2. 南京农业大学 植物保护学院,南京 210095
2. Institute of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
多氯联苯 (polychlorinated biphenyls, PCBs) 属于环境普遍性、持久性有机污染物[1-2],其亲脂性很强,可在生物体内富集,并且通过食物链传递,对环境和人体造成很大危害[3-8]。丁罡斗等[9]建立了气相色谱-离子阱二级质谱对照高分辨率质谱测定食品中 12 种类二鰁英类多氯联苯的方法,并检测了其在河豚、鳗鱼和甜虾等样品中的含量。柯常亮等[10]建立了气相色谱法同时测定水产品中的 28 种多氯联苯同系物 (包括 12 种类二鰁英类多氯联苯、7 种指示性多氯联苯和环境中典型存在的 9 种多氯联苯) 的分析方法,并对养殖卵形鲳鯵、罗非鱼和对虾等样品进行了检测,所测水产品 PCBs 含量均未超标。田良良等[11]建立了气相色谱法测定虾中 7 种多氯联苯的方法,并对采集的凡纳滨对虾、日本对虾和斑节对虾样品进行了检测。Mohebbi-Nozar 等[12]建立了气相色谱-串联质谱法检测 7 种指示性多氯联苯的方法,并对伊朗南部的海洋生物 (鱼、虾、螃蟹和贝壳类) 进行检测,还比较得出其含量高于伊朗北部和波斯湾的其他部分的生物群。Labunska 等[13]建立了气相色谱-串联质谱法检测 7 种指示性多氯联苯和 4 种类二鰁英多氯联苯的方法,并对中国台州地区的 127 种食物样品和上海、南京地区的控制样品进行了比较分析。目前,对虾体中有关多氯联苯的研究均集中在虾肉可食部分,对多氯联苯在虾体中不同组织内的分布情况研究较少,且对7种环境指示类 PCBs (2,4,4′-三氯联苯、2,2′,5,5′-四氯联苯、2,2′,4,5,5′-五氯联苯、2,3′,4,4′,5-五氯联苯、2,2′,4,4′,5,5′-六氯联苯、2,2′,3,4,4′,5′-六氯联苯、2,2′,3,4,4′,5,5′-七氯联苯) 的研究较多,而对 12 种类二鰁英 PCBS (3,4,4′,5-四氯联苯、3,3′,4,4′-四氯联苯、2′,3,4,4′,5-五氯联苯、2,3′,4,4′,5-五氯联苯、2,3,4,4′,5-五氯联苯、2,3,3′,4,4′-五氯联苯、3,3′,4,4′,5-五氯联苯、2,3′,4,4′,5,5′-六氯联苯、2,3,3′,4,4′,5-六氯联苯、2,3,3′,4,4′,5′-六氯联苯、3,3′,4,4′,5,5′-六氯联苯、2,3,3′,4,4′,5,5′-七氯联苯) 的研究相对较少,因此建立可以同时检测这 7 种环境指示类和 12 种类二鰁英 PCBs 的方法,对研究 18 种 PCBs 在水生生物不同组织中的累积与分布情况具有重要意义。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂TSQ8000 型气相色谱-串联质谱仪 (美国赛默飞公司);N-EVAP112 型 24 位氮吹仪 (德国邦德公司);CK2000 振荡器 (北京托摩根生物科技有限公司);TG16-WS 高速离心机 (长沙湘智离心机仪器有限公司);5804R 离心机 (德国 eppendorf 公司);JY2002 天秤 (精确到 0.01 g,上海精密科学仪器有限公司);SHZ-Ⅲ型循环水真空泵 (上海亚荣生化仪器厂);WH-3 微型漩涡混合仪 (上海沪西分析仪器厂有限公司);T18 匀浆机 (德国 IKA 公司);HR2168 飞利浦搅拌机 (珠海经济特区飞利浦家庭电器有限公司)。
18 种 PCBs 混合标准溶液 (10 mg/L,其结构式见图式 1,美国 o2si 公司);LC-弗罗里硅土柱 (1 000 mg,6 mL,美国 Supelco 公司);正己烷为色谱纯,其余试剂均为市售分析纯。
1.2 样品前处理
1.2.1 样品制备 将虾肢解分离成虾头、虾肉、虾壳和虾黄,粉碎,于 –20 ℃ 保存,备用。
1.2.2 样品提取与净化 分别称取 1.2.1 节制备的虾肉、虾头、虾壳和虾黄样品各 20 g (精确至 0.01 g) 至 100 mL 聚丙烯离心管中,先加入 30 mL V (二氯甲烷) : V (正己烷) = 1:1 的混合溶液,匀浆 1 min;再加入 20 mL 继续匀浆 1 min,于 6 000 r/min 下离心 5 min;将上清液全部转移至 250 mL 烧瓶中,重复提取 1 次,合并上清液,旋蒸至近干;用 10 mL 正己烷溶解,转移至 60 mL 分液漏斗中,分批多次加入浓硫酸进行磺化至硫酸层无色,再用 5% 碳酸钾溶液洗涤有机相至中性,弃去水相,待净化。
净化:先用 5 mL 正己烷活化 Florisil 柱,弃去淋洗液;准确量取 10 mL 样品,以 2 mL/min 的速率过柱,收集滤液于 25 mL 刻度试管中,再用 10 mL V (正己烷) : V (丙酮) = 9:1 的混合溶液洗脱;合并洗脱液,用氮气吹至近干后,用正己烷溶解定容至 0.2 mL,过 0.22 μm 滤膜,待测。
1.3 气相色谱-串联质谱检测条件色谱条件:HP-5 (30 m × 0.32 mm,0.32 μm) 色谱柱。升温程序:初始温度 80 ℃,保持 2 min;以 20 ℃/min 速率升温至 180 ℃,保持 2 min;再以 3 ℃/min 速率升温至 230 ℃,保持 2 min;然后以 10 ℃/min 速率升温至 280 ℃,保持 2 min。进样口温度 250 ℃;进样量 1 μL;不分流进样;载气为氦气 (纯度 > 99.99%),流速 1.2 mL/min。
质谱条件:电子轰击离子 (EI+) 源;电子能量 70 eV;传输线温度 280 ℃;离子源温度 280 ℃;多反应监测模式 (MRM)。条件见表 1。18 种 PCBs 标准品 0.1 mg/L 的气相色谱-串联质谱图见图 1。
1.4 标准工作溶液配制及标准曲线绘制
采用外标法定量。准确量取 18 种 PCBs 混合标准溶液 (10 mg/L) 1 mL 于 10 mL 容量瓶中,用正己烷定容,配成 1 mg/L 的母液;再梯度稀释成 0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05 和 0.5 mg/L 的系列标准工作溶液,按 1.3 节的条件测定。以样品质量浓度 (x) 为横坐标,峰面积 (y) 为纵坐标,绘制标准曲线。
2 结果与讨论 2.1 提取剂及提取方法的选择分别考察了以二氯甲烷和 V (二氯甲烷) : V (正己烷) = 1 : 1 的混合溶液作提取剂,提取 2 次,匀浆、振荡和匀浆 + 振荡组合的提取方法对提取效果的影响。结果表明:以二氯甲烷作提取剂时,提取杂质多,且不利于取出提取液;而以 V (二氯甲烷) : V (正己烷) = 1 : 1 的混合溶液作提取剂时,提取杂质较少,且基质在上层。综合考虑,选取 V (二氯甲烷) : V (正己烷) = 1 : 1 的混合溶液作为提取剂。采用振荡提取时,方法的回收率 < 70%,而且稳定性差;而采用先匀浆后振荡提取,回收率的平行性较差;两次匀浆提取则可得到较高的回收率,且 RSD < 10%,因而采用两次匀浆的提取方法。
2.2 净化条件的优化在空的固相萃取柱柱管内加入筛板,加入 1 g 弗罗里硅土。用 5 mL 正己烷活化后,加入 1 mL 0.1 mg/L 的标准品,用 15 mL V (正己烷) : V (丙酮) = 9 : 1 混合溶液分 3 次洗脱,收集洗脱液并接至 3 个 10 mL 刻度试管中,经氮气吹干后用 1 mL 正己烷溶解,过 0.22 μm 滤膜,测定。改用硅胶和酸性氧化铝各 0.5 g 作为填料,二氯甲烷作为洗脱液,重复上述试验。结果表明:以弗罗里硅土为填料时,用 10 mLV (正己烷) : V (丙酮) = 9 : 1 混合溶液洗脱即可,而以硅胶和酸性氧化铝各 0.5 g 为填料时,二氯甲烷的用量是 15 mL,从成本和试验简捷性考虑,选用弗罗里硅土作为填料。
2.3 标准曲线和定量限将 0.001~1 mg/L 的系列混合标准溶液直接进样测定,以其质量浓度对峰面积进行线性回归,得到 18 种 PCBs 的标准曲线和决定系数如表 2 所示。结果表明:在 0.001~1 mg/L 范围内,18 种 PCBs 的质量浓度与对应的色谱峰面积间呈良好的线性关系。18 种 PCBs 在虾肉、虾头、虾壳和虾黄中检出限 (LOD) 为 0.1~10 ng/kg (S/N = 3),定量限 (LOQ) 为 0.33~33 ng/kg (S/N = 10)。
2.4 添加回收试验结果
为了考察方法的准确性和可靠性,在虾肉、虾壳、虾头和虾黄中分别添加 50、400 和 1 000 ng/kg 3 个水平的 18 种 PCBs 标准溶液,按 1.2.2 节的方法进行处理,每个水平重复 5 次,其回收率为 72%~109%,相对标准偏差均低于 10% (表 3),表明本方法的回收率和精密度良好,能满足虾的各样品中这 18 种 PCBs 准确定量的要求[14]。其典型图谱见图 2。
2.5 实际样品的检测
对南京某个养殖场养殖的青虾进行检测,结果见表 4。虾壳、虾头、虾肉和虾黄中分别有不同的多氯联苯检出,其中,PCB28 在 4 种样品中均有检出,PCB105 在虾头和虾黄中检出,PCB77 只在虾肉中检出,PCB52 只在虾壳中检出,PCB123 只有虾黄中未检出。其余多氯联苯均未检出。
由于多氯联苯极难溶于水而易溶于脂肪和有机溶剂,并且极难分解,能在生物体脂肪中大量富集,而目前中国尚未制定多氯联苯在生物体中的限量标准。本研究对实际样品进行检测,得到多组数据,可进行风险评估,为制定限量提供数据参考。
3 结论
本研究建立了同时检测虾肉、虾头、虾壳和虾黄中 7 种环境指示类 PCBs 和 12 种类二鰁英 PCBs 的气相色谱-串联质谱定性定量分析方法。本方法简单快捷、灵敏度和精密度高,回收率良好,能够满足这 4 种虾体组织样品中 18 种 PCBs 同时测定的要求。对中国南京浦口某个养殖塘里的虾实际样品的检测表明,虾体已受到 PCBs 的污染,有必要对水体生物做进一步的检测,并对其污染进行评估,为环境保护提供科学依据。
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