平差异显著。 Note: Different letters indicate significant difference at P < 0.05 level between the different treatment. 图 4 不同防腐剂各浓度下对解淀粉芽孢杆菌 TS-1203 抑菌活性的影响 Fig. 4 The influence of different preservatives and different concentrations on the inhibition rate ofB. amyloliquefaciens TS-1203 |
综合上述结果，表明柠檬酸钠可作为 TS-1203 生防制剂的最适防腐剂，且其适宜的质量分数为 0.10%。
2.3 TS-1203 生防制剂紫外保护剂筛选2.3.1 紫外保护剂对 TS-1203 菌株生长的影响
由图 5 可看出，除抗坏血酸外，山梨醇-D 和木质素磺酸钠均适合作为解淀粉芽孢杆菌 TS-1203 生防制剂的紫外保护剂。其中，山梨醇-D 和木质素磺酸钠对菌株生长的影响均随浓度增大呈先促进后抑制的趋势，但山梨醇-D 的抑制作用较弱。当木质素磺酸钠质量分数为 1.00% 时，其对 TS-1203 菌株生长的抑制作用最强；而当其质量分数为 0.50% 时则促进作用最为明显，48 h 时 OD 600 值最高，达 2.037，显著高于对照。
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A：山梨醇-D；B：木质素磺酸钠；C：抗坏血酸。 A: Sorbitol-D; B: Sodium lignin sulfonate; C: Ascorbic acid. 图 5 不同紫外保护剂各浓度下对解淀粉芽孢杆菌 TS-1203 菌株生长的影响 Fig. 5 The influence of different UV protective agents and different concentrations on the growth of B. amyloliquefaciens TS-1203 |
2.3.2 紫外保护剂对 TS-1203 抑菌活性的影响 由图 6 可看出：当抗坏血酸质量分数为 0.10% 时，TS-1203 对苹果树腐烂病菌的抑制率较高，为 78.64%，与对照差异不显著 (P > 0.05)；而其他各浓度下则均能显著降低 TS-1203 的抑菌活性，与对照差异显著 ( P < 0.05)，且不受培养时间影响。不同浓度山梨醇-D 对 TS-1203 抑菌活性的影响不同，并受培养时间影响，但整体呈先增强后微弱抑制趋势。木质素磺酸钠除质量分数为 1.00% 时能明显降低 TS-1203 的抑菌活性外，其余各浓度均表现出不同程度的增强作用，且其增强作用随培养时间延长不断增大，其中，当木质素磺酸钠质量分数为 0.50%、培养 48 h 时，TS-1203 对苹果树腐烂病菌的抑制率最高，达 84.18%。
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A：山梨醇-D；B：木质素磺酸钠；C：抗坏血酸。A: Sorbitol-D; B: Sodium lignin sulfonate; C: Ascorbic acid. 注：图中不同小写字母代表不同处理间在 P < 0.05 水平差异显著。Note: Different letters indicate significant difference at P < 0.05 level between the different treatment. 图 6 不同紫外保护剂各浓度下对解淀粉芽孢杆菌 TS-1203 抑菌活性的影响 Fig. 6 The influence of different UV protective agents and different concentrations on the inhibition rate of B. amyloliquefaciens TS-1203 |
综合上述结果，表明木质素磺酸钠可作为 TS-1203 生防制剂的最适紫外保护剂，且其适宜的质量分数为 0.50%。
2.4 TS-1203 生防制剂最佳助剂条件响应面优化2.4.1 单因素试验结果分析 以单因素试验结果中各因素及适宜浓度为自变量，采用响应面法设计 3 因素 3 水平共 17 个试验点 (表 3)，其中 12 个为析因点，5 个为零点，零点试验重复 5 次，以估计试验误差。
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表 3 Box-Behnken 试验因素水平 Table 3 The test factor levels of the Box-Behnken |
2.4.2 中心组合试验设计及结果 利用 Box-Behnken 中心设计原理，以解淀粉芽孢杆菌 TS-1203 生防制剂对苹果树腐烂病菌的抑制率为响应值，3 个影响因素 A (表面活性剂吐温-80)、B (防腐剂柠檬酸钠)、C (紫外保护剂木质素磺酸钠) 为自变量，设计 3 因素 3 水平的 Box-Behnken 中心组合试验 (表 4)，为后续二次回归拟合及方差分析提供试验数据。
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表 4 Box-Behnken 中心组合试验设计方案及结果 Table 4 The design scheme and test results of the center combination by the Box-Behnken |
2.4.3 二次回归拟合与差异显著性分析 采用 RSA 程序对表 4 中试验数据进行回归分析，得到 3 种影响因素与 TS-1203 生防制剂抑菌率之间的回归方程模型为：Y = 2.00 + 0.02A + 0.21B + 0.46C – 6.90 × 10 –5AB + 4.0 × 10 –4AC – 2.50 × 10 –4BC – 4.50 × 10 –5A2 – 2.0 × 10 –4B2 – 2.02 × 10 –3C2，对该模型进行方差分析和差异显著性检验，结果见表 5。
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表 5 回归方程方差分析 Table 5 Variance analysis of the regression equation |
由表 5 可知：该模型回归显著 (P < 0.000 1)，试验设计的 3 种不同类型助剂均对 TS-1203 抑菌率影响显著，且各因子对响应值的影响并非简单的线性关系，3 个因素之间交互作用较大；方程失拟项为 0.977 4 > 0.05，表明其失拟不显著，模型较稳定，能很好地进行预测；决定系数 R2 = 0.973 8，说明该模型拟合度良好，可用于确定 TS-1203 生防制剂的最佳助剂组合。通过 F 值的大小可判断各助剂对 TS-1203 抑菌活性的影响程度，F 值越大则影响越明显，因此，从表 5 可判断出各助剂对 TS-1203 抑菌活性影响程度大小依次为防腐剂柠檬酸钠 > 表面活性剂吐温-80 > 紫外保护剂木质素磺酸钠。
2.4.4 响应面分析 根据方程模拟结果，绘制 3 种不同类型助剂之间的交互作用响应面曲线图和等高线图 (图 7、8 和 9)。从中可知，助剂曲线图的曲线走势坡度越陡，则其影响越显著；曲线走势坡度越平缓，则该因素影响越小。利用 Design-Expert 7.0 软件对结果进行系统分析，得最佳助剂条件为：65 mL TS-1203 菌株发酵液中吐温-80 的适宜添加量为 650 μL，柠檬酸钠为 164.58 mg，木质素磺酸钠为 308.12 mg，在此条件下，TS-1203 菌剂对苹果树腐烂病菌的抑制率为 84.78%。
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图 7 吐温-80 和木质素磺酸钠交互影响的等高线图 (右) 和三维曲面图 (左) Fig. 7 Contour plot (left) and surface (right) of the mutual-influence for the tween-80 and the sodium lignin sulfonate |
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图 8 柠檬酸钠和木质素磺酸钠交互影响的等高线图 (右) 和三维曲面图 (左) Fig. 8 Contour plot (left) and surface (right) of the mutual-influence for the sodium citrate and sodium lignin sulfonate |
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图 9 柠檬酸钠和吐温-80 交互影响的等高线图 (右) 和三维曲面图 (左) Fig. 9 Contour plot (left) and surface (right) of the mutual-influence for the sodium citrate and tween-80 |
2.4.5 响应面最优条件验证 参考 1.2.1 节中种子液制备方法，根据方程模拟得到的最佳助剂组合制备 TS-1203 发酵液，即向 65 mL TS-1203 菌液中添加 650 μL 吐温-80、165 mg 柠檬酸钠和 308 mg 木质素磺酸钠，于 180 r/min、28 ℃ 振荡培养，48 h 后测得 TS-1203 发酵液对苹果树腐烂病菌的抑制率为 83.98%，与理论预测结果 (84.78%) 吻合良好，表明采用响应面法对 TS-1203 生防制剂助剂条件进行优化，所得结果是准确可靠的。
2.5 TS-1203 生防制剂载体筛选如表 6 所示，不同载体对 TS-1203 菌株生长影响不同。其中聚乙烯醇和羟甲基纤维素钠具有较弱的抑制作用；海藻酸钠抑制作用最强；硅藻土和有机膨润土则能够促进其生长，且与对照差异显著 (P < 0.05)。但以硅藻土为载体时易分层，以有机膨润土为载体时则无沉淀现象发生，因此确定有机膨润土为 TS-1203 生防制剂的最佳载体。
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表 6 供试载体对解淀粉芽孢杆菌 TS-1203 菌株生长的影响及制剂状态观察 Table 6 The influence of the carrier on the growth of B. amyloliquefaciens TS-1203 and the status of the biological agent |
3 结论与讨论
刘振华等[16]研究表明，活体微生物因较易受加工条件和环境因素的影响而失活，所以在微生物制剂加工过程中需要添加助剂以保护活性成分的有效性，延长商品制剂的货架期。但是由于很多助剂为化学合成物质，因而在微生物农药加工过程中需要充分考虑助剂自身与活体微生物的相容性。本研究通过对解淀粉芽孢杆菌 TS-1203 生防制剂最佳助剂条件的优化，发现向 65 mL 菌体发酵液中分别加入 650 μL 吐温-80、164.58 mg 柠檬酸钠和 308.12 mg 木质素磺酸钠时，TS-1203 制剂对苹果树腐烂病菌的抑制率最高，可达 84.78%。此外，有机膨润土可作为 TS-1203 生防制剂的最佳载体。
余健秀等[17]研究表明，为了尽可能减弱助剂对生防菌剂抗真菌活性的影响，需要筛选与生防菌株具有良好相容性的载体和助剂。本研究通过单因素试验，确定了解淀粉芽孢杆菌 TS-1203 生防制剂最佳助剂分别为吐温-80、木质素磺酸钠和柠檬酸钠，该结果与文献报道[17]基本一致。石妍等[18]研究表明，吐温-80 可作为厚垣孢普可尼亚菌 Pochonia chlamydosporia 可湿性粉剂的最佳润湿剂。潘以楼等[19]研究了不同农药助剂对稻瘟病生防菌短短小芽孢杆菌 Bacillus pumilus TW-2 菌株活性的影响，发现木质素磺酸钠盐和篦麻油聚醚的影响最小，本结果与之类似。然而，路宗岩等[20]的研究表明，杉木炭疽病拮抗细菌地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis 生防制剂最佳润湿剂为十二烷基磺酸钠 (SDS)，本研究结果与其存在一定差异，其原因可能是由于不同生防菌株生物学及生物化学特性不同，因此同种助剂对不同菌株具有不同影响[17]。
另外，本研究发现，载体硅藻土虽然可促进菌株 TS-1203 的生长，但所得制剂静置后分层明显，硅藻土均沉于三角瓶底部，故不适宜用作 TS-1203 生防制剂的载体。聚乙烯醇和羟甲基纤维素钠虽对 TS-1203 菌株生长有抑制作用，但与对照相比差异并不显著。据王剑[21]报道，生防菌 B99-2 可湿性粉剂配方中主要包括质量分数为 10% 的硅藻土、7.20% 的聚乙烯醇 (PVA) 和 2% 的羟甲基纤维素钠。本研究所选载体与之相比存在一定差异，其原因可能是因为同一种载体与不同微生物之间相容性不同所致[17]。本研究仅对解淀粉芽孢杆菌 TS-1203 生防制剂的助剂和载体进行了初步筛选和优化，有关其剂型开发和质量控制指标等方面内容还有待进一步研究。
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