啶虫脒是由日本曹达公司于1996年创制的烟碱类农药，是茶叶上常用的优良杀虫剂，具有广谱、内吸、速效、低毒、活性高、用量少、持效期长等特性^[1]。茶叶是中国重要的经济作物，每年出口约20万 t，贸易金额约4亿美元，而农药残留是影响中国茶叶出口的重要因素^[2]，并且由于茶叶是直接饮用水浸泡后的茶汤，因而使得啶虫脒这类在水中有一定溶解度 (4.2 g/L,25 ℃) 农药的残留危害性更显突出。欧盟已于2014年将茶叶中啶虫脒的最大残留限量标准 (MRL 值) 由0.1 mg/kg 下调至0.05 mg/kg^[3]，而中国尚未规定啶虫脒在茶叶上的 MRL 值，参照吡虫啉在茶叶上的 MRL 值为0.5 mg/kg^[4]。近期有文献报道，蜜蜂喜欢觅食含烟碱类农药的作物^[5]，因而控制使用烟碱类农药对保护蜜蜂群落意义重大。目前，有关茶叶中啶虫脒残留的检测方法主要有液相色谱法^{[2, 6]}、气相色谱法^[7-8]及超高效液相色谱-串联质谱法^[9]等，但这些方法尚不能大量普及，因而亟需一种可用于现场快速检测的简便方法以控制啶虫脒的使用。常见的用于农药残留现场快速筛查的方法有酶抑制显色纸片法^[10]，但该方法受基质干扰大，检测假阳性比率偏高，且检测对象仅局限于有机磷类和氨基甲酸酯类农药，特异性不高^[10]。近年来，基于抗原-抗体特异性反应的免疫研究报道最多的是酶联免疫吸附法 (ELISA)，目前已研制出多种烟碱类农药的 ELISA 试剂盒^[11-12]，但其检测方法需要多步反应，不易于现场操作。

基于直接竞争免疫层析法的金标速测试纸条检测技术由20世纪80年代发展而来，其工作原理是由胶体金标记的抗体与人工抗原之间进行特异性结合反应，在测试线形成聚集而显色，或因先与被检测样品产生竞争性结合反应而不能在测试线聚集显色。目前已有采用金标试纸条检测农产品中烟碱类农药吡虫啉、噻虫嗪和噻虫胺的研究报道^[13-14]，但尚未见有关用于啶虫脒残留检测的金标试纸条的报道。鉴于此，笔者研制了一种基于直接竞争免疫层析法原理的啶虫脒金标速测试纸条，可用于快速检测茶叶中啶虫脒的残留。通过啶虫脒人工抗原免疫小鼠获得啶虫脒特异性抗体，采用胶体金标记啶虫脒抗体；同时为了增强检测线和质控线的稳定性，对试纸条中这两条线的保护剂进行了优化；采用所研制的啶虫脒金标速测试纸条检测了绿茶、红茶和铁观音中啶虫脒的残留量。

1 材料与方法 1.1 试验材料及仪器 1.1.1 药剂与试剂

啶虫脒 (acetamiprid，99.2%)、吡虫啉 (imidacloprid，99.7%)、噻虫啉 (thiacloprid，99.9%)、噻虫嗪 (thiamethoxam，99.0%)、噻虫胺 (clothianidin，99.5%)、烯啶虫胺 (nitenpyram，99.0%)、氯噻啉 (imidaclothiz，97.5%) 和呋虫胺 (dinotefuran，99.0%) 标准品 (Dr. Ehrenstorfer GmbH)；牛血清白蛋白 (BSA)、鸡血清白蛋白 (OVA) 及羊抗鼠 IgG-HRP (华美生物工程公司)；N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)、二环己基碳二亚胺 (DCC)、降植烷、氯金酸和柠檬酸三钠 (Sigma 公司)；邻苯二胺 (OPD) (中国五联化工厂)；30% H₂O₂ 溶液 (浙江临安兰岭化工厂)；Pierce 快速 ELISA 鼠抗亚型鉴定试剂盒 (美国 Thermo 公司)；蔗糖、吐温-20和磷酸二氢钾 (中国医药集团上海化学试剂公司)；聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) (汕头市西陇化工厂)；聚乙二醇 (PEG) (阿拉丁试剂上海有限公司)；硝酸纤维素膜 (CN140) (德国 Sartorius 公司)。以上试剂均为分析纯。

供试茶叶分别为杭州西湖龙井茶 (绿茶)、贵州高山云霞茶 (红茶) 和福建安溪观音王 (铁观音茶)。

1.1.2 仪器

多功能酶标仪 SpectraMax@ i3 (美国 Molecular Devices 公司)；HW2096洗板机 (深圳市华科瑞技术有限公司)；96孔聚苯乙烯板 (美国 Costar 公司)；UV-2550紫外-可见分光光度计 (日本岛津公司)；ChemiDocTMMP 成像系统 (美国 Bio-RAD 公司)；Image lab 5.2分析软件 (美国 Bio-RAD 公司)；单通道及多通道可调移液枪 (德国 Eppendorf 公司)；超纯水仪 (美国 Pall 公司)；万分之一天平 (德国 Sartorius 公司)；WHS 型智能恒温恒湿箱 (宁波江南仪器厂)；Thermo 台式离心机 [赛默飞世尔科技 (中国) 有限公司]；精密 pH 试纸 (上海三爱斯试剂有限公司)；Index Cutter I切条机 (美国 A-Point 公司)；Mastersizer 2000激光粒度仪 (英国马尔文仪器有限公司)。

1.2 啶虫脒人工抗原与抗体制备 1.2.1 啶虫脒人工抗原的合成及细胞融合

参照 Wanatabe 等^[15]的方法合成啶虫脒人工半抗原 (其结构式见图式1)。免疫原 (啶虫脒-BSA) 及包被原 (啶虫脒-OVA) 均为本实验室参照文献[15]通过混合酸酐偶联法制备。取7周龄的 BALB/c 雌性小鼠，将免疫原啶虫脒-BSA 与快速佐剂等体积混合，进行腿部肌肉注射免疫，21 d 后进行加强免疫，每隔14 d 进行一次加强免疫，共进行4次加强免疫处理，末次免疫时不加快速佐剂，直接以生理盐水稀释免疫原。于末次免疫3 d 后断颈取脾，参照文献[16]方法进行杂交瘤细胞融合。

1.2.2 杂交瘤细胞的筛选、腹水制备及抗体亚型鉴定

参照文献[16]方法对杂交瘤细胞进行筛选。采用同源间接 ELISA (包被5 μg/mL 啶虫脒-OVA)，以啶虫脒 (100 ng/mL) 作为竞争源，挑出强阳性 (OD_490nm > 0.5) 且抑制反应明显 (大于50%) 的细胞株，连续亚克隆5~6次，获得稳定的单克隆细胞株。选用 F₁ 代小鼠，先用降脂烷 (500 μL/只) 进行腹腔注射。7 d 后，将筛选获得的稳定杂交瘤细胞株 [约2×10⁶/(500 μL·只)]接种至小鼠腹腔。7~10 d 后，小鼠腹腔膨胀，收集腹水，采用辛酸-硫酸铵沉淀法^[16]纯化。纯化后的腹水以吡虫啉-OVA (5 μg/mL) 包被，间接法测定抗体的效价。采用美国 Thermo 公司的 Pierce 快速 ELISA 鼠抗亚型鉴定试剂盒鉴定抗体的重链 (IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA 或 IgM) 和轻链 (κ 或 λ)。

1.2.3 啶虫脒单抗ELISA检测

首先采用间接 ELISA 棋盘滴定法^[15]确定抗原抗体的工作浓度，设置抗原工作浓度分别为0.25、0.5、1和2 μg/mL，抗体稀释梯度为1/250~1/32 000，筛选出 OD_490nm 约为1.0左右的组合。以优化好的工作浓度0.5 μg/mL 包被啶虫脒-OVA，啶虫脒抗体稀释倍数为1/16 000，用含体积分数1% 甲醇的0.01 mol/L 的磷酸盐 (PBS) 缓冲液 (pH 7.4) 配制啶虫脒梯度标准溶液，建立啶虫脒竞争标准曲线。用 Origin 8.5软件对啶虫脒浓度及结合率 B/B₀ 进行4参数拟合，绘制标准曲线。

1.3 胶体金制备与标记 1.3.1 胶体金制备与鉴定

采用柠檬酸三钠还原法^[17]制备胶体金。用新制备的去离子水配制150 mL 质量分数为0.01% 的氯金酸溶液，将其加入至酸洗后的三颈烧瓶中，搅拌下加热至回流；快速加入2.4 mL 质量分数为1% 的柠檬酸三钠水溶液，观察溶液由深蓝色转至酒红色，再加热回流5~7 min，停止加热，得到胶体金152.4 mL，于4 ℃ 下保存。采用 MD 多功能酶标仪对胶体金在波长400~600 nm 进行扫描，找到其最大吸收波长。

1.3.2 胶体金标记抗体

采用可见分光光度法确定最适稳定量的啶虫脒抗体^[18]。取10 mL 胶体金，用1 mol/L 的碳酸钾调节 pH 值至7.5，逐滴加入1 mL 90 μg/mL (最适稳定量) 的啶虫脒抗体，振荡混合均匀后，静置1 h；加入2.75 mL 含2.5% BSA 和2.5% PEG (质量分数) 的0.01 mol/L PBS 溶液 (pH 7.5)，振荡混合均匀，静置1 h；于12 000 r/min 下离心20 min，弃上清液；用10 mL 含0.5% BSA 和0.5% PEG (质量分数) 的0.01 mol/L 的 PBS 溶液 (pH 7.5) 复溶，于12 000 r/min 下离心20 min，弃上清液 (此步骤重复1次)；最后用1 mL 含0.5% 的 BSA 和5% 的蔗糖 (质量分数) 0.01 mol/L 的 PBS 溶液 (pH 7.5) 溶解，4 ℃保存。

1.4 试纸条的组装和制备 1.4.1 试纸条组装

如图 1 所示：将一定浓度的金标抗体、人工抗原 (T 线，测试线，5) 和二抗 (C 线，质控线，6) 分别包被在金标结合垫 (2) 和硝酸纤维素膜 (NC 膜，3) 上，并根据层析方向由下至上，将样品垫 (1)、金标结合垫 (2)、NC 膜 (3)、吸水垫 (4) 依次粘于 PVC 衬板 (7) 上。将组装好的试纸切成3 mm 宽的试纸条，室温干燥条件下保存。

1.4.2 封闭系统和金标结合垫处理液的选择

选择合适的封闭配方和封闭方式，有利于控制层析速度和防止非特异吸附。本研究采用间接封闭模式，封闭液参照文献[19]配制。将含0.25% BSA、0.25% PVP 及5% 蔗糖 (质量分数) 的0.01 mol/L 的 PBST (PBST 是指含0.05% 吐温-20体积分数的 PBS) 溶液添加于样品垫中，于37 ℃ 下干燥。金标结合垫材料同样采用样品垫，分别以不经封闭液处理和经上述封闭液处理2组模式进行测试，对比两者的复溶效果。

1.4.3 蛋白稳定剂配方的选择

蛋白质在长期放置过程中易变性而失去生物活性，为了保证试纸条在一定时间内保持稳定，需要对 T 线 (测试线) 和 C 线 (质控线) 添加保护物质。本研究采用经验方法，分别添加质量分数为0、2.5%、5% 和10% 的蔗糖于蛋白稀释液中，用于划线，以不加蔗糖的0.01 mol/L 的 PBS 为对照，然后在4、37、和60 ℃ 下进行加速储存试验。在组装其他部件后，分别于0、1、3、7、14 d 时用0.01 mol/L 的 PBS 溶液进行测试，试纸条测试结果采用 ChemiDocTMMP 成像系统测定并记录白光下的灰度值，得出各时段 (T 值-背景值) / (C 值-背景值) 比值，通过计算每个组合的标准偏差来判定该组合的稳定性。

1.5 标准溶液和茶叶样品的检测 1.5.1 标准溶液配制

先用甲醇分别配制1 000 ng/mL 的啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、烯啶虫胺、氯噻啉及呋虫胺标准储备液，再分别用0.01 mol/L 的 PBS 缓冲液稀释，分别得到10、5和2 ng/mL 的标准工作液。

1.5.2 茶叶样品制备

称取1 g 茶叶样品，加入50 mL 开水，浸泡30 min 后取茶汤 (pH 值为6~7) 待测。由于25 ℃ 时啶虫脒在水中的溶解度为4 200 mg/L，热稳定性良好，且在弱酸和中性条件下稳定，因此采用开水浸提的方式时可忽略啶虫脒的降解。在茶汤样品中添加啶虫脒标准溶液，添加水平为2.5、5和10 ng/mL，考察茶汤基质对检测结果的影响；在茶叶样品中添加啶虫脒标准溶液，添加水平为2.5、5和10 ng/mL，采用上述开水浸提方法获取茶汤样品，考察该分析方法的可靠性。

1.5.3 样品检测及结果判定

取50 μL 啶虫脒标准溶液 (质量浓度分别为2、5、10 ng/mL) 或茶汤样品滴入试纸条样品垫样品孔中，10 min 内读取结果，以检测线不显色作为试纸条的检测灵敏度。根据 T 线和 C 线的显色情况判断样品中农药的阴阳性结果：T 线和 C 线均显示红色→阴性；T 线显示浅红色，C 线显示红色→阳性；T 线不显色，C 线显示红色→阳性；T 线显示红色，C 线不显色→失效；T 线和 C 线均不显色→失效。

2 结果与分析 2.1 啶虫脒杂交瘤细胞的筛选、抗体效价及亚型

以啶虫脒-OVA (5 μg/mL) 为包被原，采用 ELISA 法测得免疫4次后小鼠的抗血清效价达1:32 000。从融合后的细胞中筛选出强阳性细胞，采用啶虫脒间接竞争 ELISA 法，最终筛选出对其有较好识别性能的细胞株 ACE-A6，经多次亚克隆后获得稳定的单抗细胞株。纯化后抗体的效价大于1:10 000，其抗体亚型重链为 IgG1，轻链为λ。

2.2 啶虫脒抗体的亲合力和特异性

采用棋盘滴定法确定得最适抗原、抗体工作浓度：包被原啶虫脒-OVA 为0.5 μg/mL，抗体稀释倍数为1/16 000。在上述优化条件下建立啶虫脒竞争标准曲线 (图 2)，检测灵敏度 IC₂₀ 为0.85 ng/mL，抑制中浓度 IC₅₀ 为3.62 ng/mL，检测线性范围为0.85~15.39 ng/mL。

采用间接竞争 ELISA 法检测啶虫脒抗体对其他7种烟碱类农药的交叉反应率，测得啶虫脒抗体对噻虫啉的交叉反应率为10.6%，而对吡虫啉、噻虫嗪、噻虫胺、烯啶虫胺、氯噻啉和呋虫胺的交叉反应率均 < 2%，表明抗体对这些烟碱类农药无显著交叉反应 (噻虫啉略有交叉)。

2.3 胶体金与标记蛋白用量

通过 MD 多功能酶标仪对胶体金颗粒在波长400~600 nm 范围进行扫描，测得最大吸收波长为520 nm；经激光粒度仪测试，其平均粒径在25 nm 左右。

由表 1 看出：胶体金标记啶虫脒抗体的最小稳定量在90 μg/mL，计算方法参考文献[18]，筛选条件为啶虫脒抗体标记的胶体金中加入氯化钠后120 min 的 OD_520nm 值与未加入氯化钠的 OD_520nm 值的变异系数 (CV) 小于15%，由此得出标记蛋白的最适稳定量为108 μg/mL (为筛选结果90 μg/mL 的1.2倍)。

2.4 T、C 线蛋白稳定剂筛选

由表 2 知，相比于对照组，含不同质量分数蔗糖的0.01 mol/L 的 PBS 溶液对人工抗原 (T 线) 和二抗 (C 线) 的稳定性均有一定的保护作用。但在高温环境下，添加2.5% 的蔗糖时保护效果明显不佳，而添加10% 的蔗糖优于添加5% 的蔗糖。在37和4 ℃ 条件下，添加10% 蔗糖与5% 蔗糖时效果相近，均优于添加2.5% 的蔗糖。综合分析，最终选择添加10% 蔗糖的0.01 mol/L 的 PBS 溶液作为 T、C 线蛋白稳定剂。

2.5 试纸条的检测灵敏度和准确度

啶虫脒标准品和3种茶汤中添加啶虫脒标准溶液的试纸条测试结果 (图 3) 显示：测试10 ng/mL 的啶虫脒标准溶液和茶汤中添加10 ng/mL 的啶虫脒时，T 线均不显色 C 线均显示红色，因此认为该金标试纸条用肉眼判断的方法灵敏度为10 ng/mL。考虑到干茶基质的稀释因子为50倍，则确定3种茶叶样品中啶虫脒的最小检出量均为0.5 mg/kg。

添加回收试验结果显示：3种茶叶中添加啶虫脒的显色情况 (表 3) 与茶汤中添加啶虫脒的显色情况 (图 3) 完全一致，表明该试纸条适用于茶叶中啶虫脒的快速检测。

此外，交叉反应试验结果显示：用试纸条检测10、50和100 ng/mL 的吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、噻虫胺、烯啶虫胺、氯噻啉和呋虫胺标准品时，T 线均显示红色 (当噻虫啉为100 ng/mL 时，T 线略变浅)，说明该啶虫脒试纸条对这7种烟碱类农药均无显著交叉反应 (噻虫啉略有交叉)，与 ELISA 法的交叉反应结果一致。而噻虫啉在实际茶叶生产上应用较少，因此该试纸条可用于啶虫脒的快速检测。

3 小结与讨论

在试纸条的研制过程中，抗原和抗体的制备是首要条件。本文中啶虫脒人工半抗原、免疫原 (啶虫脒-BSA) 和包被原 (啶虫脒-OVA) 均为本实验室通过偶联反应制备。在杂交瘤细胞的筛选过程中，最终筛选出对啶虫脒有较好识别性能的细胞株 ACE-A6，纯化后抗体的效价为1:10 000，所建立的 ELISA 方法对啶虫脒的检测灵敏度为0.85 ng/mL，与已经报道的啶虫脒抗体^[19]性能接近。

胶体金标记抗体是试纸条制备过程中的关键步骤。抗体与胶体金的标记量直接影响试纸条的显色判断与检测灵敏度。本研究通过 pH 值调节和抗体浓度的筛选，得出最适 pH 值和最适稳定量。同时，试纸条中检测线 (T 线) 和质控线 (C 线) 的保护剂也尤为重要，直接关系到金标试纸条的有效性和保存期。本研究中采用蔗糖作为保护材料，与文献中所用的海藻糖、PVP 及 PEG 的保护效果^[20]一致，但本研究所用材料更加简单，添加10% 的蔗糖即可达到最佳保护效果。所制备的免疫金标试纸条可用于茶叶中啶虫脒残留的快速检测与诊断，并具有灵敏度高、使用便捷、结果准确、成本低等优点，肉眼判断茶汤样品检测灵敏度可达10 ng/mL，茶叶中啶虫脒的检出限为0.5 mg/kg，能够满足中国规定的茶叶中吡虫啉 (参照值) 的最大残留限量0.5 mg/kg^[4]下的检测要求。

虽然本研究中试纸条的检出限 (0.5 mg/kg) 与已报道的气相色谱方法的检出限 (0.01 mg/kg)^[7]有一定差距，但两者的样品前处理方法不同，后者需通过提取、浓缩和净化等多步处理才能得到待测样品，而前者只需提取和稀释即可得到待测样品，因此试纸条方法具有方便快捷的优势。同时，啶虫脒试纸条与其他烟碱类农药无交叉反应，可以实现快速、有效地对成品茶样品 (如绿茶、红茶、铁观音) 中的啶虫脒进行现场测试诊断。