2016, Vol. 18
苹果绵蚜 Eriosoma lanigerum (Hausmann) 属同翅目瘿绵蚜科绵蚜属，又名血色蚜虫、赤蚜、绵蚜，原产于北美洲东部，后随苗木调运传入欧洲、澳洲、亚洲等国家，1914 年传入中国，在中国河南、陕西、山西、山东、江苏、云南及新疆等多地的苹果产区已有分布，并有继续蔓延之势[1-6]。 苹果绵蚜是苹果属的重要害虫，常寄生在果树树干的粗皮裂缝、伤疤、剪口及新梢叶腋等处吸取树液，在危害处可形成瘤状突起，进而影响果树水分及养分的运输，导致树势衰弱，严重时整株枯死，对苹果产业构成巨大威胁[7]。目前防治该虫主要依赖化学药剂，但长期大量的化学防治势必会引起抗药性的产生。而有关苹果绵蚜的抗性监测至今尚未见报道。
为了摸清中国苹果绵蚜对常规药剂的抗性水平及动态变化，笔者监测并比较了中国几个具有代表性苹果生产区的苹果绵蚜对常用药剂吡虫啉、毒死蜱和高效氯氟氰菊酯的敏感性，并测定了不同苹果绵蚜种群的酯酶和谷胱甘肽 S-转移酶活力，以期为该虫的抗性监测和机制研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 供试苹果绵蚜苹果绵蚜于 2012—2015 年分别采自中国新疆察布查尔、山东济南、陕西乾县、河北昌黎及江苏丰县。用毛笔轻轻将苹果绵蚜从苹果树枝上扫下，选取健康的无翅成蚜作为标准试虫供试，现采现用。
1.2 供试药剂及仪器480 g/L 毒死蜱乳油 (chlorpyrifos,EC)，江苏苏州佳辉化工有限公司；200 g/L 吡虫啉可溶液剂 (imidacloprid,SLX)，山东嘉禾化工有限公司；25 g/L高效氯氟氰菊酯乳油 (lambda-cyhalothrin,EC)，山东青岛欧迪斯生物科技有限公司。
α-乙酸萘酯 (α-NA)、考马斯亮蓝 G-250、固蓝 RR 盐、 1-氯-2,4-二硝基苯 (CDNB)、还原性谷胱甘肽 (GSH)，北京 Solarbio 公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、丙酮及无水乙醇，均为国产分析纯试剂。
VERSA max 型酶标仪，美国 Molecular Device 公司；5424R 型冷冻离心机，德国 Eppendorf 公司。
1.3 生物测定方法采用浸叶法[8]测定供试药剂对苹果绵蚜的毒力。用清水将杀虫剂配制成所需浓度梯度药液，将新鲜的苹果树连枝叶片在不同浓度药液中浸渍 10 s 后晾干；将其放在垫有滤纸的塑料培养皿 (直径 9 cm) 内，用零号毛笔将苹果绵蚜挑到苹果叶片反面。每皿 20 头，每处理重复 3 次。以清水处理为对照。将处理过的蚜虫置于 27 ℃养虫室内，待吡虫啉处理 5 h、毒死蜱和高效氯氟氰菊酯处理 3 h 后检查苹果绵蚜死亡率。试虫死亡标准：在放大镜下观察，以毛笔轻触虫体无任何反应者视为死亡。
按照 Abbott 公式计算死亡率和校正死亡率，采用机率值分析法计算毒力回归曲线、LD50 值、相关系数及 95% 置信限。抗性倍数 (RR) 为田间测试种群与相对敏感种群 LD50 值的比值。抗药性判定标准[9]：5 ≤ RR < 10 为低水平抗性，10 ≤ RR < 100 为中等水平抗性，RR ≥ 100 为高水平抗性。
1.4 酶活力测定 1.4.1 酶液制备每个种群取约 60 头苹果绵蚜标准试虫，加入 600 μL、0.1 mol/L、pH 7.8 的磷酸盐 (PBS) 缓冲溶液，冰浴下匀浆，直至无明显组织块为止。取匀浆液在冷冻离心机中于 4 ℃、12 000 g 下离心 20 min，取上清液再次离心 10 min，所得上清液即为粗酶液。
1.4.2 酯酶活力测定参照 Han 等[10]的方法并略加修改。在酶标板中加入 50 μL 酶液及 150 μL α-NA 和固蓝 RR 盐的混合液，每个苹果绵蚜种群设 3 个重复，利用酶标仪在 450 nm 波长下记录光密度值 (OD)。反应在 27 ℃下进行，每 25 s 读取一个点，共记录 10 min。以反应速度表示酶活力[mOD/(min·μg)]。
1.4.3 谷胱甘肽 S-转移酶活力测定参照 Oppenoorth等[11]的方法并略加修改。在 96 孔酶标板中依次加入 10 μL 酶液、100 μL CDNB 底物溶液 (1.2 mmol/L) 和 100 μL 还原型谷胱甘肽 (6 mmol/L),每个苹果绵蚜种群设 3 个重复，利用酶标仪在 340 nm 波长下记录光密度值。反应在 27 ℃下进行，每 15 s 读取一个点，共记录 10 min。以反应速度表示酶活力[mOD/(min·μg)]。
1.4.4 总蛋白含量测定采用 Bradford[12]考马斯亮蓝 G-250 法，以牛血清蛋白作为标准蛋白。
2 结果与分析 2.1 不同苹果绵蚜种群对毒死蜱的抗性在 2012—2015 年间测定了不同苹果绵蚜种群对毒死蜱的抗性水平，结果见表 1。其中以察布查尔 2012 种群 (LC50 为 0.79 μg/mL) 为相对敏感种群，从结果可看出，除乾县 2012 和 2013 种群保持敏感外[抗性倍数 (RR) 分别为 1.5 和 0.6]，其他种群都产生了不同水平的抗药性。察布查尔 2014 种群表现为低水平抗性，RR 为 6.0；昌黎 2012、济南 2012—2014、丰县和察布查尔 2015 种群为中等水平抗性，其 RR 分别为 32.4、51.4、45.6、80.1、21.8 和 49.0；济南 2015 种群已达到高水平抗性，RR 达 162。此外还发现，不同年度间，济南和察布查尔种群对毒死蜱的抗性水平呈逐年提高趋势。
|
表 1 不同苹果绵蚜种群对毒死蜱的抗性监测结果 (2012—2015) Table 1 Annual change of resistance level to chlorpyrifos in Eriosoma lanigerum collected from different areas (2012-2015) |
2.2 不同苹果绵蚜种群对高效氯氟氰菊酯的抗性
2012—2015 年度间不同苹果绵蚜种群对高效氯氟氰菊酯的抗性监测结果见表 2。以察布查尔 2012 种群为相对敏感种群 (LC50 为 2.42 μg/mL)，在所有监测的种群中，除乾县、昌黎 2012 种群及察布查尔 2014 种群表现敏感外，其他种群对高效氯氟氰菊酯均产生了不同程度的抗性。其中济南 2012 及 2014 种群为中等水平抗性 (RR 分别为 36.5 和 45.7)，2015 年察布查尔、济南和丰县 3 个种群均达高水平抗性，其 RR 分别为 241、152 和 210，另外也可以看出，济南种群对高效氯氟氰菊酯的抗性水平逐年增加。
|
|
表 2 不同苹果绵蚜种群对高效氯氟氰菊酯的抗性监测结果 (2012—2015) Table 2 Annual change of resistance level to lambda-cyhalothrin in E. lanigerum collected from different areas (2012-2015) |
2.3 不同苹果绵蚜种群对吡虫啉的抗性
监测结果见表 3。同样以察布查尔 2012 种群为相对敏感种群，结果发现，监测的所有种群对吡虫啉均产生了不同程度的抗性。其中：昌黎 2012 (RR 为 10.6)，乾县 2012 (RR 为 27.5) 及济南 2012—2013 (RR 分别为 11.2 和 14.3) 为中等水平抗性；而乾县 2013 (RR 为 441)、济南 2014—2015 (RR 分别为 331 和 332)、察布查尔 2015 和丰县2015种群[RR (估) > 2 000]已达极高水平抗性；仅察布查尔 2014 种群为低水平抗性 (RR 为 5.2)。结果表明，察布查尔和济南种群对吡虫啉的抗性水平呈逐年提高趋势。
|
|
表 3 不同苹果绵蚜种群对吡虫啉的抗性监测结果 (2012—2015) Table 3 Annual change of resistance level to imidacloprid in E. lanigerum collected from different areas (2012-2015) |
2.4 不同苹果绵蚜田间种群酯酶和谷胱甘肽 S-转移酶的活力
测定结果见表 4。在 2012 年测定的 3 个种群中，以乾县苹果绵蚜的酯酶活力最高；2014 年察布查尔种群的酯酶活力明显高于济南种群，但 2015 年两者的酯酶活力无明显差异，丰县种群的酯酶活力最低。谷胱甘肽 S-转移酶活力测定结果显示，2014 年济南和察布查尔种群酶活力无显著差异，2015 年察布查尔和丰县种群明显高于济南种群。
|
|
表 4 苹果绵蚜不同种群酯酶和谷胱甘肽S-转移酶的活力 Table 4 Activity of esterase and glutathione S-transferase (GST) in different population of E. lanigerum |
2.5 抗性水平与酶活力的相关性分析
为了明确酯酶和谷胱甘肽 S-转移酶活力与苹果绵蚜对供试药剂抗性之间的相关性，分别将不同年份不同苹果绵蚜种群的抗药性水平与酶活力进行线性回归分析，结果见表 5。可以看出，仅苹果绵蚜对高效氯氟氰菊酯和吡虫啉的抗性倍数与谷胱甘肽 S-转移酶活力之间具有极高的正相关性，相关系数分别为 0.83 和 0.94。
|
|
表 5 苹果绵蚜的抗性倍数与酯酶及谷胱甘肽S-转移酶活力之间的关系 Table 5 Relationship between the activity of esterase and GST and resistance ratio of E. lanigerum |
3 讨论
苹果绵蚜是苹果的重要害虫，中国主要苹果产区常用吡虫啉、毒死蜱、辛硫磷、高效氯氟氰菊酯等新烟碱、有机磷和拟除虫菊酯类药剂防治该虫。苹果绵蚜由于可分泌蜡丝，形成白色棉絮状蜡质保护层而增加了选取生物测定标准试虫的困难。王菊平等[13]对苹果绵蚜进行了 4 种药剂的毒力及复配剂的联合毒力测定，但至今尚未见有关苹果绵蚜对常用药剂是否产生抗药性的相关报道。本研究利用浸叶法对中国不同苹果绵蚜种群开展了抗性监测并初步分析了其抗性机制。
在 2012—2015 年间，笔者分别测定了新疆察布查尔、山东济南、河北昌黎、陕西乾县和江苏丰县苹果绵蚜对毒死蜱、高效氯氟氰菊酯和吡虫啉的抗性水平。结果发现：若以察布查尔 2012 种群作为相对敏感种群，则该地苹果绵蚜在 2014 年对高效氯氟氰菊酯仍处于敏感状态，对其他药剂则产生了低水平抗性，到 2015 年，该地苹果棉蚜对 3 种药剂均产生了中等到高水平的抗性；不同年份济南及丰县苹果绵蚜种群对 3 种药剂均产生了中到高水平的抗性；乾县苹果绵蚜仅对吡虫啉产生了抗性，并已达中等到极高水平；昌黎种群对高效氯氟氰菊酯保持敏感，对毒死蜱和吡虫啉均产生了中等水平抗性。
目前，各地在苹果绵蚜防治中，吡虫啉的使用比较频繁，从监测结果也可以看到，苹果绵蚜对吡虫啉的抗性发生普遍且程度严重 (最高抗性倍数 ＞ 2 000 倍)。济南地区近几年由于吡虫啉防效下降，故改为施用毒死蜱，本研究抗性监测结果也显示，济南种群在 2014 和 2015 年对吡虫啉的抗性水平无明显变化，而对毒死蜱的抗性水平明显增加。
各种解毒酶活性的升高是昆虫抗药性形成的重要机制之一。对不同苹果绵蚜种群进行酶活力测定并与其抗性水平比较分析，结果发现，田间种群对高效氯氟氰菊酯和吡虫啉的抗性与谷胱甘肽 S-转移酶活力存在明显正相关关系。宫亚军等[14]的研究显示，田间桃蚜对毒死蜱和吡虫啉的抗性水平与羧酸酯酶的活力有正相关性；丁天波等[15]测定了田间柑橘全爪螨对几种杀螨剂的抗性水平及解毒酶活力，发现其解毒酶活性高低与不同种群的抗性水平间没有明显相关性。这些结果的不一致性可能与各地区的用药背景不同、各种药剂的不同作用机理或不同害虫田间种群的解毒酶活性差异有关。苹果绵蚜抗药性的生化机制还有待进一步研究揭示。
本研究结果表明，所调查的苹果绵蚜种群对吡虫啉的抗性发生最为严重，因此在防治中应注意降低其使用频率，并注意与其他不同作用机制的药剂轮换或交替使用；同时有必要加强对苹果绵蚜的抗性监测，及时分析抗性产生机制，为制定合理有效的防治措施及抗性治理策略提供科学依据。
致谢： 感谢新疆伊犁州农业技术推广总站植保站、山东农业科学院植物保护研究所、西北农林科技大学植物保护学院、江苏省徐州丰县植保站及河北省农林科学院果树研究所为本研究提供了苹果绵蚜虫源。
| [1] | ALSPACH P A, BUS V G M. Spatial variation of woolly apple aphid (Eriosoma lanigerum,Hausmann) in a genetically diverse apple planting [J]. New Zealand J Ecol, 1999, 23 (1) :39–44 . |
| [2] | BROWN M W, SCHMITT J J. Population dynamics of woolly apple aphid (Homoptera:Aphididae) in west Virginia apple orchards [J]. Environ Entomol, 1994, 23 (5) :1182–1188 . doi:10.1093/ee/23.5.1182 |
| [3] | MOLS P J M, BOERS J M. Comparison of a Canadian and a Dutch strain of the parasitoid Aphelinus mali (Hald)(Hym.,Aphelinidae) for control of woolly apple aphid Eriosoma lanigerum (Haussmann)(Hom.Aphididae) in the Netherlands:a simulation approach [J]. J Appl Entomol, 2001, 125 (5) :255–262 . doi:10.1046/j.1439-0418.2001.00543.x |
| [4] | NICHOLAS A H, SPOONER-HART R N, VICKERS R A. Abundance and natural control of the woolly aphid Eriosoma lanigerum in an Australian apple orchard IPM program [J]. BioControl, 2005, 50 (2) :271–291 . doi:10.1007/s10526-004-0334-2 |
| [5] |
孙立宁, 谭秀梅, 周洪旭, 等. 入侵性害虫——苹果绵蚜田间种群数量的调查方法 [J]. 昆虫知识, 2008,45 (5)
:818–822.
SUN L N, TAN X M, ZHOU H X, et al. Investigation methods for population size of Eriosoma lanigerum in the orchard [J]. Chin Bull Entomol, 2008, 45 (5) :818–822 . |
| [6] |
武强, 万方浩, 李照会. 苹果绵蚜在我国的入侵状况调查及防治对策 [J]. 植物保护, 2009,35 (5)
:100–104.
WU Q, WAN F H, LI Z H. Investigations on invasion situation and control strategies of Eriosoma lanigerum in China [J]. Plant Prot, 2009, 35 (5) :100–104 . |
| [7] |
王西存, 周洪旭, 于毅. 苹果绵蚜的抗性寄主选育及无公害防治 [J]. 山东农业科学, 2012,44 (1)
:84–86.
WANG X C, ZHOU H X, YU Y. Breeding of resistant hosts and non-pollution control of Eriosoma lanigerum Hausmann [J]. Shandong Agric Sci, 2012, 44 (1) :84–86 . |
| [8] | BUSVINE J.R.Recommended method for measurement of pest resistance to pesticides[M].FAO Plant Production and Protection Paper 21,1980:103-106. |
| [9] |
尹艳琼, 赵雪晴, 谌爱东, 等. 云南省小菜蛾田间种群对氯虫苯甲酰胺的抗药性变化趋势 [J]. 农药学学报, 2014,16 (6)
:746–750.
YIN Y Q, ZHAO X Q, CHEN A D, et al. Changing trends of resistance of Plutella xylostella field population to chlorantraniliprole in Yunnan province [J]. Chin J Pestic Sci, 2014, 16 (6) :746–750 . |
| [10] | HAN Z J, MOORES G D, DENHOLM I, et al. Association between biochemical markers and insecticide resistance in the cotton aphid,Aphis gossypii Glover [J]. Pestic Biochem Physiol, 1998, 62 (3) :164–171 . doi:10.1006/pest.1998.2373 |
| [11] | OPPENOORTH F J, van der PAS L J T, HOUX N W H. Glutathione S-transferase and hydrolytic activity in a tetrachlorvinphos-resistant strain of housefly and their influence on resistance [J]. Pestic Biochem Physiol, 1979, 11 (1-3) :176–188 . doi:10.1016/0048-3575(79)90057-9 |
| [12] | BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Anal Biochem, 1976, 72 (1-2) :248–254 . doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3 |
| [13] |
王菊平, 宣善滨, 石保明, 等. 不同杀虫剂对苹果绵蚜的毒力及复配研究 [J]. 山西农业科学, 2015,43 (4)
:444–446.
WANG J P, XUAN S B, SHI B M, et al. Toxicity test of different pesticides and their mixed formulation against Eriosoma lanigerum Hausmann [J]. J Shanxi Agric Sci, 2015, 43 (4) :444–446 . |
| [14] |
宫亚军, 王泽华, 石宝才, 等. 北京地区不同桃蚜种群的抗药性研究 [J]. 中国农业科学, 2011,44 (21)
:4385–4394.
GONG Y J, WANG Z H, SHI B C, et al. Resistance status of Myzus persicae (Sulzer)(Hemiptera:Aphididae) populations to pesticide in Beijing [J]. Sci Agric Sin, 2011, 44 (21) :4385–4394 . |
| [15] |
丁天波, 牛金志, 夏文凯, 等. 柑橘全爪螨田间种群敏感性测定及三种主要解毒酶活性比较 [J]. 应用昆虫学报, 2012,49 (2)
:382–389.
DING T B, NIU J Z, XIA W K, et al. Susceptibility to acaricides and detoxification enzyme activity of four field populations of Panonychus citri [J]. Chin J Appl Entomol, 2012, 49 (2) :382–389 . |