近年越来越多的研究表明，多种农药能对机体的甲状腺内分泌产生干扰作用。例如，暴露于三唑酮(triadimefon)^[1]、丁草胺(butachlor)^[2]、己唑醇(hexaconazole)及戊唑醇(tebuconazole)^[3]中均会改变斑马鱼幼鱼甲状腺激素T3、T4的浓度，并影响促甲状腺激素(tsh)、脱碘酶(d1)及甲状腺激素受体(trβ)等相关基因的表达；暴露于三氟氯氰菊酯(cyhalothrin)中可降低淡水鲶鱼体内甲状腺激素含量^[4]；暴露于久效磷(moncrotophos) 中能引起金鱼甲状腺病理学变化，并使其甲状腺激素T3含量下降^[5]。

乙草胺(acetochlor)自1971年问世以来，已在世界范围内得到广泛应用^[6]，是我国目前使用量最大的3种除草剂之一^{[7, 8]}。随着其大量使用，残留在土壤中的乙草胺随着雨水的淋溶作用等进入江河、池塘等地表水，加上其相对稳定的累积作用，使得水环境中乙草胺浓度和检出率逐年增加^{[9, 10, 11, 12, 13]}；甚至在长期接触乙草胺的工人体液中也有 0.15 μg/L的残留量检出^[14]。因此，环境中大量残留的乙草胺可能会对水生生物的生长、发育、繁殖以及群落的稳定等造成不利影响。

已有研究表明，乙草胺对泥鳅、中华大蟾蜍及非洲爪蟾等具有一定的内分泌干扰效应。乙草胺可导致泥鳅红细胞细胞核异常和肝脏损伤^[15]；对变态期的非洲爪蟾具有抑制雄性化和促进雌性化的作用^[16]；可损坏花背蟾蜍蝌蚪肝脏细胞的DNA和细胞膜，并对其肝脏有氧化胁迫作用^[17]；可引起中华大蟾蜍早期胚胎发育出现原肠外突和畸胎^[18]；促使离体蟾蜍心肌收缩能力下降、心率减慢^[19]等。此外,还有研究认为乙草胺能加速北美豹蛙蝌蚪的早期变态发育^[20]；缩短牛蛙和非洲爪蟾蝌蚪变态期^{[21, 22]}；影响牛蛙蝌蚪脑部的发育^[23]等。虽然乙草胺是一种广泛使用并在水体中频繁检出的药剂，但有关其对水生生物甲状腺内分泌的干扰效应却尚未见研究报道。笔者研究了乙草胺对斑马鱼成鱼和胚胎的急性毒性以及对胚胎的致畸作用，并依据常菊花等^[24]的研究报道，在受精后5～14 d斑马鱼体内甲状腺激素变化剧烈的阶段设置窗口期暴露试验，测定了乙草胺连续暴露对受精后10和14 d斑马鱼幼鱼体内甲状腺相关基因表达的影响。

1 材料与方法 1.1 供试生物

试验用鱼为斑马鱼Danio rerio野生型品系(AB)(由浙江大学动物科学院提供)。将斑马鱼成鱼雌、雄分开饲养于斑马鱼养殖系统，早晚2次定时喂食刚孵化的新鲜丰年虫Artemia nauplii。饲养水温控制在(26±1)℃，光周期为 14 h/10 h(光/暗)，自然死亡率保持在 5% 以下。饲养两周后挑选体型大小一致、健康活泼的个体供试。 1.2 试剂及主要仪器

93.2% 的乙草胺 (acetochlor) 原药(由杭州庆丰农化有限公司提供)。Trizol reagent RNA提取试剂(Invitrogen公司,美国)；UNlQ-10 柱式总RNA 抽提试剂盒(上海生物工程有限公司)；PrimeScript^TM RT reagent Kit反转录试剂盒、 gDNA Eraser去基因组DNA试剂盒和SYBR Green PCR Kit实时荧光定量PCR试剂盒(Takara公司，大连)。

斑马鱼养殖系统(北京爱生科技发展有限公司)；StepOnePlusTM Real-Time PCR 仪(Applied Biosystems公司，美国)；智能光照培养箱(宁波江南仪器厂)；台式离心机(Eppendorf公司，德国)；万分之一电子分析天平(Sartorius公司，德国)；TE2000尼康倒置荧光显微镜；岛津GCMS-2010plus气-质联用仪(岛津公司，日本)等。 1.3 试验方法 1.3.1 成鱼急性毒性试验

试验用水为经活性炭处理后的自来水，硬度86 mg/L(以CaCO₃ 计)，pH=6.8，导电率为 380 μs/cm。将乙草胺原药用水溶解、配制成200 mg/L的母液，加入到各处理组中，使乙草胺终浓度分别为0.625、1.25、2.5、5.0和10.0 mg/L，设不加药空白对照。每处理3个重复，每重复10 L水、10条成鱼，连续暴露96 h，试验周期内不更换药液。每24 h观察、记录斑马鱼的中毒症状和死亡情况，计算各处理组96 h 的死亡率及半数致死浓度(LC₅₀)^[25]。 1.3.2 斑马鱼胚胎毒性试验 1.3.2.1 胚胎急性毒性试验

于试验前24 h将挑选出的雌、雄成鱼按1∶2(♀∶♂)配对放入产卵盒，待产完卵后30 min将卵挑出，放入(26±1) ℃ 胚胎标准用水(117.60 mg CaCl₂·2H₂O，49.30 mg MgSO₄·7H₂O，25.90 mg NaHCO₃ 以及 2.30 mg KCl 溶解于1 L去离子水)^[26] 中清洗两次，以去除凝结的卵和粪便。将卵在清水中、26 ℃条件下培养至产后3 h，在显微镜下挑出发育正常、已进入囊胚期的卵用于急性毒性试验。共设0.44、0.875、1.75、3.5、7.0和14.0 mg/L 6个浓度组和空白对照组，每组3个重复，每个重复30枚卵，试验周期内不更换药液。将空白对照组和试验组分别置于(26±1)℃培养箱中培养至受精后120 h，光照周期同上。根据卵是否出现乳白色凝结、小鱼有无心率、血液是否流动记录死亡数，并及时挑出死卵、卵壳及死亡幼鱼，以防止污染水质。 1.3.2.2 胚胎慢性毒性试验

在预先装有500 mL药液的1 000 mL烧杯中，放入 200 枚发育正常、受精3 h后的受精卵，分别设置成鱼96 h-LC₅₀值的1/10 和1/50两个暴露浓度组和一个空白对照组，每处理3个重复，每72 h更换一次药液。从胚胎囊胚期(受精后3 h)开始持续暴露至受精后10 d和14 d取样。每个重复随机选取斑马鱼幼鱼40条，用吸水纸吸干幼鱼表面的水,分别放入Trizol reagent 试剂中，并于-20 ℃保存，用于总RNA 的提取及甲状腺相关基因表达量的测定。染毒期间及时挑出死亡的卵或幼鱼，以防止污染水质，并记录死亡数。当幼鱼全部孵出并上浮后，每天喂食新鲜绿藻和蛋黄溶液，将畸形的小鱼置于荧光倒置显微镜下观察并拍照。 1.3.3 总RNA 提取和实时荧光定量 PCR测定

按照UNlQ-10 柱式总 RNA 抽提试剂盒标注方法提取总 RNA后，采用PrimeScript RT reagent Kit 反转录试剂盒进行反转录，并用 gDNA Eraser Kit试剂盒去掉基因组DNA。实时荧光定量 PCR测定：按照 SYBR Green PCR Kit 荧光定量试剂盒说明书在冰上配制20 μL反应体系；反应程序为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环；溶解曲线为95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s；所用基因引物序列参考Yu等^[27] 和Jin等^[28]的报道(见表 1)。

Table 1表 1(Table 1)

表 1 实时荧光定量PCR引物序列 Table 1 Primers used for the quantification of mRNA expression by real-time PCR 基因名称 Gene name 引物序列 Sense primers (5′-3′) 产物长度 Size /bp 引物序列编号 GenBank accession No. β-actin FP5′-ACCCACACCGTGCCCATCTA-3′ RP 5′-CGGACAATTTCTCTTTCGGCTG-3′ 152 AF057040 crh FP5′- TTCGGGAAGTAACCACAAGC-3′ RP 5′- CTGCACTCTATTCGCCTTCC-3′ 161 NM_001007379 tsh FP5′- GCAGATCCTCACTTCACCTACC-3′ RP 5′- GCACAGGTTTGGAGCATCTCA-3′ 121 AY135147 s1c5 a5 FP5′- GGTGGCATGAAGGCTGTAAT-3′ RP 5′- GATACGGCATCCATTGTTGG-3′ 144 NM_001089391 tg FP5′- CCAGCCGAAAGGATAGAGTTG-3′ RP 5′- ATGCTGCCGTGGAATAGGA-3′ 175 XM_001335283 tpo FP5′- GCGCTTGGAACACAGTATCA-3′ RP 5′- CTTCAGCACCAAACCCAAAT-3′ 130 EU267076 ttr FP5′- CGGGTGGAGTTTGACACTTT-3′ RP 5′- GCTCAGAAGGAGAGCCAGTA-3′ 129 BC081488 trα FP5′- CTATGAACAGCACATCCGACAAGAG-3′ RP 5′- CACACCACACACGGCTCATC-3′ 85 NM_131396 trβ FP5′- TGGGAGATGATACGGGTTGT-3′ RP 5′- ATAGGTGCCGATCCAATGTCNM-3′ 110 NM_131340 d1 FP5′-GTTCAAACAGCTTGTCAAGGACT-3′ RP 5′-AGCAAGCCTCTCCTCCAAGTT-3′ 142 BC076008 d2 FP5′- GCATAGGCAGTCGCTCATTT-3′ RP 5′-TGTGGTCTCTCATCCAACCANM-3′ 103 NM_212789 ugt1ab FP5′- CCACCAAGTCTTTCCGTGTT-3′ RP 5′-GCAGTCCTTCACAGGCTTTC-3′ 168 NM_213422

表 1 实时荧光定量PCR引物序列 Table 1 Primers used for the quantification of mRNA expression by real-time PCR

于成鱼及胚胎急性毒性、胚胎慢性毒性暴露之前(0 h)和成鱼急性毒性(96 h)、胚胎急性毒性(120 h)结束后，以及胚胎慢性毒性更换药液(72 h)前，分别取200 mL水样，于-20 ℃保存，用于监测试验过程中乙草胺的消解状况。所采用的GC-MS检测方法参照Tan等的报道^[29]。 1.4 数据分析

采用SPSS17统计分析软件，以药剂质量浓度的对数值为自变量(x)，以斑马鱼在相应浓度下的死亡率几率值为因变量(y)，建立“剂量-效应”线性方程，计算LC₅₀值、相关系数(r)和95％置信限。

实时荧光定量PCR测定采用2^-ΔΔCt[30]方法计算各基因mRNA的相对表达量，并通过T-test检验试验组和对照组的差异显著性(P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著)。 2 结果与分析 2.1 乙草胺暴露浓度监测

本研究监测了全部试验过程中乙草胺的质量浓度变化，结果见表 2。表明：在胚胎慢性毒性(每72 h 更换药液)、成鱼急性毒性(96 h)及胚胎急性毒性(120 h)试验过程中，乙草胺的消解率分别为4.7%～6.3%、3.4%～5.6% 和4.1%～6.1%，即各试验阶段中乙草胺在暴露水体中均相对稳定，且实际浓度接近于设定浓度值。

Table 2表 2(Table 2)

表 2 试验过程中乙草胺质量浓度监测结果(n=3) Table 2 Measured concentrations of acetochlor during the tests (n=3) 试验类型 Experimental type 理论质量浓度 Theoretical conc./(mg/L) 监测质量浓度 Measured conc./(mg/L) 消解率 * Degradation rate */% 0 h 72 h 96 h 120 h 成鱼急性 毒性试验 Acute toxicity test of adult fish 0.625 0.637±0.031 — 0.610±0.026 — 4.2 1.25 1.193±0.010 — 1.153±0.040 — 3.4 2.5 2.426±0.024 — 2.291±0.035 — 5.6 5.0 4.935±0.120 — 4.685±0.183 — 5.1 10.0 9.876±0.044 — 9.410±0.206 — 4.7 胚胎急性毒性试验 Acute toxicity test of larvae 0.44 0.442±0.025 — — 0.421±0.036 4.7 0.875 0.875±0.037 — — 0.832±0.021 4.9 1.75 1.780±0.019 — — 1.670±0.031 6.1 3.5 3.476±0.023 — — 3.333±0.016 4.1 7.0 7.120±0.026 — — 6.675±0.027 4.6 14.0 13.90±0.031 — — 13.27±0.031 4.5 窗口暴露试验 Window phase exposure experiment 0.3 0.297±0.017 0.283±0.010 — — 4.7 0.06 0.063±0.007 0.059±0.005 — — 6.3

表 2 试验过程中乙草胺质量浓度监测结果(n=3) Table 2 Measured concentrations of acetochlor during the tests (n=3)

测得乙草胺对斑马鱼成鱼的96 h-LC₅₀值为3.04 mg/L，线性方程为y=3.45x+3.19(r=0.98)，95% 置信区间为2.41～4.36 mg/L。乙草胺对斑马鱼胚胎的120 h-LC₅₀值为5.32 mg/L，线性方程为y=2.92x+2.86(r=0.94)，95% 置信区间为4.49～6.54 mg/L。在整个试验周期内，对照组成鱼未见死亡，对照组幼鱼死亡率不超过5%，证明试验有效。 2.3 乙草胺对斑马鱼幼鱼的慢性毒性

在乙草胺0.3 mg/L(成鱼96 h-LC₅₀值的1/10)质量浓度下暴露5 d后，观察到斑马鱼幼鱼出现明显的躯干弯曲、心包囊水肿等致畸效应(图 1)；而0.06 mg/L(成鱼96 h-LC₅₀值的1/50)质量浓度处理组在试验周期内未观察到显著的致畸现象。

图 1

A正常(normal);B脊索弯曲(notochord deformation);C心包囊水肿(pericardial edema) 图 1 乙草胺对受精后5 d幼鱼的致畸效应 Fig. 1 Malformation images of 5 d larvae of zebrafish after exposure to acetochlor

斑马鱼胚胎受精后3 h起在0.06及0.3 mg/L乙草胺下连续暴露14 d，试验周期内，对照组死亡率最高为12%，处理组死亡率最高为20%，校正死亡率不超过10%。分别于10 和14 d时取整条幼鱼，检测了与下丘脑-垂体-甲状腺轴相关的11个基因crh、tsh、s1c5a5、甲状腺球蛋白(tg)、甲状腺过氧化物酶(tpo)、甲状腺激素转运蛋白(ttr)、trα、trβ、d1、d2和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(ugt1ab)的表达量变化情况，结果见图 2。从中可知，暴露10 d后，乙草胺对上述11个基因的表达均表现出了不同程度的抑制作用，且存在一定的浓度-效应关系。其中，低质量浓度 (0.06 mg/L) 乙草胺处理组斑马鱼幼鱼体内d2、ttr基因的表达量显著下调，分别为对照组的0.60和 0.68倍，其余基因未见明显变化；高浓度 (0.3 mg/L) 乙草胺处理组中，斑马鱼幼鱼体内d1、ttr、d2、tra、crh和ugt1ab基因的表达量均显著下调，分别为对照组的0.14、0.16、0.47、0.74、0.49、0.19倍，tsh、tpo、tg和s1c5a5的表达量也有所下调，分别为对照组的0.57、0.70、0.53和0.64倍，但与对照差异不显著(P＞0.05)，trβ则未见明显变化。暴露14 d后，低浓度组中tsh、s1c5a5、trβ和d2基因的表达量显著下调，分别为对照组的0.53、0.45、0.55和0.60倍，其余基因变化不明显；高浓度组中除d1的表达量显著上调，为对照组的1.38倍外，其余各基因表达量均无显著性变化。

图 2

a:d1; b: d2; c: trα; d: trβ; e: tsh; f: crh; g: ttr; h: tpo; i: s1c5a5; j: ugt1ab; k: tg；*P<0.05；**P<0.01。 图 2 于乙草胺中暴露不同时间对斑马鱼幼鱼甲状腺相关基因表达量的影响 Fig. 2 Effects of acetochlor on the expression of thyroid related genes in different periods zebrafish larvae

急性毒性试验以致死效应反映乙草胺对斑马鱼的影响。Nagel等^[31]认为，胚胎比成鱼对有害化合物更敏感，更适合作为急性毒性试验的受试动物。但在本研究中，斑马鱼成鱼比胚胎对乙草胺更敏感，这与杨亚洲等^[32]的研究结果相似。在杨亚洲等的试验中，毒死蜱对稀有鮈鲫Gobiocypris rarus胚胎和成鱼的96 h-LC₅₀值分别为7.59和 0.027 2 mg/L，其成鱼比胚胎对毒死蜱更敏感，他们认为这可能与胚胎期卵膜的保护作用有关，卵膜阻止了外来大分子的穿透进入。乙草胺对斑马鱼胚胎和幼鱼的致畸效应(包括游囊关闭、心包囊水肿、卵黄囊水肿、色素沉积、脊索弯曲、尾椎弯曲等)是评价其慢性毒性的重要指标，本研究中观察到斑马鱼幼鱼出现了明显的脊索弯曲和心包囊水肿，这与此前乙草胺可造成非洲爪蟾Xenopus laevis胚胎腹部水肿、面部畸形、脊柱弯曲及尾巴弯曲等多种畸形^[33]的报道相一致。Hermsen等^[34]认为，心包囊水肿与视黄酸代谢有关，其代谢异常往往会引起颅面畸形、鳃弓畸形及心包囊水肿等。脊索则是斑马鱼的重要运动器官，脊索弯曲极大地限制了斑马鱼的运动能力，进而会影响到斑马鱼躲避天敌和取食，降低其对环境的适应能力和生存能力^[35]。

根据常菊花等^[24]的研究，受精后10～21 d是斑马鱼从仔鱼向幼鱼转变的发育敏感窗口期，甲状腺激素在此阶段发挥着重要作用，并且T3的含量在10 d时达到最高值，间接代表脱碘酶活力的T3/T4比值在14 d时达到最高值，此阶段进行有毒物质暴露对于评价该物质对斑马鱼幼鱼甲状腺内分泌的干扰效应具有重要意义。据此，本研究取受精后 3 h 的斑马鱼进行乙草胺暴露处理，于10和14 d时取样检测，以评价乙草胺对斑马鱼早期发育阶段幼鱼体内相关基因表达的影响，深入了解该药物对生物体内分泌的干扰作用。

在受精后3 h～10 d 窗口期暴露试验中，0.3和 0.06 mg/L 的乙草胺对除 tpo、trβ 以外的其他甲状腺相关基因的表达均具有不同程度的抑制作用，且0.3 mg/L 暴露组的抑制效果更为显著，这与Li等^[36]关于乙草胺暴露使稀有鮈鲫幼鱼和雌性成鱼脑部 d1、d2、nis等基因的表达量显著下调的报道一致。 这些甲状腺相关基因的表达受到抑制可能会减弱甲状腺激素的合成和分泌，从而抑制幼鱼的发育。例如：crh 和 tsh 表达量下调可能会减弱下丘脑和垂体对甲状腺组织的刺激作用，使甲状腺激素的合成及分泌减少；而s1c5a5和 tg 表达量下调可能会抑制甲状腺中碘的恢复和摄取，从而影响 T4 的合成；d2 是催化 T4 脱碘生成高活性 T3 的关键性酶。有研究表明，敲除 d2 基因后，斑马鱼幼鱼发育将严重滞后^[27]，d1在促进T3生成过程中发挥着重要作用^[37]，d1和d2 表达量同时下调，则可能会使 T3 的合成受到严重抑制。甲状腺激素主要通过与 Ttr 蛋白结合而被转运到靶标部位，Yu等^[27]发现，ttr 表达量下调的同时，甲状腺激素浓度也相应降低。本研究中tra 和ugt1ab基因表达量的下调，可能是因为甲状腺激素合成受到抑制从而使得其与受体的结合和清除作用减弱所致。

在受精后3 h~14 d窗口期暴露试验中，0.06 mg/L 的乙草胺对 tsh、s1c5a5、trβ 和 d2 等基因的表达均有抑制作用，这可能会减少甲状腺滤泡细胞对碘的摄取，抑制 T4 向 T3 的转化以及 T3 和受体的结合；而0.3 mg/L 暴露组对这部分基因的表达却没有显著影响。此前Helbing等^[23]及Li等^[36]的研究发现，低浓度的乙草胺暴露可使牛蛙、稀有鮈鲫胚胎的trα 基因表达量显著上升，高浓度乙草胺暴露则使trα基因表达量显著下降。由此推测，甲状腺相关基因的表达可能与乙草胺的暴露浓度相关，同时也可能是由于随着暴露时间的延长和鱼体的进一步发育，斑马鱼体内的自我调控机制发挥了一定的作用，从而改变了药物对机体的初始影响。

综上所述,乙草胺对斑马鱼的急性毒性为中等毒,且成鱼比胚胎更为敏感;0.3 mg/L乙草胺暴露可引起幼鱼心包囊水肿和尾椎弯曲等致畸现象。受精后3 h的斑马鱼脴胎分别于0.3和0.06 mg/L乙草胺中暴露10 d和14 d,均能不同程度地抑制斑马鱼甲状腺相关基因的表达,对斑马鱼幼鱼可能具有一定的甲状腺内分泌干扰作用。

此前的报道中，松花江河岸土壤、淮河底泥中乙草胺含量均高于0.06 mg/L^{[12, 13]}，且水环境中的乙草胺含量有日益增加的趋势^{[10, 11]}，因此对水生生物可能具有潜在的威胁。