2016, Vol. 18
2. 中国农业科学院 植物保护研究所, 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193
2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
植物寄生线虫是重要的植物病原物之一，在全世界普遍发生，其寄主范围广，为害严重，全世界每年由植物寄生线虫造成的农作物经济损失高达 1 570 亿美元[1-2]。用于防治植物寄生线虫的非熏蒸类杀线虫剂如涕灭威、克百威、灭线磷等由于毒性高、危害环境安全和人类健康，已被禁止或限制在作物上使用。因此，研究发现植物线虫新的作用靶标，开发新型、高效、低毒的杀线虫剂已日益迫切。
拟除虫菊酯类是继有机氯、有机磷和氨基甲酸酯类农药后兴起的一类广谱杀虫剂，由于其具有高效、低毒、低残留和易于降解等特点，已被广泛应用于农业害虫、卫生害虫及粮食贮藏害虫等的防治。拟除虫菊酯类杀虫剂主要作用于昆虫电压门控钠离子通道 (voltage-gated sodium channel, VGSC)，影响其激活与失活动力学，从而造成神经兴奋性的传导障碍[3-4]。近年来的研究发现，氯氰菊酯、氯氟氰菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂在亚致死剂量下对秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans 的运动、生殖和摄食均具有一定的抑制活性[5-7]，溴氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯对松材线虫也具有较好的杀灭活性[8]。为进一步了解拟除虫菊酯类杀虫剂对植物线虫的活性，探讨其对植物线虫可能的作用机制，本研究选择溴氰菊酯，同时以丙溴磷、阿维菌素和克百威为对照药剂，对马铃薯腐烂茎线虫进行了毒力测定，并比较分析了 4 种药剂对线虫运动扩散及摄食等行为的影响，探讨了溴氰菊酯可能的作用机制，以期为进一步开发、利用拟除虫菊酯类杀虫剂在植物线虫防治方面的潜力提供依据。
1 材料与方法 1.1 试材和仪器供试线虫：马铃薯腐烂茎线虫 Ditylenchus destructor，由本实验室利用半裸镰刀菌 Fusarium semitectum 于 25 ℃条件下离体培养 40 d 后，收集分离马铃薯腐烂茎线虫，用无菌去离子水冲洗 3 次，再用 M9 缓冲液将其配成悬浮液，备用[9-10]。
药剂及试剂：98% 溴氰菊酯 (deltamethrin) 原药由江苏扬农化工股份有限公司提供；对照药剂 90% 丙溴磷 (profenofos) 原药和 95% 阿维菌素 (abamectin) 原药由湖南大方农化有限公司提供，97% 克百威 (carbofuran) 原药由湖南化工研究院提供。荧光染料 98% 青色素 3 (Cy3)，分析纯，购自北京索莱宝 (Solarbio) 公司；其他试剂均为国产分析纯。
主要仪器：NIKON ECLIPSE 80i 共聚焦荧光显微镜，日本尼康 (Nikon) 公司。
1.2 试验方法 1.2.1 药剂配制将溴氰菊酯、丙溴磷、阿维菌素及克百威原药分别用丙酮和吐温-80 配成有效成分质量分数为 1% 的乳油，再用 M9 缓冲液稀释至试验所需质量浓度。
Cy3 溶液：将 Cy3 溶于去离子水中，配成 10 mg/mL 的母液，4 ℃避光保存。
M9 缓冲液：磷酸二氢钾 3 g，磷酸氢二钠 6 g，氯化钠 5 g，1 moL/L 的硫酸镁 1 mL，用双蒸水定容至 1 L。
1.2.2 药剂对马铃薯腐烂茎线虫的毒力测定参照丁中等[10]所用的药液浸渍法并稍加改进。将马铃薯腐烂茎线虫 (约 200 条) 浸渍在盛有系列浓度药液、直径 5 cm 的玻璃培养皿中，用封口膜密封后置于 25 ℃ ± 1 ℃ 恒温培养箱中，48 h 后在体视显微镜 (20 ×) 下检查马铃薯腐烂茎线虫的存活数量和死亡数量。以线虫呈僵直不动或卷曲、不活动，用挑针拨动无反应视为死虫，线虫呈弯曲蠕动状态，或静止状态下用挑针拨动反应迅速者为活虫。计算死亡率与校正死亡率。以 M9 缓冲液 (含 0.01% 丙酮和吐温-80) 处理为空白对照，每处理重复 3 次。
1.2.3 药剂对马铃薯腐烂茎线虫运动扩散能力的影响参照丁中等[10]所用的沙柱法测定。每药剂设 5 个浓度处理，以 M9 缓冲液 (含 0.01% 丙酮和吐温-80) 处理为空白对照，每处理重复 3 次。24 h 后在体视显微镜下检查皿内线虫并计数，计算线虫通过率和相对抑制率：通过率/% = (通过线虫头数/投入线虫总头数) × 100；相对抑制率/% = [(1 – 处理组通过率)/对照组通过率] × 100。
1.2.4 药剂对马铃薯腐烂茎线虫摄食的影响 1.2.4.1 丙溴磷和克百威对摄食的影响参照 Schroeder 等[11]所用的线虫与荧光染料共孵育方法并加以改进。在 1.5 mL 小玻璃瓶中分别加入 200 μL 不同浓度的丙溴磷、克百威和 200 μL 线虫悬浮液 (约 200 条线虫)，25 ℃下避光培养 2 h 后，用 M9 缓冲液清洗 3 次；加入等体积、0.2 mg/mL 的 Cy3 溶液，5 min 后立即用去离子水清洗线虫 3 次；于玻片上稍加热杀死线虫，在荧光显微镜下观察荧光物质在线虫消化道的分布情况并拍照。以 M9 缓冲液 (含 0.01% 丙酮和吐温-80) 处理为空白对照，每浓度重复 3 次。在荧光显微镜下观察并记录药剂刺激 90%以上线虫摄食的最低浓度和抑制 100% 线虫摄食的最低浓度。
1.2.4.2 阿维菌素和溴氰菊酯对摄食的影响由预试验发现，溴氰菊酯和阿维菌素在 0.1~1 000 mg/L 质量浓度范围内均不能刺激马铃薯腐烂茎线虫的摄食，因此，为成功观察溴氰菊酯和阿维菌素对线虫摄食的影响，本研究选用丙溴磷作为前期刺激线虫摄食的药剂。
首先确定丙溴磷刺激线虫摄食的最佳浓度，即线虫依次经丙溴磷处理、M9 缓冲液清洗 3 次及溶剂空白对照处理 2 h 后，仍可持续刺激线虫摄食且线虫未出现死亡的丙溴磷浓度。然后用该浓度的丙溴磷处理线虫 2 h，M9 缓冲液清洗 3 次后再按 1.2.4.1 节的方法加入不同浓度的阿维菌素、溴氰菊酯以及溶剂空白对照，在荧光显微镜下观察并记录药剂抑制 100% 线虫摄食的最低浓度。
1.2.5 数据统计分析参照 Finney 机率值分析法，用 DPS 统计软件进行数据处理，求出各药剂对马铃薯腐烂茎线虫的毒力回归方程 (y = a + bx)、相关系数 (r)、LC50 (或 IC50) 值及 95% 置信区间。
2 结果与分析 2.1 药剂对马铃薯腐烂茎线虫的毒力测定结果 (表 1) 表明，溴氰菊酯对马铃薯腐烂茎线虫具有一定的杀灭活性，但活性低于对照药剂丙溴磷、克百威和阿维菌素。
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表 1 药剂对马铃薯腐烂茎线虫的毒力 Table 1 Toxicity of four insecticides against D. destructor |
2.2 药剂对马铃薯腐烂茎线虫运动的抑制活性
测定结果 (表 2) 表明，溴氰菊酯对马铃薯腐烂茎线虫运动能力具有较高的抑制活性，其活性高于丙溴磷与克百威，但低于阿维菌素。
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表 2 药剂对马铃薯腐烂茎线虫运动的抑制活性 Table 2 Inhibitory activities of four insecticides on the locomotion of D. destructor |
2.3 药剂对马铃薯腐烂茎线虫摄食的影响 2.3.1 丙溴磷和克百威对线虫摄食的影响
植物线虫通常在非取食阶段或离体情况下不摄食。通过观察发现，含 0.01% 丙酮和吐温-80 的 M9 缓冲液对马铃薯腐烂茎线虫摄食无刺激作用，其口针以下的食道中未见荧光染料 Cy3 的分布 (图 1-A)。经系列浓度药剂处理，缩小药剂浓度范围后发现，当丙溴磷和克百威最低分别降至 0.6 和 40 mg/L 时，可观察到 90%以上马铃薯腐烂茎线虫食道内有 Cy3 的分布 (图 1-B 和 1-C)，表明在该浓度下丙溴磷和克百威可刺激马铃薯腐烂茎线虫的摄食；而当丙溴磷和克百威质量浓度分别为 360 及 300 mg/L 时，则全部线虫的食道中均无 Cy3 的分布 (图 1-D和 1-E)，表明在此浓度下，丙溴磷和克百威对线虫的摄食具有抑制作用。两者相比，较低浓度的丙溴磷即可刺激线虫的摄食，但其抑制线虫摄食的最低浓度高于克百威。
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图 1 经不同浓度丙溴磷和克百威处理后 Cy3 在马铃薯腐烂茎线虫食道中的分布(400 ×) Fig. 1 Distribution of Cy3 in the esophagus of D. destructor after exposure to different concentrations of profenofos or carbofuran (400 ×) |
2.3.2 溴氰菊酯和阿维菌素对线虫摄食的影响
经过系列浓度筛选，最终确定丙溴磷刺激线虫摄食的最佳浓度为 10 mg/L。线虫经该浓度的丙溴磷浸渍处理后，再用含溶剂的 M9 缓冲液处理 2 h，线虫仍可持续摄食 (图 2-A)，而经 20 mg/L 阿维菌素和 200 mg/L 溴氰菊酯处理后 (图 2-B 和 2-C)，线虫的摄食受到抑制。
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图 2 经溴氰菊酯和阿维菌素处理后 Cy3 在马铃薯腐烂茎线虫食道中的分布(400 ×) Fig. 2 Distribution of Cy3 in the esophagus of D. destructor after exposure to deltamethrinor abamectin (400 ×) |
研究表明，溴氰菊酯对线虫摄食的抑制活性低于阿维菌素，但高于丙溴磷和克百威。
3 结论与讨论目前有关拟除虫菊酯类杀虫剂对线虫的毒理作用研究多集中在环境毒理学领域，且其模式生物一般为秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans [5-7]。该类药剂也尚未在植物线虫防治中得到应用。本研究发现，溴氰菊酯对马铃薯腐烂茎线虫具有一定的杀灭活性，并通过沙柱法及荧光染料共孵育的方法，证明了溴氰菊酯对马铃薯腐烂茎线虫的运动扩散和摄食能力具有较高的抑制活性。非熏蒸类杀线虫剂的作用特点不在于杀死线虫，而在于低浓度下可干扰线虫的化学感应和定位于寄主植物根部的能力，高浓度下可干扰线虫运动、觅食、孵化以及交配等行为，从而达到控制土壤中植物线虫数量的目的[12-13]。拟除虫菊酯类杀虫剂是否可用于植物线虫的田间防治还有待进一步研究。
植物线虫通常在非取食阶段或离体情况下不摄食，因而常采用章鱼胺或间苯二酚来刺激其摄食[14-15]。本研究采用作用机理比较清楚的丙溴磷作为刺激剂，发现经 10 mg/L 的丙溴磷处理后可刺激马铃薯腐烂茎线虫食道相关肌肉持续性收缩而摄食，在此基础上测定了溴氰菊酯和阿维菌素对线虫摄食的抑制作用。即使丙溴磷与后续药剂的效应有叠加，但由于其导致的兴奋性突触后电位与阿维菌素等引起的抑制性突触后电位在时空上可以被中和，因此采用丙溴磷进行前期处理对于后续观察溴氰菊酯和阿维菌素的抑制效果是可行的。
通过对马铃薯腐烂茎线虫的神经毒性行为症状进行观察，发现溴氰菊酯所导致的症状与阿维菌素的较为相似，线虫的运动扩散能力及摄食行为均受到抑制，但未表现出低剂量下的兴奋性效应，其结果与菊酯类杀虫剂对秀丽隐杆线虫的毒性效应相一致[5, 7]。而丙溴磷和克百威在低浓度下可刺激线虫摄食，从而表现为兴奋性效应。丙溴磷和克百威分属有机磷和氨基甲酸酯类，其作用机制都是作用于昆虫乙酰胆碱酯酶 (AChE)，可与 AChE 结合而抑制其活性，导致 ACh 不能被及时分解而在突触间隙内堆积，引起胆碱能神经先兴奋后抑制的一系列症状，并导致昆虫死亡[16]。显然，溴氰菊酯对马铃薯腐烂茎线虫的作用机制有别于有机磷类和氨基甲酸酯类。阿维菌素则主要通过作用于线虫的谷氨酸门控氯离子通道，促使由谷氨酸控制的氯离子通道开放，氯离子通透性增强，导致膜电位超极化，从而阻断神经信号的传导，引起虫体运动和咽泵快速麻痹，最终使得线虫不能运动和摄食[17]。
溴氰菊酯属于含 α-氰基的Ⅱ型拟除虫菊酯类杀虫剂，此类药剂对钠离子通道开放的延长时间较Ⅰ型长，从而可导致膜电位的过度去极化，失去复极化能力[4]，因此不会出现兴奋症状，而是表现出运动失调后的中毒症状，即昆虫立刻痉挛并迅速进入麻痹状态，最后瘫痪死亡。此外，溴氰菊酯还可作用于昆虫的其他一些靶标，如氯离子通道、ATP 酶、氨基丁酸受体、谷氨酸受体、乙酰胆碱受体以及电压门控钙离子通道等[18-23]。
线虫的运动是通过体壁背腹部纵向肌肉间的交替收缩来实现的[24]。植物线虫的摄食则主要是通过与口针基部球相连肌肉的牵引以及中食道球瓣的收缩来摄取寄主植物细胞中的营养[13]。电压门控钠离子通道是可兴奋细胞 (excitable cell) 产生动作电位的基础[25]，然而，至今并未发现线虫具有电压门控钠离子通道[26-29]。已有的研究表明，钙离子在秀丽隐杆线虫动作电位的产生中起主要作用，其体壁肌肉的收缩与放松与 L 型电压门控钙离子通道及电压依赖性钾离子通道有关[29]；而线虫咽部动作电位则受 T 型电压门控钙离子通道 CCA-1、L 型电压门控钙离子通道 EGL-19 以及钾离子通道 EXP-2 所调控[30]。关于溴氰菊酯是否通过作用于与线虫肌肉运动相关的钙离子通道或钾离子通道而导致线虫相关肌肉的麻痹，以及具体作用于何种类型的通道，还有待进一步研究。
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