2017, Vol. 19
2. 南京农业大学 植物保护学院，南京 210095
2. Institute of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
多氯联苯 (polychlorinated biphenyls, PCBs) 属于环境普遍性、持久性有机污染物[1-2]，其亲脂性很强，可在生物体内富集，并且通过食物链传递，对环境和人体造成很大危害[3-8]。丁罡斗等[9]建立了气相色谱-离子阱二级质谱对照高分辨率质谱测定食品中 12 种类二鰁英类多氯联苯的方法，并检测了其在河豚、鳗鱼和甜虾等样品中的含量。柯常亮等[10]建立了气相色谱法同时测定水产品中的 28 种多氯联苯同系物 (包括 12 种类二鰁英类多氯联苯、7 种指示性多氯联苯和环境中典型存在的 9 种多氯联苯) 的分析方法，并对养殖卵形鲳鯵、罗非鱼和对虾等样品进行了检测，所测水产品 PCBs 含量均未超标。田良良等[11]建立了气相色谱法测定虾中 7 种多氯联苯的方法，并对采集的凡纳滨对虾、日本对虾和斑节对虾样品进行了检测。Mohebbi-Nozar 等[12]建立了气相色谱-串联质谱法检测 7 种指示性多氯联苯的方法，并对伊朗南部的海洋生物 (鱼、虾、螃蟹和贝壳类) 进行检测，还比较得出其含量高于伊朗北部和波斯湾的其他部分的生物群。Labunska 等[13]建立了气相色谱-串联质谱法检测 7 种指示性多氯联苯和 4 种类二鰁英多氯联苯的方法，并对中国台州地区的 127 种食物样品和上海、南京地区的控制样品进行了比较分析。目前，对虾体中有关多氯联苯的研究均集中在虾肉可食部分，对多氯联苯在虾体中不同组织内的分布情况研究较少，且对7种环境指示类 PCBs (2,4,4′-三氯联苯、2,2′,5,5′-四氯联苯、2,2′,4,5,5′-五氯联苯、2,3′,4,4′,5-五氯联苯、2,2′,4,4′,5,5′-六氯联苯、2,2′,3,4,4′,5′-六氯联苯、2,2′,3,4,4′,5,5′-七氯联苯) 的研究较多，而对 12 种类二鰁英 PCBS (3,4,4′,5-四氯联苯、3,3′,4,4′-四氯联苯、2′,3,4,4′,5-五氯联苯、2,3′,4,4′,5-五氯联苯、2,3,4,4′,5-五氯联苯、2,3,3′,4,4′-五氯联苯、3,3′,4,4′,5-五氯联苯、2,3′,4,4′,5,5′-六氯联苯、2,3,3′,4,4′,5-六氯联苯、2,3,3′,4,4′,5′-六氯联苯、3,3′,4,4′,5,5′-六氯联苯、2,3,3′,4,4′,5,5′-七氯联苯) 的研究相对较少，因此建立可以同时检测这 7 种环境指示类和 12 种类二鰁英 PCBs 的方法，对研究 18 种 PCBs 在水生生物不同组织中的累积与分布情况具有重要意义。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂TSQ8000 型气相色谱-串联质谱仪 (美国赛默飞公司)；N-EVAP112 型 24 位氮吹仪 (德国邦德公司)；CK2000 振荡器 (北京托摩根生物科技有限公司)；TG16-WS 高速离心机 (长沙湘智离心机仪器有限公司)；5804R 离心机 (德国 eppendorf 公司)；JY2002 天秤 (精确到 0.01 g，上海精密科学仪器有限公司)；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵 (上海亚荣生化仪器厂)；WH-3 微型漩涡混合仪 (上海沪西分析仪器厂有限公司)；T18 匀浆机 (德国 IKA 公司)；HR2168 飞利浦搅拌机 (珠海经济特区飞利浦家庭电器有限公司)。
18 种 PCBs 混合标准溶液 (10 mg/L，其结构式见图式 1，美国 o2si 公司)；LC-弗罗里硅土柱 (1 000 mg，6 mL，美国 Supelco 公司)；正己烷为色谱纯，其余试剂均为市售分析纯。
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图式 1 18 种 PCBs 的结构式 Scheme1 Structural formula of 18 PCBs |
1.2 样品前处理
1.2.1 样品制备 将虾肢解分离成虾头、虾肉、虾壳和虾黄，粉碎，于 –20 ℃ 保存，备用。
1.2.2 样品提取与净化 分别称取 1.2.1 节制备的虾肉、虾头、虾壳和虾黄样品各 20 g (精确至 0.01 g) 至 100 mL 聚丙烯离心管中，先加入 30 mL V (二氯甲烷) : V (正己烷) = 1:1 的混合溶液，匀浆 1 min；再加入 20 mL 继续匀浆 1 min，于 6 000 r/min 下离心 5 min；将上清液全部转移至 250 mL 烧瓶中，重复提取 1 次，合并上清液，旋蒸至近干；用 10 mL 正己烷溶解，转移至 60 mL 分液漏斗中，分批多次加入浓硫酸进行磺化至硫酸层无色，再用 5% 碳酸钾溶液洗涤有机相至中性，弃去水相，待净化。
净化：先用 5 mL 正己烷活化 Florisil 柱，弃去淋洗液；准确量取 10 mL 样品，以 2 mL/min 的速率过柱，收集滤液于 25 mL 刻度试管中，再用 10 mL V (正己烷) : V (丙酮) = 9:1 的混合溶液洗脱；合并洗脱液，用氮气吹至近干后，用正己烷溶解定容至 0.2 mL，过 0.22 μm 滤膜，待测。
1.3 气相色谱-串联质谱检测条件色谱条件：HP-5 (30 m × 0.32 mm，0.32 μm) 色谱柱。升温程序：初始温度 80 ℃，保持 2 min；以 20 ℃/min 速率升温至 180 ℃，保持 2 min；再以 3 ℃/min 速率升温至 230 ℃，保持 2 min；然后以 10 ℃/min 速率升温至 280 ℃，保持 2 min。进样口温度 250 ℃；进样量 1 μL；不分流进样；载气为氦气 (纯度 > 99.99%)，流速 1.2 mL/min。
质谱条件：电子轰击离子 (EI+) 源；电子能量 70 eV；传输线温度 280 ℃；离子源温度 280 ℃；多反应监测模式 (MRM)。条件见表 1。18 种 PCBs 标准品 0.1 mg/L 的气相色谱-串联质谱图见图 1。
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表 1 定性离子和定量离子的选择及碰撞能量 Table 1 Selection of qualitative ions and quantitative ions and the collision energy |
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图 1 18 种 PCBs 标准品气相色谱-串联质谱图 (0.1 mg/L) Fig. 1 Gas chromatography-tandem mass spectrometry chromatograms of 18 PCBs (0.1 mg/L) |
1.4 标准工作溶液配制及标准曲线绘制
采用外标法定量。准确量取 18 种 PCBs 混合标准溶液 (10 mg/L) 1 mL 于 10 mL 容量瓶中，用正己烷定容，配成 1 mg/L 的母液；再梯度稀释成 0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05 和 0.5 mg/L 的系列标准工作溶液，按 1.3 节的条件测定。以样品质量浓度 (x) 为横坐标，峰面积 (y) 为纵坐标，绘制标准曲线。
2 结果与讨论 2.1 提取剂及提取方法的选择分别考察了以二氯甲烷和 V (二氯甲烷) : V (正己烷) = 1 : 1 的混合溶液作提取剂，提取 2 次，匀浆、振荡和匀浆 + 振荡组合的提取方法对提取效果的影响。结果表明：以二氯甲烷作提取剂时，提取杂质多，且不利于取出提取液；而以 V (二氯甲烷) : V (正己烷) = 1 : 1 的混合溶液作提取剂时，提取杂质较少，且基质在上层。综合考虑，选取 V (二氯甲烷) : V (正己烷) = 1 : 1 的混合溶液作为提取剂。采用振荡提取时，方法的回收率 < 70%，而且稳定性差；而采用先匀浆后振荡提取，回收率的平行性较差；两次匀浆提取则可得到较高的回收率，且 RSD < 10%，因而采用两次匀浆的提取方法。
2.2 净化条件的优化在空的固相萃取柱柱管内加入筛板，加入 1 g 弗罗里硅土。用 5 mL 正己烷活化后，加入 1 mL 0.1 mg/L 的标准品，用 15 mL V (正己烷) : V (丙酮) = 9 : 1 混合溶液分 3 次洗脱，收集洗脱液并接至 3 个 10 mL 刻度试管中，经氮气吹干后用 1 mL 正己烷溶解，过 0.22 μm 滤膜，测定。改用硅胶和酸性氧化铝各 0.5 g 作为填料，二氯甲烷作为洗脱液，重复上述试验。结果表明：以弗罗里硅土为填料时，用 10 mLV (正己烷) : V (丙酮) = 9 : 1 混合溶液洗脱即可，而以硅胶和酸性氧化铝各 0.5 g 为填料时，二氯甲烷的用量是 15 mL，从成本和试验简捷性考虑，选用弗罗里硅土作为填料。
2.3 标准曲线和定量限将 0.001~1 mg/L 的系列混合标准溶液直接进样测定，以其质量浓度对峰面积进行线性回归，得到 18 种 PCBs 的标准曲线和决定系数如表 2 所示。结果表明：在 0.001~1 mg/L 范围内，18 种 PCBs 的质量浓度与对应的色谱峰面积间呈良好的线性关系。18 种 PCBs 在虾肉、虾头、虾壳和虾黄中检出限 (LOD) 为 0.1~10 ng/kg (S/N = 3)，定量限 (LOQ) 为 0.33~33 ng/kg (S/N = 10)。
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表 2 18 种 PCBs 的线性回归方程和决定系数 Table 2 Linear regression equation and determination coefficient of 18 PCBs |
2.4 添加回收试验结果
为了考察方法的准确性和可靠性，在虾肉、虾壳、虾头和虾黄中分别添加 50、400 和 1 000 ng/kg 3 个水平的 18 种 PCBs 标准溶液，按 1.2.2 节的方法进行处理，每个水平重复 5 次，其回收率为 72%~109%，相对标准偏差均低于 10% (表 3)，表明本方法的回收率和精密度良好，能满足虾的各样品中这 18 种 PCBs 准确定量的要求[14]。其典型图谱见图 2。
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表 3 18 种 PCBs 在虾体中的添加回收率和相对标准偏差 (n = 5) Table 3 Results of recovery and relative standard deviations of 18 PCBs in Macrobrachium nipponense (n = 5) |
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图 2 虾肉空白 (A) 和添加 PCBs (B) GC-MS/MS 图 Fig. 2 GC-MS/MS of matrix meat (A) and spiked PCBs (B) in meat of Macrobrachium nipponense |
2.5 实际样品的检测
对南京某个养殖场养殖的青虾进行检测，结果见表 4。虾壳、虾头、虾肉和虾黄中分别有不同的多氯联苯检出，其中，PCB28 在 4 种样品中均有检出，PCB105 在虾头和虾黄中检出，PCB77 只在虾肉中检出，PCB52 只在虾壳中检出，PCB123 只有虾黄中未检出。其余多氯联苯均未检出。
由于多氯联苯极难溶于水而易溶于脂肪和有机溶剂，并且极难分解，能在生物体脂肪中大量富集，而目前中国尚未制定多氯联苯在生物体中的限量标准。本研究对实际样品进行检测，得到多组数据，可进行风险评估，为制定限量提供数据参考。
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表 4 实际样品检测结果 Table 4 Results of the tested samples |
3 结论
本研究建立了同时检测虾肉、虾头、虾壳和虾黄中 7 种环境指示类 PCBs 和 12 种类二鰁英 PCBs 的气相色谱-串联质谱定性定量分析方法。本方法简单快捷、灵敏度和精密度高，回收率良好，能够满足这 4 种虾体组织样品中 18 种 PCBs 同时测定的要求。对中国南京浦口某个养殖塘里的虾实际样品的检测表明，虾体已受到 PCBs 的污染，有必要对水体生物做进一步的检测，并对其污染进行评估，为环境保护提供科学依据。
| [1] |
联合国环境规划署. 关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约[R]. 内罗毕, 肯尼亚: 联合国环境规划署, 2001: 23.
The United Nations Environment Programme (UNEP). About some Stockholm convention on persistent organic pollutants (POPS)[R]. Nairobi, Kenya: The United Nations Environment Programme (UNEP), 2001: 23. |
| [2] |
李敬光, 赵云峰, 吴永宁. 离子阱串联质谱法检测鱼肉中指示性多氯联苯[J]. 分析化学, 2005, 33(9): 1223–1226.
LI J G, ZHAO Y F, WU Y N. Determination of polycholorinated biphenyls in fish by gas chromatography-ion trap tandem mass spectrometry[J]. Chin J Anal Chem, 2005, 33(9): 1223–1226. |
| [3] |
刘寒. 类二鰁英多氯联苯PCB126对斑马鱼胚胎的发育毒性机理[D]. 湛江: 广东海洋大学, 2012.
LIU H. Studies on developmental toxicology of dioxin-like PCB126 in zebrafish embryos[D]. Zhanjiang: Guangdong Ocean University, 2012. |
| [4] | OTTONELLO G, FERRARI A, MAGI E. Determination of polychlorinated biphenyls in fish: optimisation and validation of a method based on accelerated solvent extraction and gas chromatography-mass spectrometry[J]. Food Chem, 2014, 142: 327–333. doi:10.1016/j.foodchem.2013.07.048 |
| [5] | ZHANG R, ZHANG F, ZHANG T C, et al. Historical sediment record and distribution of polychlorinated biphenyls (PCBs) in sediments from tidal flats of Haizhou Bay, China[J]. Mar Pollut Bull, 2014, 89(1-2): 487–493. doi:10.1016/j.marpolbul.2014.09.001 |
| [6] | ZHANG J L, LI Y Y, WANG Y H, et al. Spatial distribution and ecological risk of polychlorinated biphenyls in sediments from Qinzhou Bay, Beibu Gulf of South China[J]. Mar Pollut Bull, 2014, 80(1-2): 338–343. doi:10.1016/j.marpolbul.2013.12.028 |
| [7] | VAN GEEST J L, MACKAY D, POIRIER D G, et al. Accumulation and depuration of polychlorinated biphenyls from field-collected sediment in three freshwater organisms[J]. Environ Sci Technol, 2011, 45(16): 7011–7018. doi:10.1021/es1043744 |
| [8] | PERELLÓ G, MARTÍ-CID R, CASTELL V, et al. Influence of various cooking processes on the concentrations of PCDD/PCDFs, PCBs and PCDEs in foods[J]. Food Control, 2010, 21(2): 178–185. doi:10.1016/j.foodcont.2009.05.003 |
| [9] |
丁罡斗, 李翔, 仲维科, 等. 气相色谱-离子阱二级质谱对照高分辨质谱对食品中二鰁英类多氯联苯的测定[J]. 分析测试学报, 2008, 27(5): 479–483.
DING G D, LI X, ZHONG W K, et al. Gas chromatography-ion trap tandem mass spectrometry versus high resolution mass spectrometry for the determination of dioxin-like polychlorinated biphenyls in food[J]. J Instrum Anal, 2008, 27(5): 479–483. |
| [10] |
柯常亮, 刘奇, 王许诺, 等. 气相色谱法同时测定水产品中28种多氯联苯同系物[J]. 食品与发酵工业, 2015, 41(7): 155–159.
KE C L, LIU Q, WANG X N, et al. Simultaneous determination of 28 polychlorinated biphenyls in aquatic products using gas chromatography[J]. Food Ferment Ind, 2015, 41(7): 155–159. |
| [11] |
田良良, 史永富, 王媛, 等. 气相色谱法测定虾中有机氯农药和多氯联苯残留量[J]. 分析实验室, 2014, 33(9): 1043–1046.
TIAN L L, SHI Y F, WANG Y, et al. Determination of organochlorine pesticide and polychlorinated biphenyl residues in shrimp by gas chromatography[J]. Chin J Anal Lab, 2014, 33(9): 1043–1046. |
| [12] | MOHEBBI-NOZAR S L, ISMAIL W R, ZAKARIA M P. Distribution, sources identification, and ecological risk of PAHs and PCBs in coastal surface sediments from the northern Persian gulf[J]. Hum Ecol Risk Assess, 2014, 20(6): 1507–1520. doi:10.1080/10807039.2014.884410 |
| [13] | LABUNSKA I, ABDALLAH M A E, EULAERS I, et al. Human dietary intake of organohalogen contaminants at e-waste recycling sites in Eastern China[J]. Environ Int, 2015, 74: 209–220. doi:10.1016/j.envint.2014.10.020 |
| [14] |
农药残留试验准则: NY/T 788—2004[S]. 北京: 中国农业出版社, 2004.
Guideline on pesticide residue trials: NY/T 788—2004[S]. Beijing: China Agriculture Press, 2004. |