2016, Vol. 18
从自然界中寻找微生物源绿色药剂是防治植物病害的新途径，拮抗微生物因其抗性机制多样、对环境安全、可调节植物生长等特点被广泛关注，目前已发现在由微生物产生的 8 000 多种具有生物活性的物质中，近 70% 由放线菌产生。其中，放线菌中以链霉菌属菌株所产生的活性物质最多，占总数的 50% 以上[1-4]。目前，国内外已有多种链霉菌株应用于植物病害的生物防治领域[5-6]，寻找链霉菌属菌株防治植物病害成为研究热点。
由苹果树腐烂菌 Valsa mali Miyabe et Yamada 引起的苹果树腐烂病是危害果树枝干的严重病害[7]。近年来，该病已成为限制中国苹果产区生产的首要病害，发生严重时会导致毁园[8]。目前生产中主要依靠刮斑后涂抹农药的方法防治该病，但在农药使用中存在影响苹果品质、污染环境等问题[9-10]，因此，开发新的无公害药剂成为研究热点。
在采用生防菌防治苹果树腐烂病的研究中，已筛选获得了枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis LZ-1201、卡伍尔链霉菌 Streptomyces cavourensis A2 和微嗜酸寡氧单胞菌 Stenotrophomonas acidaminiphila BJ1 等菌株，发现其在室内对苹果树腐烂病菌均有良好的抑制作用[11-13]。本实验室从秦岭自然保护区野果林土壤中分离到 1 株放线菌菌株 SL01，根据其形态学特征、生理生化特征和基于 16S rDNA 基因序列 (KM670435.1) 的系统发育分析结果，被鉴定为极长链霉菌 Streptomyces longissimus SL01 (CGMCC No.9543) 。初步研究表明，该菌株的发酵液能有效抑制苹果树腐烂菌 V. mali 的生长。
链霉菌代谢产物的产量受发酵条件影响较大[14]，为了提高该菌株中抑菌活性物质的产量和进一步开发该抗菌物质，本研究对其发酵培养基和摇瓶发酵条件进行了优化，并初步研究了其产生的抑菌活性物质的理化特性及对苹果树腐烂病的防效。
1 材料与方法 1.1 供试链霉菌菌株极长链霉菌 Streptomyces longissimus SL01 (CGMCC No.9543) 菌株分离于陕西省秦岭自然保护区野果林土壤中，由西北农林科技大学植物病害生物防治实验室筛选、保存及鉴定。
1.2 供试培养基和培养液 1.2.1 平板培养基[15]：高氏 1 号固体培养基，用于活化菌株 SL01；高氏 1 号液体培养基，用于种子液和基础培养液制备；PDA 培养基，用于苹果树腐烂菌及其他供试病原菌的活化与抑菌活性测定。
1.2.2 SL01 种子液制备将菌种 SL01 接种于高氏 1 号培养基中，于 28 ℃ 下培养 6 d，得到活化菌株。接种 2 环活化菌株于高氏 1 号液体培养基中，装液量为 50 mL/250 mL，于 25 ℃、180 r/min 下振荡培养 3 d，得到菌株 SL01 的种子液。
1.2.3 基础培养液以 2% 的接种量将 SL01 种子液接种于高氏 1 号液体培养基中，于 28 ℃、180 r/min下振荡培养 6 d，得到菌株 SL01 的基础培养液。
1.2.4 菌株 SL01 无菌培养液制备将 SL01 基础培养液在 10 000 r/min 下离心 10 min，取上清液，过直径 0.22 μm 的微孔滤膜，即为无菌培养液，用于抑菌活性检测。
1.3 供试植物病原菌苹果树腐烂菌 Valsa mali Miyabe et Yamada、大丽轮枝菌 Verticillium dahlia、尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum、粉红聚端孢 Trichothecium roseum、胶孢炭疽菌 Colletotrichum gloesporioides、灰葡萄孢 Botrytis cinerea、扩展青霉 Penicillium expansum、立枯丝核菌 Rhizoctonia solani、番茄叶霉 Fulvia fulva 和梨状毛霉 Mucor piriformis，由西北农林科技大学植物病害生物防治实验室提供。将保存的病原菌转接到 PDA 平板上，活化 4~5 d 备用。
1.4 试验设计 1.4.1 菌株 SL01 抑菌谱测定打取直径为 0.5 cm 的供试病原菌菌饼置于 PDA 平板中心，将直径为 0.5 cm 的 SL01 菌饼对称地接种在与供试病原菌相距 2.5 cm 处。以只接种病原菌的处理作为对照。每处理 3 次重复，每重复 4 个平皿。于 25 ℃ 暗培养 5 d，测定菌落直径，按公式 (1) 计算菌落生长抑制率。
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(1) |
1) 采用单因素变量法[16]，改变基础培养液碳源，其他物质不变。分别以 2% 玉米粉、葡萄糖、小米粉、大米粉、蔗糖、麦芽糖、木糖、果糖和阿拉伯糖代替可溶性淀粉作为碳源，以不加糖类碳源为对照，于 28 ℃、180 r/min 下振荡培养 6 d。采用牛津杯法[17]：在 PDA 平板中央放置牛津杯，加入 20 μL 无菌发酵液，在距离牛津杯 2.5 cm 处对称放置苹果树腐烂菌菌饼，于 25 ℃ 暗培养 3 d，测量 SL01 无菌培养液对苹果树腐烂菌产生的抑菌圈大小，以抑菌圈最大的作为最佳碳源。每处理重复 3 次。2) 以最佳碳源为基础，分别以质量分数为 1% 的黄豆粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、NH4NO3、NH4Cl 和(NH4)2SO4 代替 KNO3 作为氮源发酵，以不加氮源为对照，采用相同方法筛选最佳氮源。 3) 以优化得到的最佳碳、氮源为基础，分别添加质量分数为 0.1% 的 CaCl2、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4、NaCl 和 0.01% FeSO4·7H2O，以不加无机盐为对照，筛选最佳无机盐。
1.4.2.2 正交试验设计在单因素试验基础上，采用正交试验法，利用 3 因素 3 水平 L933 优化培养液配方 (表 1)。
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表 1 碳源、氮源和无机盐的正交试验设计表 Table 1 Orthogonal test on carbon source, nitrogen source and inorganic salt |
1.4.2.3 发酵条件优化
参考文献[18]方法，采用最佳培养液配方，以 1.2.3 节中发酵条件为基础条件，分别依次改变 SL01 发酵天数 (4、5、6、7、8、9 d)、发酵温度 (25、28、32、35 ℃)、初始 pH 值 (5.0、6.0、7.0、8.0、9.0) 、接种量 (1%、2%、3%、4%、5%)、装样量 (50 mL/250 mL、100 mL/250 mL、150 mL/250 mL、200 mL/250 mL) 和摇床转速 (100、120、150、180、200 r/min)，采用牛津杯法检测抑菌圈大小，确定 SL01 最优发酵条件。每个试验重复 3 次。
1.4.3 SL01 优化后发酵液离体防效评价 1.4.3.1 离体枝条防效评价采用臧睿等[19] 的烫伤接种法，剪取 1~2 a 生、粗细一致的富士苹果树枝条，截为 15 cm 小段。先用清水清洗 2 次，再用 1% 的 NaClO 溶液进行表面消毒，最后用无菌水冲洗 3 次。晾干后两头蜡封，待用。用电烙铁 (Ф = 5 mm)烫伤树皮，烫伤处分别涂抹 500 μL 优化后的 SL01 发酵液和基础发酵液。以涂抹无菌水作为对照。每个烫伤处接种 1 个苹果树腐烂菌菌饼 (Φ = 5 mm)，每处理涂抹 5 根枝条。于 25 ℃ 下培养 7 d 后测量病斑大小，按照椭圆面积公式计算病斑面积，按公式 (2) 计算防效。
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(2) |
选取富士苹果果实，清水清洗 2 次后，用 1% 的 NaClO 溶液表面消毒，无菌水冲洗 3 次，晾干。 在苹果果实中部打孔 (Φ = 5 mm)，于打孔处分别涂抹 500 μL 优化后的 SL01 发酵液和基础发酵液。以涂抹无菌水作为对照。每个打孔处接种 1 个苹果树腐烂菌菌饼 (Φ = 5 mm)，每处理涂抹 5 个苹果。于 25 ℃ 下保湿培养 5 d 后测量病斑大小，按公式 (2) 计算防效。
1.4.4 抑菌活性物质的热稳定性、酸碱稳定性和紫外光稳定性测定参考文献[20]方法进行。
1.4.4.1 热稳定性将 SL01 无菌发酵液于不同温度 (40、60、80、100 ℃) 下处理 30 min。以未经热处理的发酵液作为对照。
1.4.4.2 酸碱稳定性将 SL01 无菌发酵液用 1 mol/L的盐酸和 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节至不同 pH 值 (2、4、6、8、10 和 12) ，静置 30 min，然后将 pH 值调回发酵液的自然 pH 值 (pH=7) 。以未经处理的发酵液作为对照。
1.4.4.3 紫外光稳定性将 SL01 无菌发酵液放在 20 W 紫外灯下照射不同时间 (2、4、6、8、10 和 12 h)。以未经紫外光照射的 SL01 无菌发酵液作为对照。
以上 3 种稳定性的检测均采取 1.4.2.1 节中方法，测量 SL01 无菌发酵液对苹果树腐烂菌所产生的抑菌圈直径。
1.5 数据统计运用 Microsoft Excel 2010 对原始数据进行统计，通过 SPSS 19.0 中 Duncan 氏方法比较数据差异显著性。
2 结果与分析 2.1 菌株 SL01 的抑菌谱抑菌活性测定结果 (表 2) 显示：在供试 10 种病原真菌中，菌株 SL01 具有广谱的抑菌活性，对多种植物病原菌均有较强的抑制作用。其中，对苹果树腐烂菌、尖孢镰刀菌和灰葡萄孢的抑制率达到 80% 以上；对大丽轮枝菌、立枯丝核菌和梨状毛霉的抑制率达到 70% 以上。
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表 2 菌株 SL01 对多种植物病原真菌的抑制效果 Table 2 Inhibition effect of strain SL01 on the fungal phytopathogens |
2.2 菌株 SL01 培养基组分的优化 2.2.1 碳源、氮源和无机盐对 SL01 发酵液抑菌活性的影响
由图 1 看出，菌株 SL01 在不同碳源的培养条件下其抑菌活性明显不同，其中有机碳源明显优于无机碳源，以小米作为碳源时 SL01 发酵液的抑菌效果最强，抑菌圈直径为 3.13 cm，因此选择小米作为菌株 SL01 发酵液的最佳碳源。
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注：a. 碳源对抑菌圈直径的影响; b. SL01 对苹果树腐烂菌的皿内抑制作用。 Ⅰ. 小米粉, Ⅱ. 淀粉, Ⅲ. 对照。图中不同大写字母表示差异极显著(P = 0.01)。 Note: a. Effect of carbon sources on inhibitory zone diameter. b. Inhibiting effect on Valsa mali in the dish. Ⅰ. millet powder, Ⅱ. starch, Ⅲ. control. The different letters indicate the significant differences at P = 0.01 level. 图 1 不同碳源对菌株 SL01 抑菌活性的影响 Fig. 1 Effect of carbon sources on inhibitory activity |
由图 2 看出，以有机氮源和无机氮源为培养基组分对 SL01 抑菌活性影响不大，当以酵母粉作为氮源时，SL01 的抑菌效果高于其他氮源，抑菌圈直径为 3.25 cm，因此选择酵母粉作为菌株 SL01 发酵氮源。
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注：图中不同大写字母表示差异极显著 (P = 0.01)。 Note: The different letters indicate the significant differences at P = 0.01 level. 图 2 不同氮源对菌株 SL01 抑菌活性的影响 Fig. 2 Effect of nitrogen sources on inhibitory activity |
由图 3 看出，培养基中加入不同的无机盐对于菌株 SL01 抑菌活性有不同影响，其中 0.1% 的 MgSO4·7H2O、0.1% 的 CaCl2 和 0.01% 的 FeSO4·7H2O 更有助于抑菌物质的产生。而以 0.1% MgSO4·7H2O 的效果最好，ZnSO4·7H2O 会降低发酵液的抑菌活性。故选用 MgSO4·7H2O 为发酵液的无机盐。
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注：图中不同大写字母表示差异极显著 (P = 0.01)。 Note: The different letters indicate the significant differences at P = 0.01 level. 图 3 不同无机盐对菌株 SL01 抑菌活性的影响 Fig. 3 Effect of inorganic salt on inhibitory activity |
2.2.2 培养基配方正交优化结果
在单因素试验基础上，选用小米粉为碳源 (A)、酵母粉为氮源 (B) 和 MgSO4·7H2O 为无机盐 3 种培养基成分在 3 个水平上优化培养基配方，结果见表 3。 可以看出，影响抑菌物质的量依次为：碳源＞氮源＞无机盐。试验条件下优化出的最佳发酵培养基配方为：A2B2C3，即小米粉 2.0%，酵母粉 1.0%，MgSO4·7H2O 0.15%。
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表 3 碳源、氮源和无机盐的正交试验分析表 Table 3 Orthogonal experiment analysis of carbon source, nitrogen source and inorganic salt |
2.3 发酵条件的优化 2.3.1 培养时间
由图 4A 看出，发酵前 7 d 内，随发酵时间增加，菌株 SL01 的抑菌活性逐渐升高，到第 7 天时抑菌活性达最大值，8 d 后活性基本不变。因此认为 7 d 为菌株 SL01 的最佳发酵时间。
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图 4 发酵时间(A)、温度(B)、初始 pH 值(C)、接种量(D)、装液量(E)和转速(F)对 SL01 发酵液抑菌活性的影响 Fig. 4 Effect of fermentation time(A), fermentation temperature(B), initial pH(C), inoculation quantity(D), medium volume(E) and rotation speed(F) on inhibitory activity of fermentation broth |
2.3.2 培养温度
由图 4B 看出，该菌株在 28 ℃ 时抑菌活性最强，随着温度上升，抑菌活性下降。最终确定 28 ℃ 为菌株 SL01 的最佳发酵温度。
2.3.3 培养液初始 pH 值由图 4C 看出，pH 值的变化对 SL01 的抑菌活性有显著影响。当培养液初始 pH 值为 7 时，菌株 SL01 产生的抑菌物质最多，抑菌效果最好，因此认为 pH = 7 是该菌株发酵的最佳 pH 值。
2.3.4 接种量由图 4D 看出，接种量为 2% 时菌株 SL01 活性最强。随接种量升高，抑菌活性逐渐下降。其原因可能是接种量升高后菌体的其他次级代谢产物影响了活性物质的产生。
2.3.5 溶氧量对 SL01 抑菌活性的影响摇瓶溶氧量与装液量和摇床转速密切相关。在转速一定的情况下，装液量越大，溶氧量越低。由图 4E 看出，随着装液量增加，发酵液的抑菌活性逐渐下降，其原因可能是低溶氧量会降低 SL01 活性物质的积累。最终选择最适装液量为 50 mL/250 mL。
在装液量一定的情况下，摇床的转速直接影响发酵液的溶氧量。由图 4F 看出，在转速为 100 r/min 时，菌株 SL01 的抑菌活性最低；随转速逐渐增加，其抑菌活性不断增强；当转速达 180 r/min 时，抑菌活性最强；再继续增加转速达 200 r/min 时，抑菌活性反而下降。这可能是由于转速过高后，菌体细胞壁破碎从而影响活性物质的产生。因此，在其他因素一定情况下，发酵液的最优化转速为 180 r/min。
2.4 条件优化后发酵液的离体防效评价由图 5A和5B 看出，用基础发酵液和优化后的发酵液处理枝条后，苹果树腐烂病斑面积分别为 4.32 和 1.39 cm2，即采用优化后的发酵液得到的菌株 SL01 对离体腐烂病枝条的防治效果提高了 39.86%。由图 5C和5D 可以看出，用基础发酵液和优化发酵液处理苹果果实后，病斑面积分别是 6.02 和 2.37 cm2，后者的防治效果比前者提高了 10.15%。上述结果表明，优化后的发酵条件能够显著提高 SL01 的生防潜力。
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A. SL01 发酵液处理枝条后的病斑面积；B. SL01 发酵液处理枝条后的发病照片；C. SL01 发酵液处理果实后的病斑面积；D. SL01 发酵液处理果实的发病照片。Ⅰ. 清水处理；Ⅱ. 基础发酵液处理；Ⅲ. 优化后发酵液处理。图中不同小写字母表示差异显著 (P = 0.05)。 A. Lesion area on twigs treated by SL01 fermentation broth; B. Photograph of lesion on twigs treated by SL01 fermentation broth; C. Lesion area on apple treated by SL01 fermentation broth; D. Photograph of lesion on apple treated by SL01 fermentation broth. Ⅰ. water treatment. Ⅱ. basis broth treatment. Ⅲ. optimized fermentation broth treatment. The different letters indicate the significant differences at P= 0.05 level. 图 5 优化前后 SL01 发酵液对苹果树腐烂病菌的离体抑制作用 Fig. 5 Inhibitory effect on Valsa mali treated by SL01 fermentation broth in vitro |
2.5 抑菌活性物质的稳定性 2.5.1 酸碱稳定性
由图 6 看出：当 pH 在 6~8 之间时，对发酵液抑菌活性影响不大；当 pH = 4 和 10 时，发酵液的抑菌活性分别降低 52.9% 和 25.8%，说明抑菌活性物质对酸性比对碱性更敏感。当 pH = 2 和 12，即为强酸、强碱环境时，抑菌活性均大为降低。说明 SL01 发酵产生的抑菌物质在中性环境时稳定性最好。
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注：不同小写字母表示差异显著 (P = 0.05)。 Note: The different letters indicate the significant differences at P = 0.05 level. 图 6 酸碱度变化对 SL01 发酵液抑菌活性的影响 Fig. 6 Effect of different pH values on the inhibitory activity of SL01 supernatant |
2.5.2 热稳定性
由图 7 看出：于 40 ℃ 下处理 30 min，SL01 发酵液抑菌活性与未经热处理组比较无显著差异 (P＜0.05) ；当温度达到 60、80 和 100 ℃ 时，发酵液活性均显著降低。说明发酵液产生的抑菌活性物质受温度影响较大。
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注：RT：室温，未经热处理，不同小写字母表示差异显著 (P = 0.05)。 Note: RT: room temperature, without heating treatment. The different letters indicate the significant differences at P = 0.05 level. 图 7 温度处理对发酵液抑菌活性的影响 Fig. 7 Effect of temperature on the antifungal activity of SL01 supernatant |
2.5.3 紫外光照射稳定性
由图 8 看出，SL01 发酵液经紫外光照射后对苹果树腐烂菌产生的抑菌圈直径变化不大。说明该物质在紫外光照射下，短时间内其稳定性良好。
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图 8 紫外线照射对SL01发酵液抑菌活性的影响 Fig. 8 Effect of UV radiation on the antifungal activity of SL01 supernatant |
3 讨论
生产中对于苹果树腐烂病通常采用化学防治为主、农业防治为辅的综合防治体系。生物防治技术因具环境友好特点而被关注。在应用生物防治方法防治苹果树腐烂病的研究中，尽管已筛选到枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis LZ-1201 和微嗜酸寡氧单胞菌 Stenotrophomonas acidaminiphila BJ1 等对苹果树腐烂病有较好拮抗效果的生防细菌 [11, 13]，但利用链霉素菌株防治苹果树腐烂病的研究尚不多见。目前仅见张清明等从苹果枝条中分离到一株卡伍尔链霉菌 Streptomyces cavourensis A2，对苹果腐烂病菌有明显的抑制作用[13]。
利用链霉菌防治其他植物病害在国内外已有大量报道，链霉菌对西瓜枯萎病菌[21]、番茄灰霉病菌[22]、水稻纹枯病菌[23]、草莓白粉病[24] 和甘蓝枯萎病菌[25] 等均具有潜在的生防利用价值。本研究所用放线菌菌株 SL01 是从陕西省秦岭自然保护区野果林土壤中分离得到的，已通过形态观察、生理生化测定和 16S rDNA 序列分析等方法鉴定为极长链霉菌 Streptomyces longissimus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC，保藏编号为 CGMCC No.9543。本研究发现，SL01 对多种真菌具有拮抗效果，且对苹果树腐烂病菌在菌丝生长和枝条病斑扩展上均表现出强烈的抑制效果 (表 2,图 5)。目前，尚未见应用该菌作为生防因子防治植物病害的报道。另外，菌株 SL01 发酵液中的活性物质对在 pH 6～8 及 40 ℃ 条件下较为稳定，同时对紫外光照射不敏感。鉴于自然界一般很少会有强酸、强碱或者极端高温的环境，本研究结果可为生防菌 SL01 的田间应用提供指导信息。
在利用链霉菌进行植物病害的防治中，主要利用的是其产生的代谢抗菌物质，而发酵过程是其代谢产物积累的基础。链霉菌的代谢产物与其培养基组成及发酵条件关系密切 [26-27]。本研究采用单因素和正交试验设计相结合的方法，得到了菌株 SL01 发酵的最佳配方和最适培养条件，为下一步抗菌活性物质的提取、鉴定以及进一步规模化发酵奠定基础。为明确抑菌活性物质的产生机理，还需对其发酵过程中的营养利用和活性物质代谢关系进行深入研究。目前，菌株 SL01 发酵液中抗菌活性物质的分离纯化研究正在进行中。
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