2016, Vol. 18
表 1
(Table 1)
超高效液相色谱-串联质谱法测定番茄(酱)及香梨中矮壮素和缩节胺残留量
引用本文
张海燕 . 超高效液相色谱-串联质谱法测定番茄(酱)及香梨中矮壮素和缩节胺残留量[J]. 农药学学报, 2016, 18(5): 619-624,doi: 10.16801/j.issn.1008-7303.2016.0087
ZHANG Haiyan . Analysis of chlormequat chloride and mepiquat chloride residues in tomato, tomato paste and pear by using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Pesticide Science, 2016, 18(5): 619-624, doi:10.16801/j.issn.1008-7303.2016.0087
超高效液相色谱-串联质谱法测定番茄(酱)及香梨中矮壮素和缩节胺残留量
库尔勒出入境检验检疫局, 新疆 库尔勒 841000
摘要:
建立了快速测定番茄（酱）及香梨中矮壮素和缩节胺残留量的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法。样品经V（水）：V（乙腈）=1：1提取，无需富集浓缩等特殊净化步骤，以Waters Acquity BEH HILIC色谱柱分离，电喷雾电离（ESI+），多反应监测（MRM）模式检测，基质匹配标准溶液峰面积外标法定量。结果表明：在0.001~0.02 mg/L范围内，矮壮素和缩节胺的质量浓度与对应的峰面积间线性关系良好，相关系数均大于0.999。矮壮素及缩节胺在番茄、香梨及番茄酱中的检出限（LOD）分别为0.000 4~0.002 mg/kg和0.000 9~0.002 mg/kg，定量限（LOQ）均为0.01 mg/kg。在0.01、0.02和0.05 mg/kg 3个添加水平下，矮壮素及缩节胺的回收率分别为71%~94%和75%~101%，相对标准偏差分别为1.9%~7.7%和2.8%~6.9%。该方法简便快捷，定量准确，可用于同时检测番茄（酱）及香梨中矮壮素和缩节胺的残留量。
关键词:
超高效液相色谱-串联质谱
番茄
香梨
番茄酱
矮壮素
缩节胺
残留
Analysis of chlormequat chloride and mepiquat chloride residues in tomato, tomato paste and pear by using liquid chromatography-tandem mass spectrometry
Korla Entry-Exit Inspection Quarantine Bureau in Korla, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Korla, 841000, Xinjiang, China
Abstract:
A rapid method for analyzing the two plant growth regulators chlormequat chloride and mepiquat chloride residues in tomato, tomato paste and pear by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was developed. The samples were extracted with V (water):V (acetonitrile)=1:1. Special clean-up procedures such as enrichment or concentration were not necessary. The chromatographic separation was carried out by HILIC column. Analytes were detected by electro-spray ionization (ESI+), and multiple reaction monitoring (MRM) mode. Quantification was performed by peak area external standard methods using matrix-matched calibration curves, which were linear in the range of 0.001-0.02 mg/L with good linear relationships. The correlation coefficients were all above 0.999. In the case of tomato, tomato paste and pear, the limits of detection (LOD) for chlormequat chloride and mepiquat chloride were estimated in the range of 0.0004-0.002, 0.0009-0.002 mg/kg, respectively. And the limits of quantification (LOQ) were both validated as 0.01 mg/kg. At 0.01, 0.02 and 0.05 mg/kg spiked levels, the recoveries and the relative standard deviations (RSD) was 71%-94%, 75%-101% and 1.9%-7.7%, 2.8%-6.9% for chlormequat chloride, and mepiquat chloride. Finally, this method was simple, quick, accurate, and could be applied to the determination of chlormequat chloride and mepiquat chloride residues in tomato, tomato paste and pear.
Key words:
ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)
tomato
pear
tomato paste
chlormequat chloride
mepiquat chloride
residues
矮壮素(chlormequat chloride)，化学名称为2-氯乙基三甲胺氯化物；缩节胺(mepiquat chloride)，化学名称为1, 1-二甲基哌啶氯化物。其结构式见图式1。矮壮素及缩节胺均为季铵盐类化合物，属高效、低毒、广谱性植物生长调节剂，其作用分别是使植株矮化和提高坐果率[1]。
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图式1 矮壮素(1)及缩节胺(2)的结构式 Scheme1 Structures of chlormequat chloride (1) and mepiquat chloride (2) |
目前，中国只规定了矮壮素在油料、油脂及谷物中的最大残留限量(MRLs)(0.1~10 mg/kg)[2]，并未规定两者在果蔬中的MRL值。欧盟规定，梨和番茄中矮壮素的MRL值均为0.05 mg/kg，缩节胺的均为0.01 mg/kg[3]。
目前，矮壮素和缩节胺的测定方法主要有气相色谱-质谱联用(GC-MS)法[4]、离子色谱法[5-6]和液相色谱-质谱(LC-MS)法等[7-8]。其中，GC-MS法在测定前需进行衍生化处理；离子色谱法灵敏度不高；LC-MS法早期用七氟丁酸(HFBA)作为离子对试剂[9]，以提高灵敏度、延长在反相柱上的保留时间，但对色谱柱伤害较大，容易污染系统。以上不足限制了这些方法的广泛使用。超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法因选择性强、灵敏度高而得以广泛使用。采用LC-MS/MS法测定的前处理方法有QuEChERS方法[10]、固相萃取法[11-14]等，但多集中于测定矮壮素[15-16]，两者同时检测的不多[17-19]，且前处理步骤多数较复杂，分析测试时间较长。
本研究通过优化质谱参数和色谱条件，考察了流动相、提取剂、基质效应等因素，建立了在番茄(酱)及香梨中同时快速检测矮壮素和缩节胺残留量的方法。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂Waters Acquity UPLC Quattro Premier XE超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪，配电喷雾电离源(ESI)和Masslynx 4.1工作站，美国Waters公司；XP 205、PB 3002型电子天平，瑞典梅特勒托利多公司；MS3涡旋仪，德国IKA公司；SB 5200超声波清洗器，上海Branson公司；CF 16 RXII高速离心机，日本HITACHI公司。
矮壮素(chlormequat chloride)和缩节胺(mepiquat chloride)标准品，纯度均≥99.0%，德国DR.Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈和96%甲酸均为色谱纯；乙酸铵为优级纯；试验用水为Milli-Q超纯水。
1.2 样品前处理试验用番茄、香梨及番茄酱均为送检样品。番茄、香梨采用四分法取样后用榨汁机粉碎，于-18 ℃下密封保存，备用。番茄酱样品搅匀后取样。
准确称取2.00 g (精确至0.01 g)样品于50 mL离心管中，加入水和乙腈各10 mL，涡旋混匀后超声提取30 min，于11 000 r/min下离心5 min。上清液经0.22 μm聚醚砜水系滤膜(PES)过滤，待UPLC-MS/MS分析。
1.3 标准溶液配制 1.3.1 标准储备液配制分别准确称取10 mg (精确至0.01 mg)矮壮素和缩节胺标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成1 000 mg/L标准储备液，于-18 ℃保存，备用。
1.3.2 混合标准工作液的配制取适量上述标准储备液经甲醇稀释，配成1 mg/L的混合标准工作溶液。
1.3.3 基质匹配混合标准工作溶液配制取不含待测物的番茄、香梨及番茄酱样品，按1.2节的前处理方法制得空白基质溶液，并用其稀释混合标准工作溶液，配成0.001、0.002、0.005、0.01和0.02 mg/L系列的基质匹配混合标准工作溶液，现配现用。
1.4 检测条件质谱条件：电喷雾电离ESI+；毛细管电压3.0 kV；萃取器电压4 V；脱溶剂气温度350 ℃，流量400 L/h；锥孔气流量50 L/h；离子源温度110 ℃；碰撞气压力3.7 × 105 Pa，流速0.17 mL/min；多反应监测(MRM)。分析参数见表 1。
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表 1 多反应监测(MRM)质谱参数 Table 1 Mass parametry parameters of the multi-reaction monitoring mode |
色谱条件：Waters Acquity BEH HILIC色谱柱(2.1 mm × 50 mm，1.7 μm)；流速0.25 mL/min；流动相A为乙腈，B为10 mmol/L乙酸铵+ 0.1%甲酸水溶液；柱温30 ℃；进样量5 μL。梯度洗脱程序见表 2。
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表 2 梯度洗脱程序 Table 2 Gradient elution program |
1.5 基质效应
采取相对响应值法，考察目标物的基质效应。当基质效应大于1时为基质增强效应，基质效应小于1时为基质抑制效应[10]。
2 结果与讨论 2.1 质谱条件优化采用蠕动泵连续进样方式对矮壮素和缩节胺的质谱参数进行优化，确定母离子、子离子、碰撞能等。首先进行母离子全扫描，矮壮素分子进入一级质谱后电离，产生质荷比为m/z 121.9 (基峰)、m/z 123.9的同位素碎片离子峰，丰度比为3 : 1，即矮壮素阳离子[M1–C1]+，分别对应[35Cl(CH2)2N(CH3)3]+、[37Cl (CH2)2N(CH3)3]+，[M1–C1]+作为母离子进入二级质谱发生α断裂后，发生氢重排及i断裂产生有显著丰度的m/z 59.2及m/z 63.1重排离子，分别对应[(CH3)3N]+、[Cl(CH2)2]+，定量离子选择丰度较高的m/z 59.2。对于缩节胺分子有类似的裂解规律，质荷比为m/z 114.1的分子离子峰，即缩节胺阳离子[M2–C1]+，作为母离子进入二级质谱后产生有显著丰度m/z 98.1、m/z 58.2的碎片离子，分别对应[CH3N CH(CH2)4]+、[(CH3)2NCH2]+[20]，定量离子选择丰度较高的m/z 98.1。优化后的结果见表 1。
2.2 液相色谱条件优化矮壮素和缩节胺均属于季铵盐类极性化合物，在常见的反相柱上保留很弱，利用亲水相互作用液相色谱HILIC柱能将两种化合物实现完全分离。流动相使用甲醇时系统压力较高，改用乙腈压力有所降低。在流动相中加入体积分数为0.1%的甲酸水溶液利于[M–Cl]+离子峰的形成[21]，从而提高目标物的灵敏度；加入乙酸铵有助于消除钠盐干扰，同时提供足够的离子强度，改善两种目标物峰形，盐浓度越高，峰宽越窄、峰形越对称，但盐浓度太高对离子源和色谱柱均不利。考虑提取剂与流动相的相容性，本研究选择乙腈和10 mmol/L乙酸铵+ 0.1%甲酸水溶液作为流动相。采用等度洗脱时出峰均靠前，为1 min左右。为降低基质干扰，采用梯度洗脱，且梯度洗脱起始时的有机相比例越高，出峰越早。通过调整梯度洗脱程序，使两种化合物干扰峰最少且尽快出峰，调整后的梯度洗脱程序见表 2。
2.3 提取溶剂的选择在番茄、香梨及番茄酱3种空白样品中添加相当于0.05 mg/kg的矮壮素和缩节胺混合标准工作溶液，分别考察了乙腈，甲醇，水，V (水) : V (甲醇)=1 : 1，V (水) : V (乙腈)=1 : 3、1 : 1的提取效果。结果发现：提取溶剂在供试3种基质中的提取效果依次为水≈ V (水) : V (甲醇)=1 : 1 > V (水) : V (乙腈)=1 : 1 > V (水) : V (乙腈)=1 : 3 > 甲醇 > 乙腈。单纯使用乙腈、甲醇提取或使用V (水) : V (乙腈)=1 : 3提取时，提取效率均不高。单纯使用水提取与使用V (水) : V (甲醇)=1 : 1提取的回收率均较高，且相差不大，但使用水提取时色谱峰较宽，而使用V (水) : V (甲醇)=1 : 1提取时，色谱峰前伸，这可能是由于提取剂与色谱柱中裸露的硅羟基发生了亲电作用[22]。峰展宽与峰前伸可能会给定量带来误差。采用V (水) : V (乙腈)=1 : 1提取的回收率虽较水或V (水) : V (甲醇)=1 : 1略低，但前者提取的色谱峰形更尖锐、对称，灵敏度更高，故采用V (水) : V (乙腈)=1 : 1作为提取溶剂。
2.4 方法的线性范围和检出限取1.3.3节的基质匹配混合标准工作溶液，按1.4节的条件测定，根据矮壮素和缩节胺的定量离子峰面积(y)对质量浓度(x)绘制基质匹配标准曲线。结果表明(表 3)：在0.001~0.02 mg/L范围内，矮壮素和缩节胺的线性关系良好，相关系数均大于0.999，当样品中矮壮素或缩节胺的质量浓度超过此线性范围时，需适当稀释使检测结果更准确。
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表 3 不同基质中矮壮素和缩节胺的线性方程、相关系数、检出限和定量限 Table 3 Linear equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LOD) and limits of quantitation (LOQ) for chlormequat chloride and mepiquat chloride in different matrices |
以最低添加水平确定矮壮素和缩节胺的定量限(LOQ)均为0.01 mg/kg。即方法的LOQ低于欧盟规定的最大残留限量。
2.5 方法的精密度和准确度取空白基质样品，添加适量相当于0.01、0.02和0.05 mg/kg的混合标准工作溶液，按1.2节的条件平行测定6次。结果(表 4)表明：添加回收率在71%~101%，相对标准偏差(RSD)在1.9%~7.7%，符合方法学要求[23]。典型色谱图见图 1。
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图 1 MRM下香梨样品添加0.01 mg/kg药剂的总离子流色谱图 Fig. 1 The total ion chromatograms of the pear spiked sample at 0.01 mg/kg under the MRM |
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表 4 样品在不同基质中的添加回收率及相对标准偏差(n=6) Table 4 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSD) of the chlormequat chloride and mepiquat chloride in different matrices (n=6) |
2.6 基质效应
由表 5可知：矮壮素在番茄、香梨和番茄酱基质中均有一定程度的基质抑制效应，且在一定范围内随浓度的增加而增强；缩节胺在香梨中基质效应不很明显，在番茄和番茄酱中存在基质抑制效应。为降低基质效应对结果带来的误差，所有样品分别采用对应的基质匹配标准曲线定量。
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表 5 矮壮素和缩节胺在不同基质提取液中的基质效应/% Table 5 The matrix effect in different matrices for chlormequat chloride and mepiquat chloride/% |
2.7 实际样品测定
按照本研究建立的方法，对77份送检样品进行测定。结果显示：有2份番茄样品检出矮壮素残留，含量分别为0.100和0.050 6 mg/kg，超出欧盟规定MRL值0.05 mg/kg；其余样品均未检出矮壮素和缩节胺残留。
3 结论本研究通过优化质谱和色谱条件，建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定番茄、香梨和番茄酱中矮壮素和缩节胺残留量的分析方法。样品用V (水) : V (乙腈)=1:1提取后直接过滤离心，前处理过程简单、方法灵敏度高、回收率和精密度均能满足农药残留分析的要求。可作为果蔬及制品中矮壮素和缩节胺快速确证和测定的方法。
参考文献
| [1] |
胡兴启. 植物生长调节剂的作用[J]. 湖北植保, 2012 (2):62–63.
HU X Q. Function of plant growth regulator[J]. Hubei Plant Protec, 2012 (2):62–63. |
| [2] |
食品中农药最大残留限量:GB 2763-2014[S].北京:中国标准出版社, 2014.
Maximum residue limits for pesticides in food:GB 2763-2014[S]. Beijing:Standards Press of China, 2014. http://industry.wanfangdata.com.cn/dl/Detail/Standard?id=Standard_GB%202763-2014&type=Free |
| [3] | EU pesticides database-EU Commision[DB/OL].[2016-05-30]. http://www.ec.europa.eu/food/plant/pesticides-database/public/?event=pesticide.residue.selection&language=EN. |
| [4] |
赵永信, 宋国良, 张晶, 等. 气相色谱/质谱法测定粮食中矮壮素残留[J]. 中国卫生检验杂志, 2008,18 (6):1064–1066.
ZHAO Y X, SONG G L, ZHANG J, et al. Determination of chlormequcat chloride residue in grains by gas chromatography/mass Spectrometry[J]. Chin J Health Lab Technol, 2008, 18 (6):1064–1066. |
| [5] | PEETERS M C, DEFLOOR I, COOSEMANS J, et al. Simple ion chromatographic method for the determination of chlormequat residues in pears[J]. J Chromatogr A, 2001, 920 (1-2):255–259. doi:10.1016/S0021-9673(01)00836-6 |
| [6] |
周旭, 许锦钢, 陈智栋, 等. 流动相离子色谱法同时测定植物中残留的矮壮素和缩节胺[J]. 色谱, 2011,29 (3):244–248.
ZHOU X, XU J G, CHEN Z D, et al. Simultaneous determination of chlormequat chloride and mepiquat chloride in plants by mobile phase ion chromatography[J]. Chin J Chromatogr, 2011, 29 (3):244–248. doi:10.3724/SP.J.1123.2011.00244 |
| [7] | YU Z Y, JIN F, HU J Y, et al. An improved method for analyzing chlormequat and mepiquat in source waters by solid-phase extraction and liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Anal Chim Acta, 2010, 678 (1):90–95. doi:10.1016/j.aca.2010.08.006 |
| [8] |
郭幸丽, 秦冬梅, 徐彦军, 等. 高效液相色谱-电喷雾质谱法测定土壤中的矮壮素残留[J]. 农药学学报, 2009,11 (3):346–350.
GUO X L, QIN D M, XU Y J, et al. Determination of chlormequat residues in soil by high performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry[J]. Chin J Pestic Sci, 2009, 11 (3):346–350. |
| [9] | HENRIKSEN T, JUHLER R K, BRANDT G, et al. Analysis of the plant growth regulator chlormequat in soil and water by means of liquid chromatography-tandem mass spectrometry, pressurised liquid extraction, and solid-phase extraction[J]. J Chromatogr A, 2009, 1216 (12):2504–2510. doi:10.1016/j.chroma.2009.01.050 |
| [10] |
黄何何, 张缙, 徐敦明, 等. QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法同时测定水果中21种植物生长调节剂的残留量[J]. 色谱, 2014,32 (7):707–716.
HUANG H H, ZHANG J, XU D M, et al. Determination of 21 plant growth regulator residues in fruits by QuEChERS-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chin J Chromatogr, 2014, 32 (7):707–716. doi:10.3724/SP.J.1123.2014.03003 |
| [11] | RIEDIKER S, OBRIST H, VARGA N, et al. Determination of chlormequat and mepiquat in pear, tomato, and wheat flour using on-line solid-phase extraction (Prospekt) coupled with liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. J Chromatogr A, 2002, 966 (1-2):15–23. doi:10.1016/S0021-9673(02)00737-9 |
| [12] |
曹慧, 陈小珍, 王瑾, 等. 超高效液相色谱-串联质谱技术同时分析食品中多种植物激素残留[J]. 农药, 2012,51 (10):738–741.
CAO H, CHEN X Z, WANG J, et al. Determination of plant hormones residues in food by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Agrochemicals, 2012, 51 (10):738–741. |
| [13] | LI C M, JIN F, YU Z Y, et al. Rapid determination of chlormequat in meat by dispersive solid-phase extraction and hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) -electrospray tandem mass spectrometry[J]. J Agri Food Chem, 2012, 60 (27):6816–6822. doi:10.1021/jf3010756 |
| [14] |
鲁立良, 罗小玲, 王远, 等. 高效液相色谱-串联质谱法测定食品中的矮壮素与缩节胺残留[J]. 分析测试学报, 2011,30 (3):321–325.
LU L L, LUO X L, WANG Y, et al. Determination of chlormequat and mepiquat residues in food by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Instrum Anal, 2011, 30 (3):321–325. |
| [15] |
林海丹, 谢守新, 王岚, 等. 超高效液相色谱串联质谱法测定果蔬中13种植物生长调节剂残留量[J]. 广东农业科学, 2015,42 (9):82–87.
LIN H D, XIE S X, WANG L, et al. Determination of 13 plant growth regulator residues in fruits and vegetables using ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Guangdong Agric Sci, 2015, 42 (9):82–87. |
| [16] |
闫震, 聂继云, 徐国锋, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法检测水果中6种植物生长调节剂[J]. 园艺学报, 2016,43 (1):175–182.
YAN Z, NIE J Y, XU G F, et al. Determination of six plant growth regulators in fruits by ultra performance liquid chromatograph-tandem mass spectrometry[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2016, 43 (1):175–182. |
| [17] |
张曦.番茄中矮壮素和缩节胺的检测方法及残留研究[D].北京:中国农业科学院, 2010.
ZHANG X. Study on determination and residues of chlormequat and mepiquat in tomatoes[D]. Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2010. http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-82101-2010171308.htm |
| [18] |
王静静, 鹿毅, 杨涛, 等. HPLC-MS/MS法同时测定果蔬中6种植物生长抑制剂残留[J]. 分析测试学报, 2011,30 (2):128–134.
WANG J J, LU Y, YANG T, et al. Determination of 6 plant growth retardants in fruits and vegetables by HPLC-MS/MS[J]. J Inst Anal, 2011, 30 (2):128–134. |
| [19] |
张曦, 金芬, 钱永忠, 等. 高效液相色谱-串联质谱法测定樱桃番茄中四种季铵类农药[J]. 食品工业科技, 2011,32 (6):394–397.
ZHANG X, JIN F, QIAN Y Z, et al. Simultaneous determination of quaternary ammonium compounds in tomato by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Sci Technol Food Ind, 2011, 32 (6):394–397. |
| [20] | STARTIN J R, HIRD S J, SYKES M D, et al. Determination of residues of the plant growth regulator chlormequat in pears by ion-exchange high performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry[J]. Analyst, 1999, 124 (7):1011–1015. doi:10.1039/a902712b |
| [21] |
王金花, 卢晓宇, 黄梅, 等. 超高效液相色谱-质谱法快速分析番茄及其制品中矮壮素和缩节胺残留量[J]. 分析化学, 2007,35 (10):1509–1512.
WANG J H, LU X Y, HUANG M, et al. Rapid screening and confirmation of chlormequat and mepiquat residues in tomato and its products using liquid chromatography with electro-spray tandem mass spectrometry[J]. Chin J Anal Chem, 2007, 35 (10):1509–1512. |
| [22] | ESPARZA X, MOYANO E, GALCERAN M T. Analysis of chlormequat and mepiquat by hydrophilic interaction chromatography coupled to tandem mass spectrometry in food samples[J]. J Chromatogr A, 2009, 1216 (20):4402–4406. doi:10.1016/j.chroma.2009.03.037 |
| [23] |
实验室质量控制规范食品理化检测:GB/T 27404-2008[S].北京:中国标准出版社, 2008.
Criterion on quality control of laboratories-Chemical testing of food:GB/T 27404-2008[S]. Beijing:Standards Press of China, 2008. |