2017, Vol. 19
小麦纹枯病又称小麦尖眼斑病(wheat sharp eyespot)，是一种世界性分布的土传真菌病害，其主要致病菌为禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis Vander Hoeven。该病主要为害小麦的茎杆基部，可造成植株倒伏、枯死及白穗，影响小麦有效穗数及千粒重，对产量影响较大[1]。近年来，随着小麦品种的更替及高产栽培措施(早播、密植、高肥) 的推广，该病在中国冬小麦种植区发生普遍，已成为黄淮平原及长江流域麦区的重要病害[2]。河南省是中国小麦主产区之一，近几年小麦纹枯病的发生面积持续在300万hm2左右，为害严重[3]。由于目前尚未发现高抗纹枯病的小麦品种，控制该病害仍主要依靠苯醚甲环唑和戊唑醇种子处理并结合春季井冈霉素喷雾进行化学防治[4]。
井冈霉素(jinggangmycin) 是中国自主研发且目前产量最大的农用微生物源抗生素，主要用于水稻、小麦等纹枯病的防治[5]。孙海燕等[6]的研究表明，目前中国江苏、安徽、河南及山东4省的小麦纹枯病菌菌株对井冈霉素的敏感性差异仍不显著，生产中依然可以用井冈霉素来防治小麦纹枯病。甲基立枯磷(tolclofos-methyl) 为有机磷类杀菌剂，对由丝核菌属(Rhizoctonia)、核盘菌属(Sclerotinia)、小核菌属(Sclerotium) 和葡萄孢属(Botrytis) 真菌引起的禾谷类作物纹枯病、菌核病、白绢病和灰霉病等具有良好的防治效果[7]。迄今为止，尽管已有关于河南省小麦纹枯病菌对井冈霉素敏感性的报道，但由于该研究所用菌株(10株) 仅来源于商丘一地，无法反映河南省的总体情况[6]；而对甲基立枯磷的敏感性则尚无相关报道。为此，本研究采用菌丝生长速率法，测定了2013年从河南省15个地市分离的98株小麦纹枯病菌对井冈霉素和甲基立枯磷的敏感性，建立了敏感基线，分析了不同地区菌株的敏感性差异及供试菌株对两种杀菌剂敏感性间的相关性，以期为两种药剂在小麦纹枯病防治中的合理利用提供依据，为田间病原菌敏感性监测提供参考。
1 材料与方法 1.1 供试菌株于2013年4-5月，从中国河南省各地市大面积种植小麦的乡镇采集纹枯病标本，在同一乡镇尽可能扩大采样地块，5点取样法采样，每个乡镇至少采集50个小麦植株。选取发病典型的小麦植株，去除根部及茎秆上部，剥去叶鞘，保留茎秆基部具有典型云纹状病斑的茎段。室内采用组织分离法分离病菌，共获得343株菌株，转入PSA斜面上，室温保存；每采集地随机选取4~8株进行单菌丝顶端纯化，共98株用于试验；对98株病原菌进行细胞核染色及培养性状测定，经鉴定均为禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis[8]。
1.2 药剂及试剂60%井冈霉素(jinggangmycin) 原药，浙江钱江生物化学股份有限公司；93.45%甲基立枯磷(tolclofos-methyl) 原药，江苏省东海农药厂。井冈霉素原药预溶于灭菌超纯水中，甲基立枯磷原药预溶于丙酮中，均配成1 × 104 μg/mL的母液，于4 ℃冰箱中保存。蔗糖为分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；琼脂粉为生物技术级，合肥新恩源生物技术有限公司。
1.3 病原菌对两种杀菌剂的敏感性测定采用菌丝生长速率法[9]。将供试菌株在PSA平板上于25 ℃下培养3 d后，在菌落边缘打取直径5 mm的菌饼，菌丝面朝下接入含井冈霉素分别为0.15、0.2、0.25、0.35、0.5及1 μg/mL，含甲基立枯磷分别为0.035、0.065、0.1、0.2、0.3及0.5 μg/mL系列质量浓度的PSA平板上。每皿接种1个菌饼，每处理重复3次，以不含药剂PSA平板上接种的菌饼作对照。25 ℃下培养5 d后，采用十字交叉法测量菌落直径(mm)，计算各浓度处理下药剂对菌丝生长的抑制率(%)。
1.4 敏感性频率分布图绘制参照祁之秋等的方法[10]。将病原菌群体对供试药剂的敏感性从高到低分成不同区间，统计EC50值在各个区间的菌株数占整个群体的频率(%)。以EC50值为x轴，相应的频率(%) 为y轴，绘制病原菌群体对杀菌剂的敏感性频率分布图。根据病原菌的敏感性频率分布情况，建立其对井冈霉素和甲基立枯磷的敏感基线。
1.5 小麦纹枯病菌对井冈霉素及甲基立枯磷敏感性的相关性分析参照齐永志等的方法[11]。随机选取12株小麦纹枯病菌进行敏感性相关性分析。其中井冈霉素敏感菌株9株，敏感性下降菌株3株；1株对甲基立枯磷的敏感性表现为下降，其余11株均敏感。以井冈霉素对菌株的EC50值为x轴，甲基立枯磷对菌株的EC50值为y轴，进行线性回归分析，求出线性回归方程y=bx + a，根据决定系数(R2)、b值及F检验的显著水平(P值)，分析井冈霉素与甲基立枯磷对小麦纹枯病菌毒力之间的关系：P < 0.05，b值为正，且R2在0.8以上，说明两种药剂间存在正相关性，b值为负，R2在0.8以上，说明两种药剂间存在负相关性；P > 0.05，说明两种药剂间无相关性。
1.6 数据处理敏感性测定数据利用Excel 2003进行处理，并通过DPS V6.55软件中的“数量型数据机值分析”，通过菌丝生长抑制率几率值和药剂质量浓度对数之间的线性回归分析，求出药剂对菌株的毒力回归方程、相关系数(r) 和有效抑制中浓度(EC50) 值；同时通过该软件中的“数据正态性检验”，就供试菌株对杀菌剂的敏感性频率分布进行Shapiro-Wilk正态性检验[12]，并利用该软件中的“最小显著差异法(LSD) ”分析不同地区菌株敏感性间的差异显著性；每地区随机选择3株，共45株小麦纹枯病菌，采用SPSS 20.0对井冈霉素和甲基立枯磷抑制病原菌菌丝生长的EC50值进行系统聚类分析[10]。
2 结果与分析 2.1 小麦纹枯病菌对井冈霉素和甲基立枯磷的敏感性及敏感基线供试98株小麦纹枯病菌对井冈霉素的敏感性基本呈连续性分布，EC50值在0.023~0.852 μg/mL之间，最大值为最小值的37倍，平均EC50值为(0.404±0.188) μg/mL (图 1)。在该EC50值范围内，以0.2 μg/mL为截距将其分为5个区间，统计每区间出现的菌株数和发生频率，得到小麦纹枯病菌对井冈霉素的敏感性频率分布图(图 2)。Shapiro-Wilk正态性检验结果显示，供试菌株对井冈霉素的敏感性频率不符合正态性分布(W=0.921，P=1.9 × 10-5 < 0.05)，表明小麦纹枯病菌对井冈霉素的敏感性发生了分化，并已出现敏感性下降的亚群体。虽然供试菌株对井冈霉素的敏感性已出现一定分化，但仍有77.6%的菌株(共76株) 集中位于图 2中相应的主峰范围内，其敏感性频率分布为连续单峰曲线，这部分群体对井冈霉素的敏感性频率分布呈近似正态分布(W=0.976，P=0.151 > 0.05)，因此可将其EC50平均值(0.424±0.081) μg/mL作为小麦纹枯病菌对井冈霉素的敏感基线。
|
图 1 小麦纹枯病菌对井冈霉素和甲基立枯磷的敏感性 Fig. 1 EC50 values of R. cerealis populations to jinggangmycin and tolclofos-methyl |
供试98株小麦纹枯病菌对甲基立枯磷的敏感性基本呈连续性分布，EC50值在0.035~0.512 μg/mL之间，最大值为最小值的15倍，平均EC50值为(0.128±0.058) μg/mL (图 1)。在该EC50值范围内，以0.05 μg/mL为截距将其分为6个区间，统计每区间出现的菌株数和发生频率，得到小麦纹枯病菌对甲基立枯磷的敏感性频率分布图(图 2)。Shapiro-Wilk正态性检验结果显示，供试菌株对甲基立枯磷的敏感性频率不符合正态性分布(W=0.794，P=1 × 10-6 < 0.05)，表明小麦纹枯病菌对甲基立枯磷的敏感性也出现了分化，并已出现敏感性下降的亚群体。但99.0%的菌株(97株) 均集中位于图 2中相应的主峰范围内，其敏感性频率分布为连续单峰曲线，这部分群体对甲基立枯磷的敏感性频率呈近似正态分布(W=0.989，P=0.595 > 0.05)，因此可将其EC50平均值(0.124±0.043) μg/mL作为小麦纹枯病菌对甲基立枯磷的敏感基线。
|
图 2 小麦纹枯病菌对井冈霉素和甲基立枯磷的敏感性频率分布 Fig. 2 Frequency distribution of EC50 values of R. cerealis populations to jinggangmycin and tolclofos-methyl |
此外，井冈霉素的平均EC50值是甲基立枯磷的3倍，表明小麦纹枯病菌对甲基立枯磷较井冈霉素更为敏感。
2.2 不同地区小麦纹枯病菌对井冈霉素和甲基立枯磷的敏感性由表 1可看出，不同地区小麦纹枯病菌群体间对井冈霉素和甲基立枯磷的敏感性均存在显著的地域性差异。井冈霉素的EC50值范围在0.023~0.852 μg/mL之间，其中，濮阳和郑州菌株最为敏感，而许昌菌株最不敏感，敏感性相差20倍；甲基立枯磷的EC50值范围在0.035~0.512 μg/mL之间，其中漯河菌株最为敏感，而商丘菌株最不敏感，敏感性相差3倍。此外，由表 1还可发现，小麦纹枯病菌对两种杀菌剂的敏感性菌株并非来自同一地区。
|
表 1 河南省不同地区小麦纹枯病菌对井冈霉素及甲基立枯磷的敏感性比较 Table 1 Sensitivity (EC50 value) of R. cerealis to jinggangmycin and tolclofos-methyl from different areas in Henan province |
2.3 不同地理来源菌株对井冈霉素和甲基立枯磷敏感性水平的系统聚类分析
SPSS聚类分析结果(图 3) 表明：井冈霉素对45个小麦纹枯病菌菌株的EC50值可分在5个聚类组中，所包括的菌株数分别为15、13、4、6及7个；甲基立枯磷对45个菌株的EC50值也分在5个聚类组中，所包括的菌株数分别为18、7、5、14及1个。不同来源的菌株系列出现在同一聚类组中，表明小麦纹枯病菌对供试两种杀菌剂的敏感性差异与菌株来源地理位置无明显相关性，这与LSD法的分析结果一致。尽管每种杀菌剂对菌株的EC50值可分为不同的聚类组，但两种杀菌剂的聚类组所包含的菌株并无相似之处。
|
图 3 井冈霉素和甲基立枯磷对小麦纹枯病菌EC50值的系统聚类分析 Fig. 3 Hierarchical cluster analysis on EC50 values of jinggangmycin and tolclofos-methyl to R. cerealis |
2.4 小麦纹枯病菌对井冈霉素及甲基立枯磷敏感性之间的相关性
EC50值线性回归分析结果表明：小麦纹枯病菌菌株对井冈霉素的敏感性与其对甲基立枯磷敏感性的F检验显著水平(P值) 为0.000 2，小于0.05，即在P=0.05水平上差异显著，b值为正，但由于其R2值为1.0 × 10-6 (y=0.000 7x + 0.139)，小于0.8，因此认为小麦纹枯病菌对两种药剂的敏感性之间无明显相关性。
3 小结与讨论甲基立枯磷对小麦纹枯病菌菌丝生长的抑制效果优于井冈霉素；病原菌不同菌株之间对药剂的敏感性差异较大，这可能源自病原菌本身存在的生理差异以及群体组成的多样性，也可能与生产中使用的药剂间存在微弱的交互抗性有关；不同地理来源病原菌群体对井冈霉素和甲基立枯磷的敏感性间均存在显著性差异，个别地区的菌株对井冈霉素的敏感性已表现出下降趋势，说明不同地区或地块的用药水平已引起病原菌对井冈霉素敏感性的变化。研究表明，河南省小麦纹枯病菌对甲基立枯磷仍表现敏感，但不同地区菌株对井冈霉素的敏感性已出现分化，因此生产中应密切监测不同地区菌株对井冈霉素的敏感性变化动态。
夏慧[13]根据江苏省65株小麦纹枯病菌对井冈霉素的EC50值，得到其敏感性基线参考值为0.225 μg/mL；孙海燕等[6]测定了江苏省1984年9个、2001年35个、2010年36个小麦纹枯病菌菌株对井冈霉素的敏感性，其EC50均值分别为0.670、0.600和0.600 μg/mL。本研究结果与夏慧及孙海燕等的结果均有差异，其原因可能是由于菌株地理来源、供试菌株数目及用药时间长短不同造成的。张骞等[7]的研究结果表明，甲基立枯磷对小麦纹枯病菌具有很高的抑制活性，EC50和EC90值分别为0.096和1.764 μg/mL。祁之秋[14]测定了50株小麦纹枯病菌对甲基立枯磷的敏感性，平均EC50值为0.123 μg/mL。本研究结果与上述文献报道相似。
夏晓明等[15]在室内通过药剂驯化的方法诱导获得了抗井冈霉素的禾谷丝核菌菌株，认为禾谷丝核菌对井冈霉素的抗药性发展比较迅速，抗性风险较大。此外，夏晓明等[15]及胡燕等[16]检测了田间小麦纹枯病菌对井冈霉素的敏感性，发现中国江苏、山东等地的田间菌株均已产生了抗药性。但夏晓明等[15]选择的敏感菌株只有一个，且分离自山东泰山中天门狗尾草上，并非来源于小麦。而且他们测定的菌株数量较少(均是4个地区采集的5个菌株)，不能全面反映田间小麦纹枯病菌对井冈霉素的敏感性现状[15-16]。而孙海燕等[6]对江苏省1984年9个、2001年35个及2010年36个菌株的测定结果则表明，26年间江苏省小麦纹枯病菌对井冈霉素的敏感性未发生显著性变化。由于孙海燕等[6]的研究中采自河南省的菌株仅有10个，且全部来源于商丘地区，而关于河南省小麦纹枯病菌对井冈霉素的敏感性也未见其他报道，因此，综合本研究结果及孙海燕等的结果，可以认为，河南省小麦纹枯病菌对井冈霉素仍属于敏感范围，田间尚未出现对井冈霉素具有抗性的菌株。张骞等[17]采用紫外诱变方法获得了小麦纹枯病菌抗甲基立枯磷的菌株，但发现抗性菌株的适合度较低，提高药剂剂量即可控制其生长。总体来看，小麦纹枯病菌对井冈霉素及甲基立枯磷的抗药性风险均较低。此外，齐永志等[11]及Zhang等[18]分别在研究小麦纹枯病菌对噻呋酰胺(thifluzamide) 的抗性风险时也得到了相同的结果。这可能与小麦纹枯病菌属于异宗配合真菌，其自身存在异核体有关。
已有研究结果表明：井冈霉素主要是抑制纹枯病菌体内海藻糖酶的活性，阻止海藻糖分解为葡萄糖，从而使病原菌菌丝的伸长生长受到抑制[5]。本研究中在进行敏感性测定时采用了PSA培养基，其中蔗糖的存在对于药剂的抑制作用可能会产生一定的补偿作用，从而使得测定结果(EC50值) 偏大。农业部农药检定所颁布的井冈霉素毒力测定行业标准[19]中推荐使用E培养基，其成分为：K2HPO4 2 g，KH2PO4 2 g，葡萄糖10 g，琼脂粉12 g，用蒸馏水定容至1 000 mL。但在实际应用中，使用PSA培养基进行井冈霉素的毒力测定也有报道[6]。
综上所述，由于河南省小麦纹枯病菌对井冈霉素及甲基立枯磷仍均较为敏感，田间尚未检测到抗药性菌株，且病原菌对这两种药剂的抗性风险均属于低风险级，故两种药剂依然可用于该省生产中小麦纹枯病的防治。但为避免抗药性的产生，应同其他防治方法结合施用。Peng等[20]将苯醚甲环唑(difenoconazole) 同枯草芽孢杆菌NJ-18协同用于小麦纹枯病的防治，不但防治效果比单剂显著提高，而且降低了农药用量，有利于延缓抗药性的产生。该思路值得井冈霉素及甲基立枯磷两种药剂在小麦纹枯病防治上借鉴。
| [1] | LEMAŃCZYK G, KWAŚNA H. Effects of sharp eyespot (Rhizoctonia cerealis) on yield and grain quality of winter wheat[J]. Eur J Plant Pathol, 2013, 135(1): 187–200. doi:10.1007/s10658-012-0077-3 |
| [2] | HAMADA M S, YIN Y N, CHEN H G, et al. The escalating threat of Rhizoctonia cerealis, the causal agent of sharp eyespot in wheat[J]. Pest Manag Sci, 2011, 67(11): 1411–1419. doi:10.1002/ps.2236 |
| [3] |
汪敏, 吕柏林, 邢小萍, 等. 河南省小麦纹枯病菌的群体组成及其致病力分化研究[J]. 植物病理学报, 2011, 41(5): 556–560.
WANG M, LV B L, XING X P, et al. Composition and virulence variation of the pathogen of wheat sharp eyespot from Henan province[J]. Acta Phytopathologica Sinica, 2011, 41(5): 556–560. |
| [4] | ZHOU M G, JIA X J. Wheat pathogens in China[M]//ISHⅡ H, HOLLOMON D W. Fungicide resistance in plant pathogens:principles and a guide to practical management. Tokyo:Springer, 2015:313-328. |
| [5] |
陈小龙, 方夏, 沈寅初. 纹枯病菌对井冈霉素的作用机制、抗药性及安全性[J]. 农药, 2010, 49(7): 481–483.
CHEN X L, FANG X, SHEN Y C. Mechanism, resistance and security of jinggangmycin against Rhizoctonia solani[J]. Agrochemicals, 2010, 49(7): 481–483. |
| [6] |
孙海燕, 丁晓菲, 杜文珍, 等. 江苏、河南、安徽和山东四省小麦纹枯病菌对井冈霉素的敏感性监测[J]. 农药学学报, 2011, 13(6): 653–656.
SUN H Y, DING X F, DU W Z, et al. Monitoring of sensitivity of Rhizoctonia cerealis to jinggangmycinin Jiangsu, Henan, Anhui and Shandong provinces[J]. Chin J Pestic Sci, 2011, 13(6): 653–656. |
| [7] |
张骞, 叶钟音. 甲基立枯磷对植物病原真菌和细菌的活性测定[J]. 农药学学报, 2000, 2(1): 85–87.
ZHANG Q, YE Z Y. Activity of tolclofos-methyl inhibiting fungi and bacteria of plant pathogen[J]. Chin J Pestic Sci, 2000, 2(1): 85–87. |
| [8] | BOEREMA G H, VERHOEVEN A. Check-list for scientific names of common parasitic fungi. Series 2b fungi on field crops:cereals and grasses[J]. Neth J Plant Pathol, 1977, 83(5): 165–204. doi:10.1007/BF01976647 |
| [9] |
慕立义.
植物化学保护研究方法[M]. 北京: 中国农业出版社, 1994: 79-81.
MU L Y. Research methods of plant chemical protection[M]. Beijing: China Agriculture Press, 1994: 79-81. |
| [10] |
祁之秋, 鞠雪娇, 纪明山, 等. 辽宁省稻瘟病菌对咪鲜胺敏感基线的建立[J]. 农药学学报, 2012, 14(6): 673–676.
QI Z Q, JU X J, JI M S, et al. Sensitive baseline of Magnaporthe grisea to prochloraz in Liaoning province[J]. Chin J Pestic Sci, 2012, 14(6): 673–676. |
| [11] |
齐永志, 李海燕, 苏媛, 等. 小麦纹枯病菌对噻呋酰胺的敏感性及抗药性突变体的主要生物学性状[J]. 农药学学报, 2014, 16(3): 271–280.
QI Y Z, LI H Y, SU Y, et al. Sensitivity to trifluzamide and main biological characteristics of resistant mutants of Rhizoctonia cerealis[J]. Chin J Pestic Sci, 2014, 16(3): 271–280. |
| [12] |
甘林, 代玉立, 滕振勇, 等. 福建省玉米小斑病菌对丙环唑、烯唑醇和咪鲜胺的敏感性[J]. 农药学学报, 2016, 18(2): 194–200.
GAN L, DAI Y L, TENG Z Y, et al. Sensitivity of Bipolaris maydis to propiconazole, diniconazole and prochloraz in Fujian province[J]. Chin J Pestic Sci, 2016, 18(2): 194–200. |
| [13] |
夏慧.稻、麦纹枯病菌对井岗霉素的敏感性及其影响因素的研究[D].扬州:扬州大学, 2004:27-35.
XIA H. Sensitivity of Rhizoctoniacerealis and R. solani to jinggangmycin and some factors influencing the sensitivity[D]. Yangzhou:Yangzhou University, 2004:27-35. |
| [14] |
祁之秋.小麦纹枯病菌对常用杀菌剂敏感性基线及化学防治原理研究[D].南京:南京农业大学, 2001:24-32.
QI Z Q. Study on the sensitivity baseline of Rhizoctonia cerealis to modern fungicides and the principle of chemical control[D]. Nanjing:Nanjing Agricultural University, 2001:24-32. |
| [15] |
夏晓明, 王开运, 王怀训, 等. 禾谷丝核菌对井冈霉素的抗性风险预测[J]. 农药学学报, 2006, 8(2): 115–120.
XIA X M, WANG K Y, WANG H X, et al. Studies on the resistance risk forecast to validamycin against Rhizoctonia cerealis[J]. Chin J Pestic Sci, 2006, 8(2): 115–120. |
| [16] |
胡燕, 王怀训, 夏晓明, 等. 四地区小麦纹枯病菌对6种杀菌剂的抗性比较[J]. 植物保护学报, 2006, 33(4): 423–427.
HU Y, WANG H X, XIA X M, et al. Susceptibility of Rhizoctonia cerealis to six fungicides in four wheat areas[J]. Acta Phytophylacica Sinica, 2006, 33(4): 423–427. |
| [17] |
张骞, 周明国, 叶钟音. 植物病原真菌对甲基立枯磷的抗药性及风险研究[J]. 农药学学报, 2000, 2(2): 22–28.
ZHANG Q, ZHOU M G, YE Z Y. Resistance risk of plant pathogenous fungi to tolclofos-methyl[J]. Chin J Pestic Sci, 2000, 2(2): 22–28. |
| [18] | ZHANG Y, LU J L, WANG J X, et al. Baseline sensitivity and resistance risk assessmemt of Rhizoctonia cerealis to thifluzamide, a succinate dehydrogenase inhibitor[J]. Pestic Biochem Physiol, 2015, 124: 97–102. doi:10.1016/j.pestbp.2015.05.004 |
| [19] |
农药室内生物测定试验准则--杀菌剂第18部分:井冈霉素抑制水稻纹枯病菌试验E培养基法:NY/T 1156.18-2013[S].北京:中国农业出版社, 2013.
Pesticides guidelines for laboratory bioactivity tests-Part 18:E-medium test for determining jinggangmycin inhibition of Rhizoctonia solani Kühn growth on rice:NY/T 1156.18-2013[S].Beijing:China Agriculture Press, 2013. |
| [20] | PENG D, LI S D, CHEN C J, et al. Combined application of Bacillus subtilis NJ-18 with fungicides for control of sharp eyespot of wheat[J]. Biol Control, 2014, 70: 28–34. doi:10.1016/j.biocontrol.2013.11.013 |