绿盲蝽Apolygus lucorum(Meyer-Dur),属半翅目盲蝽科,是一种在我国发生严重的农业害虫,近年来,尤其对葡萄的危害逐年加重^[1]。同时,绿盲蝽抗药性很强,危害严重时需多次喷洒农药才能达到治理效果,给生态环境和人类健康带来潜在危害^[2]。

随着人们对生活质量和环境要求的提高以及对化学农药的限制使用,性信息素逐步受到关注。利用性信息素防治害虫主要采用集中诱捕和干扰交配两种手段。干扰交配主要是利用雄性分泌的性信息素干扰其他雄性昆虫对某雌虫的化学通讯定位^[2],起到迷向作用,通过减少昆虫的交配机会而达到减少二代害虫的数量。目前微囊技术已发展到各个领域,将其与性信息素结合用于害虫综合治理的方法逐步受到重视^[3]。国内外已有多项性信息素微囊的研究报道^{[4, 5, 6]}。人工合成的性信息素微囊具有保护有效成分、稳定释放速率、延长持效期及减轻环境压力等特点。目前,国内已成功制备了小菜蛾性信息素(Z11-16:Ac)微囊,提高了性信息素的利用率,延长了其释放时间^[7];郭玉杰等制备了二化螟性干扰剂微囊,并验证了其田间防治的可行性^[8]。张涛研究表明,丁酸己酯是一种反性信息素,具有干扰绿盲蝽交配、抑制性诱剂引诱效果的作用^[2]。目前,将丁酸己酯微囊化用于绿盲蝽防治的研究尚未见报道。为了延长丁酸己酯的持效期,本研究以乙基纤维素为壁材、丁酸己酯为芯材、乙酸乙酯为溶剂,采用相分离法制备了绿盲蝽交配干扰剂丁酸己酯微囊。通过正交试验研究了乳化剂700^#、聚乙烯醇和乙酸乙酯及控释剂正十二烷4个因素对丁酸己酯微囊形成的影响,得到最佳制备工艺条件,并进行了田间药效试验。现将结果报道如下。 1 材料与方法 1.1 试剂与设备

丁酸己酯、乙酸乙酯、聚乙烯醇、正十二烷和三氯甲烷(均为分析纯),乙基纤维素(化学纯),均为天津化学试剂厂产品;乳化剂700^#,山东天道生物工程有限公司产品;消泡剂聚醚改性硅,德丰消泡剂有限公司。绿盲蝽性信息素诱芯,北京中捷四方生物科技有限公司。

JJ-1型数字显微测速电动搅拌器,水北科普实验仪器厂;FA1004电子分析天平(精度0.1mg),上海舜宇恒平科学仪器有限公司;TXS10-01B生物显微镜,南阳市瑞特光学仪器厂;Agilent 7890A气相色谱仪,安捷伦科技有限公司;LMC-1002桶形诱捕器,北京中捷四方生物科技有限公司。 1.2 试验方法 1.2.1 丁酸己酯微囊的制备

参考文献^[6]方法。称取2.0 g聚乙烯醇,在90℃下先用去离子水溶解,再加入1.5 g乳化剂700^#搅拌均匀,作为水相;称取3.0 g乙基纤维素和2.0 g控释剂正十二烷于另一烧杯中,加入2.0 g丁酸己酯和30 mL乙酸乙酯,搅拌至乙基纤维素完全溶解,作为有机相;将水相在1 000 r/min下搅拌,并控制反应温度为40℃,以5 mL/min的速率将有机相滴加至水相。滴毕,逐渐升温至60℃,待乙酸乙酯挥发干净时滴加0.2 g消泡剂聚醚改性硅,抽滤,用去离子水洗涤微囊3次,于室内干燥,得约12.0 g丁酸己酯微囊。 1.2.2 制备参数优化设计

根据单因素预试验,选取对微囊质量影响较大的乳化剂用量700^#(A)、聚乙烯醇用量 (B)、乙酸乙酯用量(C)及正十二烷用量(D)4个因素,每个因素4个水平进行L₁₆(4⁵)正交试验^{[9, 10, 11]}。因素水平见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 正交试验设计因素水平 Table 1 Factors and levels of orthogonal tests 水平Level 因素Factor A/g B/g C/mL D/g 1 0.5 1.0 20 1.0 2 1.0 1.5 30 2.0 3 1.5 2.0 40 3.0 4 2.0 2.5 50 4.0 注 A.乳化剂700#用量;B.聚乙烯醇用量;C.乙酸乙酯;D.正十二烷用量。 Note:A. the dosage of emulsifier 700#; B. the dosage of polyvinyl alcohol; C. the dosage of ethyl acetate; D. the dosage of n-dodecane.

表 1 正交试验设计因素水平 Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

准确称取0.02 g干燥后的微囊于样品瓶中,用1 mL三氯甲烷溶解,置于冰箱中(-5℃)保存待用,用气相色谱法测定微囊中丁酸己酯的质量^[12]。

气相色谱条件:Agilent19091J-413色谱柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm),不分流进样,载气为氮气,检测室温度280℃,气化室温度280℃。升温程序:初始温度80℃,以15℃/min升至180℃,之后再以30℃/min的速率上升到250℃,保持 5 min。FID检测器;进样量1 μL。

按(1)和(2)式计算包封率及载药量。

将微囊均匀地涂抹在载玻片上,利用生物显微镜在不同视野下观察、拍照。

采用显微镜计数法,利用测微尺准确读取载玻片上每个微囊的大小,随机统计300个微囊粒径,用SPSS软件制作粒径分布图。 1.2.5 微囊释放速率的测定

称取8 g微囊于培养皿中,于室内(24℃±1℃)放置使其自由释放,定期取样,并按1.2.3节方法测定微囊中丁酸己酯的质量,按(3)式计算不同时间时微囊内丁酸己酯的保留率。

于2014年9-10月在河北省秦皇岛市昌黎县朗格斯酒庄试验基地进行丁酸己酯微囊田间药效试验。将丁酸己酯微囊装入发散器小瓶中,每瓶装1.0 g,每块样区400 m²,每隔5 m悬挂一个小瓶,共悬挂16个,随机悬挂3个诱捕器(通过诱捕器诱捕到的绿盲蝽数量考察丁酸己酯微囊的性干扰效果);同时设置对照区(不放置丁酸己酯微囊)。每隔4 d(即9月25日、10月1日、10月6日和10月11日)调查记录各诱捕器中绿盲蝽的数量,所得结果用SPSS软件进行统计分析。 2 结果与分析 2.1 正交试验结果分析

正交试验结果见表 2;以包封率为主要指标进行的方差分析,结果见表 3;优化条件下制备的丁酸己酯微囊指标测定结果见表 4。

表 2(Table 2)

表 2 正交试验结果 Table 2 Results of the orthogonal test 序号Number 水平Level 空白Blank 平均粒径Averageparticle size/μm 跨度Span 包封率Covering rate/% A B C D 1 1 1 1 1 1 309.72 0.79 78.38 2 1 2 2 2 2 407.25 0.75 87.88 3 1 3 3 3 3 563.18 1.22 73.75 4 1 4 4 4 4 324.11 0.67 91.62 5 2 1 2 3 4 321.24 0.46 90.79 6 2 2 1 4 3 415.35 0.57 61.59 7 2 3 4 1 2 429.48 0.95 90.64 8 2 4 3 2 1 207.21 0.71 76.21 9 3 1 3 4 2 205.98 0.46 76.20 10 3 2 4 3 1 210.24 0.43 78.65 11 3 3 1 2 4 394.55 0.52 93.79 12 3 4 2 1 3 427.52 0.56 84.70 13 4 1 4 2 3 363.93 0.47 68.47 14 4 2 3 1 4 313.70 0.80 50.38 15 4 3 2 4 1 237.85 0.58 56.09 16 4 4 1 3 2 364.50 0.61 62.38 注:A.乳化剂700#用量;B.聚乙烯醇用量;C.乙酸乙酯用量;D.正十二烷用量。此外,乙基纤维素3.0 g、丁酸己酯3.0 g。 Note:A. the dosage emulsifier 700#; B. the dosage of polyvinyl alcohol; C. the dosage of ethyl acetate; D. the dosage of n-dodecane. Besides,the dosage of ethyl cellulose was 3.0 g,the dosage of hexyls butyrate was 3.0 g.

表 2 正交试验结果 Table 2 Results of the orthogonal test

表 3(Table 3)

表 3 丁酸己酯微囊包封率的方差分析表 Table 3 Analysis of the variance of hexyls butyrate microcapsules encapsulated rate 方差来源Sources of variance Sj fj s F 显著性Significant A 1 573.703 3 524.568 25.576 ** B 240.990 3 80.330 9.854 * C 422.842 3 140.947 11.498 * D 209.157 3 69.719 4.741 误差 Error 282.249 4 94.083

表 3 丁酸己酯微囊包封率的方差分析表 Table 3 Analysis of the variance of hexyls butyrate microcapsules encapsulated rate

由表 3数据可以看出,各因素对微囊包封率的影响为A>C>B>D,即乳化剂700^#用量>乙酸乙酯用量>聚乙烯醇用量>正十二烷用量。结合之前所做的单因素预试验和正交试验结果,综合考虑平均粒径、跨度和包封率3个指标,确定制备丁酸己酯微囊的最佳工艺条件为:乙基纤维素3.0 g、丁酸己酯3.0 g、乳化剂700^# 1.5 g、聚乙烯醇2.0 g、乙酸乙酯30 mL和正十二烷2.0 g,滴加速率为5 mL/min,转速为 1 000 r/min。由此制备出的微囊外观较完整,粒径分布较均匀,平均粒径301.85μm±3.04 μm,跨度0.61±0.03,载药量21.5%±0.14%,包封率91.9%±0.57%,工艺较稳定,重现性良好。 2.2 微囊形态观察和粒径分布

显微镜观察(图 1)结果表明,微囊外部形态较为规则,表面较光滑,分散性较好。

图 1

图 1 丁酸己酯微囊显微镜图(40×) Fig. 1 The microscope photograph of butyric acid ester microcapsule(40×)

显微镜计数法(图 2)结果表明,微囊粒径基本呈正态分布,主要集中在260~360 μm。

图 2

图 2 丁酸己酯微囊粒径分布 Fig. 2 The particle size distribution of butyric acid ester microcapsule

采用最佳工艺制备的丁酸己酯微囊释放曲线见图 3。可以看出,微囊中的丁酸己酯在35 d内缓慢释放,35 d时达到最大值,之后趋于平缓,没有突释现象,具有一定的缓释效果。

图 3

图 3 丁酸己酯微囊累积释放曲线 Fig. 3 Release curve graph of butyric acid ester microcapsule

结果(表 4)表明:在试验期间内,未悬挂丁酸己酯微囊的试验区(对照组)诱捕到绿盲蝽的总数量666头,而悬挂丁酸己酯微囊的试验区(处理组)诱捕到总数量224头,处理组诱捕到的绿盲蝽数量显著少于对照组,表明丁酸己酯微囊有效地干扰了绿盲蝽性信息素的传递,大大减少了绿盲蝽的田间种群数量。

表 4(Table 4)

表 4 丁酸己酯微囊田间试验数据统计 Table 4 Microcapsules field test statistics 试验区Test area 总绿盲蝽数The totalnumberof A.lucorum 平均每个诱捕器诱捕虫数±标准差,The number of averageper trap±SD 对照区Contrast area 666 55.25±6.33 微囊试验区Microcapsules area 224 18.67±1.96** 注:**表示与对照相比差异极显著,即P<0.01。 Note:** difference reached extremely significant level,P<0.01.

表 4 丁酸己酯微囊田间试验数据统计 Table 4 Microcapsules field test statistics

本研究以化学稳定性高、无毒可降解的乙基纤维素为壁材,乙酸乙酯为溶剂,采用相分离法制备得到了丁酸己酯微囊。参考单因素试验并结合正交试验结果确定了最佳制备条件:乙基纤维素3.0 g、丁酸己酯3.0 g、乳化剂700^# 1.5 g、聚乙烯醇2.0 g、乙酸乙酯30 mL和正十二烷2.0 g,滴加速率为5 mL/min,转速为1 000 r/min。所得的微囊载药量和包封率分别为21.5%和91.9%,且外观较完整,平均粒径约为301.85 μm,缓释效果较好,35 d释放量达最大值。田间试验结果表明,悬挂微囊样区诱捕到的绿盲蝽的数量显著少于对照区,验证了丁酸己酯微囊对绿盲蝽具有性干扰效应。