2016, Vol. 18
化学农药使用后在靶标作物上的残留消解动态直接影响其防治效果和持效期[1-3]。检测农药在植物组织内的残留量及其变化是科学使用农药的基础，对于确定田间用药剂量、次数和安全间隔期，减少农药用量，保护生态环境和农产品质量安全都具有重要意义。而建立高效、准确、灵敏和选择性好的检测方法，是了解农药在靶标组织内残留消解动态的基础。
近年来，有关农药在农产品中残留量分析方法的研究报道较多，检测部位多集中在果实和叶片等农作物的收获部位，检测结果主要服务于食品安全；而对于农作物非收获部位组织内农药残留量分析，主要服务于病虫防治。由于影响检测结果的因子多，相关方法报道较少[4-9]。苹果叶片中含有大量的酚类、酯类和色素等次生物质，对农药残留分析结果存在一定干扰，若不能有效去除这些干扰物质，不但影响检测结果的准确性，还会污染色谱柱与检测器[10-13]。
目前，可用于苹果叶片中农药残留检测的前处理方法主要有液液萃取[14]、固相萃取[15-16]、固相微萃取[17-18]、QuEChERS (Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe) 等[19-21]。其中，固相萃取和 QuEChERS 因操作简便、快速、回收率较高，已成为农药残留检测的首选萃取方法；液液萃取作为传统的方法，也有其优点，值得尝试。可用于苹果叶片中农药的残留检测的方法有高效液相色谱法 (HPLC)[22]、气相色谱法 (GC)[14, 18]、气相色谱-质谱联用法 (GC-MS)[16-17] 和高效液相色谱-质谱联用法 (HPLC-MS) 等方法[8-9, 12-13, 23-25]。其中，超高效液相色谱-串联质谱检测 (UPLC-MS/ MS) 具有分离速度快、灵敏度高和选择性强等优势，是农药残留检测的首选方法。
吡唑醚菌酯 (pyraclostrobin，图式 1) 是一种新型、高效、低毒的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，具有良好的保护、治疗和内吸传导活性，在农业生产上应用较为广泛，也是防治苹果病害的主要推荐药剂[26-27]。本研究比较了液液萃取、固相萃取以及 QuEChERS 方法对苹果叶片中吡唑醚菌酯添加回收率的影响，改进了 QuEChERS 方法；并以改进后的 QuEChERS 为前处理方法，建立了苹果叶片中吡唑醚菌酯残留量的超高效液相色谱-串联质谱检测方法，并验证了其可靠性。
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图式 1 吡唑醚菌酯结构式 Scheme1 The structure of pyraclostrobin |
1 材料与方法 1.1 主要仪器和试剂
超高效液相色谱-质谱联用仪 (UPLC-MS/MS，安捷伦，美国)：Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统；Agilent 6430 串联三重四极杆质谱仪，配 Mass Hunter Qualitative Analysis B.04.00 工作站；Agilent Poroshell 120 EC-C18 超高效液相色谱柱 (75 mm × 2.1 mm，2.7 μm)。Vortex-Genie 2 涡旋仪 (Scientific，美国)；Eppendorf 5810/R 多功能台式冷冻离心机 (Eppendorf，德国)；AB135-S/FACT 分析天平 (精度 1/100 000，梅特勒-托利多，美国)；氮吹仪 (Organomation，美国)；SUPELCO 固相萃取装置 (康林科技，中国)；WS-12D 背负式电动喷雾器 (卫士植保机械，中国)。
吡唑醚菌酯 (pyraclostrobin) 标准品 (纯度 97%) 和 25% 吡唑醚菌酯乳油 (25% EC)，购于德国巴斯夫公司；乙二胺-N-丙基甲硅烷 (PSA)、石墨化碳黑 (GCB) 和 Cleanert PestiCarb/NH2 固相萃取柱 (体积 6 mL，由等量的石墨化碳和氨基装填而成，填料量为 0.50 g，平均粒径 38~120 μm，比表面积 100 m2/g)，购于中国 Agela 公司；甲醇和乙腈为色谱纯；氨水、甲酸、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和丙酮为分析纯；超纯水由 Millipore 公司 (Bedford，美国) 的超纯水系统制备。
1.2 标准溶液配制吡唑醚菌酯标准品用乙腈溶解配制成 100 mg/L 的标准母液，于 4 ℃ 保存，备用。使用时用乙腈分别稀释配成质量浓度为 0.1、1.0、10.0、20.0 和 50.0 mg/L 的系列标准工作溶液。
1.3 苹果叶片的采集与预处理试验于 2015 年 8 月中旬在中国山东省青岛农业大学胶州科技示范园进行。选取长势良好、叶片健康、2 年内未使用过杀菌剂的 5~6 年生‘富士’苹果树供试。将 25% 吡唑醚菌酯乳油稀释成 1 000 mg/L 的药液，用背负式电动喷雾器均匀喷洒到整株树上，直到叶片上有药液流下为止。药剂处理设 3 个小区，清水空白对照处理设 1 个小区。每小区 3 株树，喷液量为 10 L。于施药后 3、7、14、21 和 28 d，分别从每株树的东、南、西、北和中 5 个方位随机取 1 根枝条，从中部摘取 2 片树叶。每小区共选取大小一致、健康无损叶片 30 片，去除叶柄，剪碎混匀，四分法留样 20 g，于 -80 ℃ 保存，待前处理。
1.4 萃取方法的比较和选择称取 1.00 g (精确到 0.01 g) 空白对照叶片样品 12 份，分成 3 组，每组 4 份，加液氮研磨后，置于 50 mL 离心管中，分别添加 0.1、1.0 和 10.0 mg/L 的吡唑醚菌酯标准溶液和乙腈各 1 mL，静置 1 h 左右后，经氮气吹干。以未添加药剂的苹果叶片为空白对照。比较 QuEChERS、液液萃取和固相萃取 3 种方法对苹果叶片中吡唑醚菌酯回收率的影响。试验重复 3 次。
1.4.1 QuEChERS 法取第 1 组标准添加样品，分别加入 5 mL 乙腈、1.00 g 无水硫酸镁和 0.50 g 氯化钠，涡旋 2 min；于 8 000 r/min 下离心 3 min；取上清液 3 mL 转移至 10 mL 离心管中，加入 1.50 g 无水硫酸镁、0.30 g 氯化钠、0.066 g PSA 和 0.06 gGCB，涡旋振荡 2 min；于 8 000 r/min 下离心2 min；取上清液 1 mL，过 0.22 μm 微孔滤膜，待测。
1.4.2 液液萃取取第 2 组标准添加样品，加入 25 mL V (丙酮) : V (水) = 5:2 的溶液，振荡 12 h；于 9 000 r/min 下离心 10 min；取上清液，用 20 mL 二氯甲烷萃取 3 次；萃取液经氮气吹干，残渣用 2 mL 乙腈清洗，清洗液过 0.22 μm 滤膜，待测。
1.4.3 固相萃取取第 3 组标准添加样品，加入 5 mL 乙腈，涡旋 2 min；分别添加 1.00 g 无水硫酸镁、0.40 g 氯化钠，涡旋振荡 2 min；于 8 000 r/min 下离心 10 min；将固相萃取柱用 4 mL V (乙腈) : V (甲苯) = 3 : 1 的混合溶液活化后，取 3 mL 上清液淋洗，再用 25 mL 上清液洗脱，流速 1 mL/min；收集全部淋洗液，氮吹浓缩至 1 mL，过 0.22 μm 滤膜，待测。
1.5 QuEChERS 净化填料配方的优化为了提高萃取效率，减少苹果叶片中杂质对分析结果及仪器的影响，对 QuEChERS 填料配方进行了优化。以样品的添加回收率和萃取液颜色为指标，评估填料配方对萃取结果的影响。试验设 9 个处理，每处理重复 3 次，各处理净化填料及用量见表 1。吡唑醚菌酯添加水平为 0.10 mg/kg，检测样品的回收率，并进行方差分析。
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表 1 QuEChERS 方法中不同填料配比对苹果叶片中吡唑醚菌酯添加回收率的影响 (n = 3) Table 1 Effects of added substances and their proportion in QuEChERS on the recoveries of pyraclostrobin from apple leaves (n = 3) |
1.6 实测样品的前处理方法
根据上述优化选择结果，准确称取 1.00 g 样品，加液氮研磨后，置于 50 mL 离心管中，加入 5 mL 乙腈，涡旋振荡 2 min；于 8 000 r/min 条件下离心 3 min；取上清液 3 mL 转移至 10 mL 离心管中，加入 0.075 g PSA 和 0.060 g GCB，涡旋振荡 2 min；于 8 000 r/min 下离心 2 min，取上清液 1 mL 过 0.22 μm 微孔滤膜，待测。
1.7 检测条件色谱条件：Agilent Poroshell 120 EC-C18 超高效液相色谱柱 (75 mm × 2.1 mm，2.7 μm)，柱温 30 ℃；V (0.1% 甲酸) :V (乙腈) =25:75 混合溶液等度洗脱，流速 0.3 mL/min,分离时间 5.0 min；进样量 5 μL。
质谱条件：电喷雾离子源，正离子电离 (ESI+) 模式；毛细管电压为 3.0 kV；锥孔反吹气流速 8 L /min；锥孔反吹气温度为 300 ℃；去溶剂气为高纯氮气，流速 10 L/min，温度 350 ℃；碰撞气为高纯氮气；多反应监测 (MRM) 模式，监测定性母离子为 m/z 388.0 ，定性子离子为 163.0 和 194.0，定量子离子为 194.0，碰撞能 (CE) 为 8 eV；通过 Mass Hunter Qualitative Analysis B.04.00 工作站采集处理数据。
1.8 基质效应以 TIC 峰面积为仪器响应值，采用相对响应值法研究苹果叶片的基质效应[28-29]。在苹果叶片空白基质溶液和乙腈溶剂中，吡唑醚菌酯的添加水平分别为 0.01 和 0.10 mg/kg。根据公式 ME = Am/Ac × 100% 计算基质效应。式中，ME 表示基质效应，Am 表示基质匹配标准溶液的 TIC 峰面积，Ac 表示乙腈溶剂标准溶液的 TIC 峰面积。当 ME 值小于 100% 时，表示基质有抑制效应；当 ME 值大于 100% 时，为增强效应；当 ME 值为 90%~110% 时，则认为基质效应不明显。
2 结果与讨论 2.1 萃取方法的比较和选择3 种萃取方法中，QuEChERS 法对不同添加水平吡唑醚菌酯的回收率均较高，3 个添加水平的平均回收率为 97%，标准差 (SD) 为 5.8；液液萃取回收率较低，3 个添加水平的平均回收率为 71%，不同水平间及同一水平重复间的差异较大，SD 为 18.3；固相萃取在高添加水平下回收率高，而在低添加水平下回收率低，不同水平及同一水平不同重复间变异大 (图 1)。此外，液液萃取时间较长，有机溶剂用量较大；固相萃取中萃取柱多为一次性耗材，成本较高；相比而言，QuEChERS 法操作简便，有机溶剂用量较少，耗时较短，适合大批量样品的前处理。因此，将 QuEChERS 法作为苹果叶片中吡唑醚菌酯残留检测的前处理方法。
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图 1 QuEChERS (QuE)、液液萃取 (LLE) 和固相萃取 (SPE) 对苹果叶片中吡唑醚菌酯添加回收率的影响 Fig. 1 The effects of pretreatment methods [QuEChERS (QuE), liquid-liquid extraction (LLE) and solid phase extraction (SPE)] on the recovery rates of pyraclostrobin from apple leaves |
2.2 QuEChERS 净化填料配方的优化
结果 (表 1) 表明：当无水硫酸镁和氯化钠的添加量分别由 0.500 g/mL 和 0.100 g/mL 减少为 0 时，吡唑醚菌酯的回收率变化不明显，表明无水硫酸镁和氯化钠对苹果叶片中吡唑醚菌酯的回收率无显著影响。添加无水硫酸镁及氯化钠主要用于去除含水量较高样品中的水分，而苹果叶片的含水量相对较低，为防止两种盐类可能对质谱系统的损害，苹果叶片样品前处理时可不必添加无水硫酸镁和氯化钠。当其他条件不变时，随 PSA 和 GCB 用量的增加，回收率降低；当 PSA 和 GCB的用量同时增加至 0.030 g/mL 时，回收率降至 74%；当 GCB 用量由 0.020 g/mL 减少至 0.010 g/mL 时，回收率虽无显著变化，但样品萃取液颜色较深，表明 GCB 和 PSA 用量可显著影响添加回收率和萃取液的净化度。综合考虑回收率和净化度，最终选择在 QuEChERS 处理中，不添加无水硫酸镁和氯化钠，而 PSA 和 GCB 的添加量分别为 0.025 g/mL 和 0.020 g/mL。
2.3 色谱和质谱检测条件的选择为优化质谱检测参数，采用电喷雾正离子和负离子模式对 0.10 mg/L 的吡唑醚菌酯标准溶液进行了母离子扫描。结果表明：吡唑醚菌酯在正离子模式下信号丰度远高于负离子模式，从而确定吡唑醚菌酯的母离子为 m/z 388.0。进一步对子离子、碎裂电压、碰撞能量等参数进行优化，结合样品基质效应的影响，综合方法的灵敏度和选择性，最终选择 m/z 388.0 ＞ 194.0 作为定量离子对，m/z 388.0 ＞ 163.0 为定性离子对。
为缩短样品分析时间和减少干扰，对色谱流动相和分离条件进行了优化。结果 (图 2) 表明：以乙腈和 0.1% 甲酸作为流动相时，目标峰与杂质峰可得到较好的分离，吡唑醚菌酯的保留时间为 1.6 min，色谱分离时间为 5.0 min。
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图 2 吡唑醚菌酯标准溶液 (A, 10.0 mg/L) 及苹果叶片标准添加样品的色谱图 (B, 0.01 mg/kg) Fig. 2 The chromatogram of the standard sample of pyraclostrobin (A, 10.0 mg/L) and the apple leaf samples with the standard pyraclostrobin (B, 0.01 mg/kg) |
2.4 基质效应
检测结果表明：当吡唑醚菌酯添加量为 0.01 和 0.10 mg/kg 时，ME 值分别为 101% 和 105%，说明存在微弱的基质增强效应，但 ME 值在 90%~110% 范围内，表明苹果叶片的基质效应不明显。
2.5 方法的线性范围、定量限、精密度及准确度为了减少基质效应对分析结果的影响，本研究采用了相应的空白基质匹配标准曲线进行校正，外标法定量。每个水平的标准溶液重复进样 6 次，次日重复测定，确定日内和日间相对标准偏差 (RSD)。以 MS/MS 定量离子色谱峰峰面积 (y) 对质量浓度 (x) 绘制标准曲线，线性回归方程为 y = 9 410 662.13x-8 017.60 (R2 = 0.992 4) ，线性范围 0.01~50.0 mg/L，日内和日间相对标准偏差分别为 3.1% 和 5.9%。采用标准添加法，得到吡唑醚菌酯在苹果叶片中的定量限 (LOQ，以 S/N ≥ 10 计) 为 0.01 mg/kg。
采用所建立方法对苹果叶片中吡唑醚菌酯的添加回收率进行了验证。结果表明：在 0.01~10 mg/kg 4 个添加水平下，苹果叶片中吡唑醚菌酯的回收率为 92%~99%，相对标准偏差为 2.2%~5.3% (表 2)，可满足农药残留检测的要求[30]。
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表 2 吡唑醚菌在苹果叶片中的添加回收率及相对标准偏差 (n = 5) Table 2 The recoveries and RSDs of pyraclostrobin in apple leaves (n = 5) |
2.6 实际样品测定结果
采用本研究建立的方法，对施药后 3~28 d 苹果叶片中吡唑醚菌酯的残留量进行了检测。结果 (图 3) 表明：苹果叶片中吡唑醚菌酯残留量与施药后时间的关系可用模型 ct = 79.87 e -0.053 3 t (R2 = 0.909 7) 拟合，半衰期为 13 d。
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注：不同符号为 3 次重复的实测数据，实线为拟合模型 Note: The symbols in the figure were detecting values and the solid line was the fitting model. 图 3 吡唑醚菌酯在苹果叶片中的残留消解动态 (n = 3) Fig. 3 Residual quantity dynamics of pyraclostrobin in apple leaves (n = 3) |
3 结论
对于苹果叶片样品中吡唑醚菌酯的萃取与净化，QuEChERS 方法在添加回收率、有机溶剂用量、萃取效率方面都具有一定优势；该方法中添加的无水硫酸镁和氯化钠主要用于吸收样品中的多余水分和浓缩样品，对于含水较少的苹果叶片组织作用不大，因而可不必添加；净化步骤中添加的 PSA 和 GCB 主要用于去除萃取物中的杂质，但对检测目标成分也有吸附作用，因而其具体用量需根据实际样品的性质确定。以全自动进样器、小颗粒填料色谱柱、超高压输液泵、高灵敏度质谱检测器为主要组成的超高效液相色谱-质谱检测系统，在样品的分析自动化程度、检测灵敏度、分析速度和有机流动相耗费方面具有显著优势。
本研究选择优化后的 QuEChERS 法进行样品前处理，结合超高效液相色谱-串联质谱技术，建立了苹果叶片中吡唑醚菌酯残留量的检测方法。当 PSA 和 GCB 的用量分别为 0.025 和 0.020 g/mL 时，样品萃取与净化效果较好。采用安捷伦 1290 Infinity 超高效液相色谱系统以及 Poroshell 120 EC 超高压色谱柱，提高了分离效率，缩短了样品分析周期 (目标峰保留时间 1.6 min，单个样品检测时间 5.0 min)，适合于苹果叶片中吡唑醚菌酯的快速分析。该方法的添加回收率不低于 92%，线性范围为 0.01~50.0 mg/L，定量限为 0.01 mg/kg；方法简便、灵敏度高、选择性好。
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