由致病疫霉Phytophthora infestans引起的马铃薯晚疫病是马铃薯生产中最具毁灭性的病害，据2008年的统计，世界范围内每年由马铃薯晚疫病造成的直接经济损失高达67亿美元^[1]。自1993年以来，中国已成为世界领先的马铃薯生产国^[2]，2011年的数据显示，我国马铃薯的种植面积和产量已分别占到全球的26.3%和22.2%^[3]。尽管致病疫霉存在自育型，但仍被认为是一种异宗配合菌，通过A1和A2两种不同的交配型进行有性生殖^{[4, 5]}。1956年，Niederhauser首次报道在墨西哥中部发现了A2交配型的存在^[6]。在1980年之前，A2交配型一直被认为仅存在于墨西哥中部，其他地区仅有A1型^[7]。但近年来随着A2交配型在世界各地的出现，致病疫霉进行有性生殖的机会增加，生理小种变异加速，致使马铃薯晚疫病有逐年加重的趋势^[8]。

对于马铃薯晚疫病的防治，目前主要采用抗病品种和化学防治等方法。嘧菌酯(Scheme 1)是一种甲氧基丙烯酸酯类(QoIs)线粒体呼吸抑制剂，其通过阻断细胞色素bc1复合物中Qo位点(线粒体内膜外壁位点)的电子传递，阻止ATP的产生和正常新陈代谢而发挥杀菌活性^[9]。该杀菌剂具内吸治疗作用，对非靶标生物与环境的相容性好^[10]，已被广泛用于防治由卵菌、子囊菌和担子菌引起的多种重要作物病害。研究表明，大部分病原菌对嘧菌酯均较易产生抗性，如葡萄白粉病菌和黄瓜白粉病菌在使用嘧菌酯约两年后即已检测到抗性菌株^{[11, 12]}。因此，研究病原菌对嘧菌酯的敏感性，是监测田间群体是否产生抗性，经济、有效利用该杀菌剂的先决条件。

Scheme 1

Scheme 1

生物体内一般存在旁路氧化途径，当正常的电子传递途径被嘧菌酯等QoIs杀菌剂抑制后，病原菌可通过旁路氧化途径获取能量，从而影响对QoIs杀菌剂有效性的检测。目前关于旁路氧化酶(AOX)在QoIs杀菌剂对病害防治中的作用存在两种观点：其中一种观点认为，AOX在病原菌侵染寄主植株后并不被启动，而只在离体条件下才起作用；另一种观点则认为，AOX系统在病原菌侵染寄主植株后会被启动，但是寄主的次生代谢物质(如黄酮类物质等)会抑制AOX的活性^[13]。水杨肟酸(salicylhydro-xamic acid，SHAM)是旁路氧化途径抑制剂，因此，在离体条件下测定病原菌对QoIs杀菌剂的敏感性时，研究者通常会通过添加单独使用时对病原菌生长无影响或者抑制率较小浓度的水杨肟酸，以消除旁路氧化途径在病原菌对QoIs杀菌剂敏感性测定中的影响。如核盘菌Sclerotinia sclerotiorum对嘧菌酯的EC₅₀值为 0.35 μg/mL，添加50 μg/mL的水杨肟酸后，其EC₅₀值为 0.06 μg/mL^[14]；玉米灰斑病菌Cercospora zeae-maydis对嘧菌酯的EC₅₀值为0.045 μg/mL，添加 60 μg/mL 的水杨肟酸后，其EC₅₀值为0.015 μg/mL^[15]；鹰嘴豆褐斑病菌Ascochyta rabiei对嘧菌酯的EC₅₀值为0.04 μg/mL，添加100 μg/mL 水杨肟酸后的EC₅₀值为0.02 μg/mL^[16]。

但不同病原菌对水杨肟酸的敏感性表现并不一致。例如在柑橘球座菌Guignardia citricarpa^[17]和恶疫霉Phytophthora cactorum^[18]中，是否添加水杨肟酸并不影响其对QoIs杀菌剂的敏感性；另外，有些病原菌如山核桃疮痂病菌Fusicladium effusum^[19]，水杨肟酸本身对其就具有很强的抑制作用；在这两种情况下，作者均建议在离体测定QoIs杀菌剂的敏感性时不添加水杨肟酸。然而，关于水杨肟酸对致病疫霉对嘧菌酯的敏感性影响如何，目前尚不清楚。因此，本研究拟选用不同交配型的致病疫霉，测定其对水杨肟酸的敏感性，筛选对致病疫霉生长抑制率约为10%的水杨肟酸浓度，并检测在该浓度下水杨肟酸是否会影响致病疫霉对嘧菌酯的敏感性，旨在为离体检测致病疫霉对嘧菌酯的敏感性时合理使用水杨肟酸提供理论依据。 1 试验材料 1.1 药剂

99.4%嘧菌酯(azoxystrobin)标准品，购于先正达公司(中国)，用丙酮配制成1×10⁵ μg/mL的母液；99%水杨肟酸(SHAM)，由美国SIGMA-ALDRICH公司生产，用乙醇配制成1×10⁵ μg/mL的母液；于4 ℃冰箱保存，备用。 1.2 供试菌株

3株A1和3株自育型致病疫霉Phytophthora infestans，寄主均为马铃薯。A1菌株于2013年采自山西省五寨县，根据省份首写字母依次编号命名，从中选取SX-25、SX-58和SX-135 3株菌株供试；自育型菌株于2013年采自云南省会泽县，命名方式相同，从中选取YN-6、YN-7及YN-9 3株为自育型供试菌株。 1.3 培养基

黑麦培养基(RA)制作借鉴Caten等^[20]的方法：取50 g黑麦于烧杯中，用自来水冲洗干净，加入适量去离子水，室温下浸泡15～20 h，充分研磨后于65 ℃水浴2 h，过滤去渣，于滤液中加入12 g琼脂粉，用去离子水定容至1 L，煮沸，待琼脂充分溶解后，加入预先配制好的胭脂红溶液，使培养基中胭脂红终浓度为0.5 μg/mL，分装，灭菌。

水琼脂培养基(WA)：琼脂粉10.8 g，加去离子水定容至900 mL，灭菌。 1.4 主要试剂及仪器

100%胭脂红(上海染料研究所有限公司)；三目生物显微镜；血球计数板；计数器。 2 试验方法 2.1 水杨肟酸对致病疫霉菌丝生长的影响测定

采用菌丝生长速率法 ^[21]。用乙醇将水杨肟酸母液稀释成5×10⁴、2×10⁴、1×10⁴、5×10³、1×10³及1×10² μg/mL系列质量浓度。分别取上述浓度的水杨肟酸200 μL，加入至200 mL已融化并冷却至50 ℃的黑麦培养基中，充分混匀后倒入已灭菌的培养皿(直径9 cm)中制得含药平板，水杨肟酸的最终质量浓度分别为0.1、1、5、10、20及50 μg/mL；以含等量乙醇的平板为对照。在预先活化、直径约6 cm的菌落边缘打取直径5 mm的菌饼，将菌丝面朝下接种于平板中心。每处理重复3次，于19 ℃黑暗条件下培养8 d，采用十字交叉法测量菌落直径，根据公式(1)计算水杨肟酸对致病疫霉菌丝生长的抑制率。

通过上述试验选择对致病疫霉正常生长影响较小(抑制率<10%)的水杨肟酸浓度(10 μg/mL)，并以其常用浓度(50 μg/mL)为参照，采用菌丝生长速率法(操作同2.1节)，分别测定0.01、0.05、0.1、1和5 μg/mL的嘧菌酯及其中分别添加10或50 μg/mL水杨肟酸后对致病疫霉菌丝生长的抑制作用，分别以仅添加等量丙酮、10或50 μg/mL水杨肟酸的黑麦培养基为对照，于19 ℃、黑暗条件下培养8 d后，测定添加水杨肟酸对致病疫霉菌丝生长阶段对嘧菌酯敏感性的影响。每处理重复3次。以抑制率几率值为纵坐标(Y)，药剂浓度对数为横坐标(x)，求出毒力回归方程Y=bx + a和相关系数(r)，计算各处理的抑制中浓度(EC₅₀)^[22]。 2.2.2 孢子囊产生阶段的影响测定

试验设计同2.2.1节。将供试菌株分别接种于不同处理的黑麦培养基上，于19 ℃、黑暗条件下培养10 d，待对照菌落长至直径约6 cm时，置于12 h光照/12 h黑暗条件下再培养24 h，以诱导产生孢子囊。从培养基中心接菌处向外依次辐射状打取一定数量直径5 mm的菌饼，置于加有10 mL无菌水的离心管中，并加入5～8粒预先灭菌的玻璃珠，振荡2 min，以促进孢子囊的释放。每处理重复3次，采用血球计数板计算每平方厘米的孢子囊数。 2.2.3 孢子囊萌发阶段的影响测定

将2.2.2节中空白处理的孢子囊悬浮液分别涂布于加药(同2.2.1节)和不加药水琼脂培养基上，19 ℃、黑暗培养12 h后，于10×10倍显微镜下检测孢子囊萌发数，每处理重复3次，统计各处理每50个孢子囊中萌发的孢子囊数量，计算对孢子囊萌发的EC₅₀值。 2.2.4 游动孢子释放阶段的影响测定

借鉴朱书生等^[23]的方法，取空白对照平板上生长的待测菌株，用无菌水配制成1×10⁵个/mL的孢子悬浮液和系列浓度药液：嘧菌酯质量浓度分别为0.02、0.1、0.2、2和10 μg/mL，水杨肟酸质量浓度为20和100 μg/mL。分别取20 μL孢子悬浮液和药液，同时滴加到凹玻片上，以等量无菌水为对照，充分混匀，使嘧菌酯终浓度分别为0.01、0.5、0.1、1和5 μg/mL，水杨肟酸终浓度为10和50 μg/mL。20 ℃室温条件下放置30～60 min后，于10×10倍显微镜下观察空孢子囊的数量。每处理重复3次，每重复检测50个孢子囊，计算对游动孢子释放的抑制率。 2.2.5 休止孢萌发阶段的影响测定

试验处理同2.2.4节。20 ℃室温条件下放置30～60 min后，于10×10倍显微镜下检查休止孢的萌发数。每处理重复3次，每重复检测50个休止孢，计算对休止孢萌发的抑制率。 3 结果与分析 3.1 水杨肟酸对致病疫霉菌丝生长的影响

结果(图 1)表明：低浓度(<5 μg/mL)的水杨肟酸对致病疫霉菌丝生长有一定的促进作用，5 μg/mL 水杨肟酸对菌丝生长的抑制率为-4.8%；中等浓度(5和10 μg/mL)时则对菌丝生长无显著影响，对菌丝生长的抑制率在-2.1%～13.6%之间，且不同病原菌间差异也不显著；在高浓度下，随着水杨肟酸浓度的继续增加，其对病原菌菌丝生长的抑制作用逐渐增强，当水杨肟酸质量浓度为 100 μg/mL 时，其对菌丝生长的抑制率达90%以上。

图 1

注：图中虚线表示6株致病疫霉菌株在不同浓度下的抑制率，实线表示其每个浓度的平均抑制率。 Note:Dotted line shows the inhibition rate of each strains,soid line shows the average inhibition rate of 6 P.infestans strains under different concentrations of salicylhydroxamic acid. 图 1 水杨肟酸对致病疫霉菌丝生长的抑制作用 Fig. 1 Effect of salicylhydroxamic acid on mycelium growth of P.infestans strains

结果(图 2)表明：嘧菌酯单独处理以及嘧菌酯中添加10或50 μg/mL的水杨肟酸后，对致病疫霉菌丝生长均有一定的抑制作用，其平均EC₅₀值分别为(0.10±0.03)、(0.08±0.03)和(0.07±0.03)μg/mL。添加及未添加水杨肟酸的处理间无显著性差异，表明供试浓度的水杨肟酸不会影响嘧菌酯对致病疫霉菌丝生长阶段EC₅₀值的测定。

图 2

图 2 水杨肟酸对嘧菌酯抑制致病疫霉菌丝生长的影响 Fig. 2 Effect of salicylhydroxamic acid on the inhibition of azoxystrobin to P.infestans

结果(图 3)表明：与嘧菌酯单独处理相比，嘧菌酯中添加10 μg/mL 水杨肟酸后对孢子囊产量总体趋势并无显著影响；但嘧菌酯中添加50 μg/mL的水杨肟酸可显著提高对孢子囊产量的抑制作用。当嘧菌酯质量浓度 ≥ 0.1 μg/mL时，其单独处理和添加10 μg/mL 水杨肟酸后的处理对孢子囊产量均有促进作用；但添加50 μg/mL的水杨肟酸后，不论嘧菌酯浓度多高，对孢子囊产量均表现为抑制作用。当嘧菌酯质量浓度为1 μg/mL时，嘧菌酯单独处理的抑制率介于其中添加10和50 μg/mL水杨肟酸的处理之间，且各处理组间均存在显著差异。

图 3

图 3 水杨肟酸对嘧菌酯抑制致病疫霉孢子囊产生的影响 Fig. 3 Effect of salicylhydroxamic acid on the sensitivity of P.infestans sporangium production to azoxystrobin

图 4

图 4 水杨肟酸对嘧菌酯抑制致病疫霉孢子囊萌发的影响 Fig. 4 Effect of salicylhydroxamic acid on the sensitivity of sporangium germination of P.infestanso to azoxystrobin

结果(图 4)表明：嘧菌酯单独处理及其中分别添加10或50 μg/mL水杨肟酸后，对病原菌孢子囊萌发的平均EC₅₀值分别为(0.67±0.43)、(0.65±0.23)和(0.16±0.07)μg/mL，表明嘧菌酯单独处理与添加10 μg/mL水杨肟酸后的处理对孢子囊萌发的抑制作用无显著差异，但与添加50 μg/mL水杨肟酸的处理间差异显著，说明水杨肟酸对嘧菌酯抑制致病疫霉孢子囊萌发的影响在不同菌株间表现不一致。

表 1(Table 1)

表 1 水杨肟酸对嘧菌酯处理下A1交配型和自育型致病疫霉不同生长阶段的影响 Table 1 Effect of salicylhydroxamic acid on different developmental stage of A1 mating type and self-fertile of P.infestans 交配型 Mating type 嘧菌酯中添加 水杨肟酸的 质量浓度 Conc.of SHAM added to azoxystrobin/(μg/mL) EC50/(μg/mL) 嘧菌酯质量浓度为5 μg/mL时的抑制率 Inhibition rate of azoxystrobin at 5 μg/mL /% 菌丝生长 Mycelium growth 孢子囊萌发 Sporangium germination 孢子囊产量 Sporangium production 游动孢子释放 Zoospore release rate 休止孢萌发 Cystospore germination rate A1 0 0.09±0.02 ab 0.80±0.59 a -155.1±61.9 b 53.5±0.6 c 65.8±1.5 b 10 0.06±0.02 ab 0.77±0.05 a -199.8±83.5 b 75.9±6.1 abc 73.7±6.4 ab 50 0.04±0 b 0.12±0.04 b 18.6±28.8 a 91.1±7.8 a 83.3±16.7 a 自育Self-fertile 0 0.10±0.04 a 0.54±0.27 ab -202.0±82.9 b 62.3±8.9 bc 66.0±3.9 b 10 0.08±0.03 ab 0.54±0.31 ab -187.3±56.4 b 69.3±16.7 abc 82.9±6.9 a 50 0.09±0.02 ab 0.21±0.08 b 11.3±12.3 a 77.8±25.5 ab 76.9±11.2 ab 注：同列数据后不同字母表示在0.05水平差异显著。 Note:Different letters in the same column show a significant difference at P=0.05.

表 1 水杨肟酸对嘧菌酯处理下A1交配型和自育型致病疫霉不同生长阶段的影响 Table 1 Effect of salicylhydroxamic acid on different developmental stage of A1 mating type and self-fertile of P.infestans

结果(图 5)表明：嘧菌酯中添加10 μg/mL水杨肟酸时，其对致病疫霉游动孢子释放及休止孢萌发的影响与嘧菌酯单独处理相比均无显著差异；但添加50 μg/mL的水杨肟酸后，其对不同浓度嘧菌酯处理的影响并不一致。针对游动孢子释放而言，低浓度(≤0.05 μg/mL)和高浓度(≥5 μg/mL)嘧菌酯中添加50 μg/mL水杨肟酸后，其抑制作用与嘧菌酯单独处理时无显著差异，但在中浓度(0.05～5 μg/mL)嘧菌酯中添加50 μg/mL水杨肟酸后，其抑制率却显著高于嘧菌酯单独处理；对休止孢萌发而言，在≤0.1 μg/mL的嘧菌酯中添加50 μg/mL水杨肟酸后，其抑制率显著高于嘧菌酯单独处理，但在高浓度(≥5 μg/mL)嘧菌酯中添加50 μg/mL水杨肟酸时，其抑制作用却与嘧菌酯单独处理无显著差异。

图 5

图 5 水杨肟酸对嘧菌酯抑制致病疫霉游动孢子释放(A)和休止孢萌发(B)的影响 Fig. 5 Effect of salicylhydroxamic acid on the zoospore release(A) and resting sporegermination(B) of P.infestans to zoxystrobin

结果(表 1)表明：嘧菌酯单独处理及其中添加10 μg/mL水杨肟酸的处理，对A1交配型菌株的菌丝生长、孢子囊萌发、孢子囊产量、游动孢子释放及休止孢萌发各生长阶段的影响均无显著差异；对自育型菌株的表现与A1交配型一致。添加50 μg/mL 水杨肟酸虽然不影响嘧菌酯对两种交配型菌株菌丝生长及对自育型菌株游动孢子释放的抑制作用，但均显著提高了嘧菌酯对两种交配型菌株孢子囊萌发、孢子囊产量、休止孢萌发及自育型菌株游动孢子释放的抑制作用。 4 结论与讨论

水杨肟酸是旁路呼吸氧化酶的抑制剂，添加水杨肟酸可以提高病原菌对嘧菌酯的敏感性，已有研究中通常选择添加50或100 μg/mL的水杨肟酸^{[24, 25]}。然而，本研究结果表明，尽管不同致病疫霉菌株对水杨肟酸的敏感性表现略有差异，但高浓度(50 μg/mL)水杨肟酸对致病疫霉菌丝生长的抑制效果非常明显，抑制率大于70%，因此，在离体条件下测定致病疫霉对嘧菌酯的敏感性时，不建议添加高浓度(50或100 μg/mL)的水杨肟酸。

除对菌丝生长和孢子囊萌发的抑制作用外，本研究还测定了嘧菌酯、水杨肟酸单独处理及嘧菌酯中添加水杨肟酸的处理对致病疫霉不同生长阶段(孢子囊产量、游动孢子释放及休止孢萌发)的影响。与抑制菌丝生长的结果类似，10 μg/mL的水杨肟酸单独处理对致病疫霉孢子囊产量、游动孢子释放及休止孢萌发总体趋势均表现为无显著影响，但在高浓度嘧菌酯中添加50 μg/mL的水杨肟酸则可显著抑制游动孢子释放和休止孢萌发，并可抑制孢子囊的产量，这可能与高浓度水杨肟酸本身对致病疫霉的毒性较大有关。另外，与对菌丝生长的EC₅₀值结果一致，无论是对A1交配型还是自育型菌株，添加10 μg/mL的水杨肟酸对嘧菌酯抑制致病疫霉孢子囊产量、游动孢子释放及休止孢萌发均无显著影响。在试验所测试的所有性状中，无论是嘧菌酯单独处理还是嘧菌酯中添加水杨肟酸的处理，致病疫霉两种交配型的敏感性均无显著差异，表明致病疫霉不同交配型对嘧菌酯的敏感性差异不显著。由于本研究只分别测试了3株菌株，因此在大群体中是否不同交配型致病疫霉对嘧菌酯的敏感性表现不同，还有待进一步研究。

在检测病原菌对QoIs药剂的敏感性时，研究者通常会选择添加不影响病原菌正常生长浓度的水杨肟酸。本研究结果表明，不影响致病疫霉菌丝正常生长(抑制率<10%)的水杨肟酸质量浓度为10 μg/mL，进一步的研究结果表明，是否添加10 μg/mL的水杨肟酸并不影响嘧菌酯对致病疫霉菌丝生长或孢子囊萌发的EC₅₀值。同时，未添加水杨肟酸时嘧菌酯对致病疫霉菌丝生长的EC₅₀值小于0.10 μg/mL，这与Rekanovi 等^[8]的测定结果一致。因此，笔者认为，在离体条件下测定嘧菌酯对致病疫霉的EC₅₀值时，可以不添加水杨肟酸。

尽管我国目前尚无致病疫霉对嘧菌酯抗药性的相关报道，但由于致病疫霉具有高度变异性的特点，因此在实际生产中应注意其在田间对嘧菌酯的抗性监测，以便更有效地控制马铃薯晚疫病的发生和蔓延。