2015, Vol. 17
2. 吉林省林业调查规划院, 长春 130022
, Li Pengju2, Zhu Xuwei1, Zhang Puyu1, Zhang Shuang1, Jiang Daqing1, Lou Junyi1, Lin Haiping1
2. Forest Inventory and Planning Institute of Jilin Province, Changchun 130022, China
番茄灰霉病是由灰葡萄孢Botrytis cinerea引起的主要发生在茄科植物上的一种病害，近10年来已经成为保护地危害最大的病害，给农业生产造成严重的经济损失。目前主要采用多菌灵、腐霉利、霜霉威等化学农药防治番茄灰霉病，造成了严重的环境污染和抗药性，生物农药的使用已成为必然的趋势[1,2]。
光活化农药(photoactivated pesticides)是近年来发展起来的一种以光动力作用为机理的新型、高效和低毒生物农药[3]。竹红菌甲素(Hypocrellin A,HA)是一种具有光动力活性的苝醌类化合物，是竹黄菌Shiraia bambuscola和竹红菌Hypocrella bambusae的主要次生代谢成分[4]。作为一种光敏剂，HA具有明显的光动力作用，具有开发为光活化农药的潜力。目前HA在医学上的研究较多，其对皮肤疾病[5,6,7,8,9]、恶性肿瘤[10,11,12]和艾滋病[13,14,15,16]等均有较好的治疗效果，在林业病虫害防治方面的研究也有报道[17,18,19,]。
本实验室前期研究发现，50 mg/L的HA在光照条件下对番茄灰霉病菌具有明显的抑菌效果[20]，为了进一步探索HA对番茄灰霉病菌的作用机理，本研究从病菌菌丝的电导率、蛋白质和核酸等大分子外渗以及细胞结构变化等方面进行研究，以期为HA开发成绿色高效生物农药提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 供试菌种番茄灰霉病菌Botrytis cinerea来自浙江农林大学生物农药高效制备技术国家地方联合工程实验室；竹黄菌Shiraia bambusicola子座采自浙江省临安市青山湖畔短穗竹林内，经组织分离获得竹黄菌纯菌种。
1.2 主要试剂竹红菌甲素(HA)由本实验室制备；丙酮、戊二醛、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、锇酸、无水乙醇、乙酸异戊酯等试剂均为国产分析纯。
1.3 试验方法 1.3.1 竹红菌甲素(HA)母液制备竹黄菌的发酵与HA的提取参照黄小波方法[21]进行。所得HA浸膏用丙酮溶解配制成500 mg/L的HA母液，经过滤除菌，避光保存，备用。
1.3.2 HA对番茄灰霉病菌抑菌率测定取HA母液，用无菌水稀释，配制成系列质量浓度为25、50、100、200和400 mg/L的HA溶液(含10%丙酮的HA水溶液)。取1 mL不同浓度的HA溶液分别加到含有9 mL灭菌PDA的平板中，混合均匀，制成HA质量浓度分别为 2.5、5、10、20和40 mg/L的平板，作为处理组；以10%丙酮水溶液代替HA溶液，作为对照组。将处理组和对照组均置于超净工作台中吹0.5 h，以挥发丙酮。
采用菌丝生长速率法[22,23]测定抑菌率。将番茄灰霉病菌接种于 PDA 平板上，于26 ℃下培养 5 d，取生长旺盛、同一圆周上直径为4 mm的番茄灰霉病菌菌饼，在处理组与对照组每个平板中心各接入1块，分别置于黑暗条件和光照条件(12 000 lx)下，于26 ℃下恒温培养5 d，用十字交叉法测量菌落总直径，重复3次。根据公式(1)和(2)计算抑菌率，根据抑菌率计算EC50。
| 菌落 直径/mm=菌落总直径-4 | (1) |
| 抑菌 率/%=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100 | (2) |
真菌细胞质由细胞膜包围着，各种不良外界因素对菌体的影响往往首先作用于细胞膜，若细胞膜受到损伤，会使细胞膜通透性增大，表现为电导率增大，随之出现细胞内核酸、蛋白质等大分子物质的泄漏。本论文通过电导率法[24,25, 26]测定细胞膜通透性，紫外分光光度法[24, 27]测定核酸、蛋白质泄漏程度，作为HA对番茄灰霉病菌细胞膜影响的指示指标。
1.3.3.1 HA对番茄灰霉病菌相对电导率影响的测定按1.3.2节设置处理组和对照组。将番茄灰霉病菌接种于 PDA 平板上，于26 ℃下培养 5 d，取生长旺盛、同一圆周上直径为4 mm的番茄灰霉病菌菌饼接种于 PD液体培养基中，于120 r/min下振荡培养 5 d 后取出菌丝，用去离子水反复冲洗3次，以去除菌丝体表面培养液，然后抽滤以去除干菌丝体表面水分。取抽滤后的菌丝3 g，分别加到20 mL处理组和对照组溶液中，分别置于26 ℃黑暗和光照条件(12 000 lx)下，分别于处理0、1、3、6、12、24和48 h后测定电导率，重复3次。根据公式(3)计算相对电导率。
| 相对 电导率/(μs/cm)=(J-J0)-(JCK-JCK0) | (3) |
式中：J为处理组电导率；J0为处理组初始电导率；JCK为对照组电导率；JCK0为对照组初始电导率。
1.3.3.2 番茄灰霉病菌核酸与蛋白质相对泄露度测定参照1.3.3.1节方法，处理组与对照组溶液在光照与黑暗条件下处理6 h后，取1.5 mL于6 000 r/min 下离心5 min，分别测定上清液在260和280 nm处的吸光度。在260与280 nm波长处，处理组测得的吸光度分别记为A1和A2，对照组分别记为A3和A4，重复3次。根据公式(4)和(5)计算核酸与蛋白质的相对泄漏度。
| 核酸相对泄漏度=A1-A3 | (4) |
| 蛋白质相对泄漏度=A2-A4 | (5) |
参照1.3.2节的方法，制备含HA质量浓度为EC50值和2倍EC50值的PDA培养基，作为处理组，以10%丙酮代替HA为对照组，无菌水代替HA为空白组。分别在处理组、对照组和空白组PDA平板上接入1块生长旺盛、同一圆周上直径为4 mm的番茄灰霉病菌菌饼，分别置于黑暗和光照(12 000 lx)条件，于26 ℃下恒温培养5 d后，取菌丝边缘正方形小块(扫描电镜样品 1.0 cm×1.0 cm，透射电镜样品 0.5 cm×0.5 cm)，浸于 2.5%的戊二醛溶液中，于4 ℃下固定过夜，分别参照Xie等[28]与陈安良等[29]的方法制备扫描电镜和透射电镜样品，用XL\|30型扫描电镜观察菌丝形态，用JEM-1230型透射电镜观察菌丝内部结构。
2 结果与分析 2.1 HA对番茄灰霉病菌的抑菌率结果(见表 1)表明：在黑暗条件下，HA对番茄灰霉病菌的生长几乎无影响，且不同浓度HA的抑菌率差异不显著；而在光照条件下，除HA浓度为0外，不同浓度HA对番茄灰霉病菌均具有抑菌作用，且随着HA浓度升高抑菌率呈极显著(P＜0.01)增加趋势。说明光照条件下HA产生的光活化作用抑制了番茄灰霉病菌的生长。
|
表 1 不同光照条件下HA对番茄灰霉病菌的抑菌率 Table 1 Inhibition rate of HA against Botrytis cinerea under different light conditions |
应用DPS软件计算得在光照(12 000 lx)条件下HA对番茄灰霉病菌的EC50值为17.16 mg/L。
2.2 HA对番茄灰霉病菌细胞膜通透性的影响 2.2.1 HA对番茄灰霉病菌相对电导率的影响由图 1可见：在12 000 lx光照条件下，番茄灰霉病菌细胞相对电导率随HA作用时间的延长和HA浓度的增加而明显升高，且前6 h变化较为明显。说明在光照条件下HA对番茄灰霉病菌细胞膜产生了一定的破坏作用，随着HA浓度的增加和作用时间的延长，破坏作用逐渐加重。黑暗条件下番茄灰霉病菌细胞相对电导率随时间和HA浓度变化不明显，进一步说明在光照条件下，HA产生了光活化作用，从而对番茄灰霉病菌细胞膜产生了破坏作用。
 | 图 1 光照(1 2000 lx) (A)与黑暗(B)条件下 HA Fig. 1 Effect of HA on the relative conductivity of B. cinerea under light(12 000 lx)(A) and dark(B) condition |
光照(12 000 lx)和黑暗条件下，分别测定经不同浓度HA处理后，番茄灰霉病菌胞外液的OD280与OD260，计算蛋白与核酸相对泄漏度。
由图 2可见：12 000 lx光照条件下，番茄灰霉病菌的蛋白及核酸相对泄漏度均随HA质量浓度的增加而明显升高，说明HA在光照条件下随着HA质量浓度的增加，对番茄灰霉病菌细胞膜的破坏作用逐渐加重；而在黑暗条件下，随HA浓度的升高，番茄灰霉病菌蛋白、核酸泄漏度基本不变。进一步说明HA对番茄灰霉病菌细胞膜的破坏作用是在光照条件下通过光活化作用产生的。
 | 图 2 光照与黑暗条件下HA对番茄灰霉病菌核酸 (A)和蛋白质(B)相对泄漏度的影响 Fig. 2 Effect of HA on leakage of nucleic acid(A) and protein(B) of B. cinerea under light and dark condition |
由图 3和图 4可见：空白组番茄灰霉菌丝在光照和黑暗条件下处理后菌丝形态正常，表面光滑饱满，粗细均匀，生长点明显；对照组菌丝在光照和黑暗条件下处理后菌丝都略有萎缩，可能是少量残留的丙酮对菌丝有轻微的损伤；处理组在17.16和34.32 mg/L的HA作用下，菌丝在黑暗条件下与对照组区别不大，仅见少数菌丝发生轻微粘连，而在光照条件下，经 17.16 mg/L的HA处理后，菌丝出现明显膨大、畸形、粗细不均、粘连等现象，经 34.32 mg/L的HA 处理后，大多数菌丝出现脱水、萎缩、破裂等现象，遭到严重破坏。
 | 1.空白(5 000×)；2.对照(5 000×)；3. 17.16 mg/L HA(5 000×)；4. 34.32 mg/L HA(2 000×)。S. 隔膜；GP. 生长点；SP. 膨大部位；CP. 缢缩部位。1. Blank(5 000×); 2. Control(5 000×); 3. 17.16 mg/L HA(5 000×); 4. 34.32 mg/L HA(2 000×). S. Septa; GP. Growing point; SP. Swollen part; CP. Constriction part. 图 3 12 000 lx光照条件下HA对番茄灰霉病菌丝形态的影响 Fig. 3 Effect of HA on mycelial morphology of B. cinerea under 12 000 lx illumination |
 | 1. 空白(3 000×)；2. 对照(3 000×)；3. HA 17.16 mg/L(3 000×)；4. HA 34.32 mg/L(3 000×)。S. 隔膜；GP.生长点；H. 菌丝。1. Blank(3 000×); 2. Control(3 000×); 3. HA 17.16 mg/L(3 000×); 4. HA 34.32 mg/L(3 000×). S.Septa; GP. Growing point; H. Hypha. 图 4 黑暗条件下HA对番茄灰霉病菌丝形态的影响 Fig. 4 Effect of HA on mycelial morphology of B. cinerea under dark condition |
由图 5和图 6可见，空白组番茄灰霉病菌在黑暗和光照条件下处理后菌丝超微结构正常，细胞器分布均匀，无空腔，细胞核呈规则圆形，线粒体完整，胞内细胞质颜色较深，细胞壁清晰；对照组菌丝在光照和黑暗条件下处理后菌丝超微结构无明显变化；处理组在17.16和34.32 mg/L HA作用下，菌丝超微结构在黑暗条件下与对照组区别不大，34.32 mg/L HA处理后，仅见少数空腔出现。在光照条件下，经17.16 mg/L的HA处理后，细胞质颜色变浅，线粒体增多且形状变得不规则，细胞内出现空腔；经34.32 mg/L HA 处理后，超微结构破坏更为严重，细胞器几乎全部消失，细胞内空腔面积占细胞面积的一半以上。
 | 1.空白(5 000×)；2.对照(5 000×)；3. HA 17.16 mg/L(5 000×)； 4. HA 34.32 mg/L(5 000×)。N. 细胞核； C. 空腔； G. 颗粒蛋白； M. 线粒体；CW. 细胞壁。1.Blank(5 000×); 2. Control(5 000×); 3. HA 17.16 mg/L (5 000×); 4. HA 34.32 mg/L(5 000×). N. Cell nucleus; C. Cavity; G. Granulin; M. Mitochondrion; CW. Cell wall. 图 5 12 000lx光照条件下HA对番茄灰霉病菌丝超微结构的影响 Fig. 5 Effect of HA on mycelial ultrastructure of B.cinerea under 12 000 lx illumination |
 | 1.空白(5 000×)；2.对照(5 000×)；3. HA 17.16 mg/L(5 000×)；4. HA 34.32 mg/L(5 000×)。C. 空腔； M. 线粒体；CW. 细胞壁。1. Blank(5 000×); 2. Control(5 000×); 3. HA 17.16 mg/L (5 000×); 4. HA 34.32 mg/L(5 000×). C. Cavity; M. Mitochondrion; CW. Cell wall. 图 6 黑暗条件下不同浓度HA对番茄灰霉病菌丝超微结构的影响 Fig. 6 Effect of HA on mycelial ultrastructure ofB.cinerea under dark condition |
为研究HA对番茄灰霉病菌的作用，笔者测定了12 000 lx光照与黑暗条件下HA对番茄灰霉病菌的抑菌率、对细胞膜通透性、菌丝形态与超微结构的影响，初步探明了HA对番茄灰霉病菌的作用。结果表明，在光照条件下，HA发生光活化作用，产生大量活性氧，使番茄灰霉病菌菌丝形态与超微结构遭到破坏，损伤了细胞膜，增加了细胞通透性，造成胞内蛋白、核酸等物质的泄漏，从而抑制了菌体生长繁殖。
国际上最早研究光对害虫产生毒性反应始于1928年，美国化学学会分别于1987和1995年介绍了全球光活化农药的研究进展，并发现染料溶液对蚊子幼虫有杀伤作用，植物次生产物 α \|三噻吩( α -terthienyl,简称 α -T) 具有杀线虫作用，且紫外光能显著提高其杀虫活性[30,31]。 然而由于化学农药的快速高效使得这些发现并未受到应有的重视。1972年，美国成立了世界上第一个环境保护署，给光活化农药的研究注入了活力。我国关于光活化农药的研究在80年代后期才开始起步，其中研究较多的是具有很好的光敏杀虫效果的噻吩类植物源光敏剂[32,33,34]。HA是一种广泛应用于医学研究的新型高效光敏剂，但其在番茄灰霉病害防治中的研究尚未见报道。
HA作为一种新型光敏剂，与传统农药相比，具有光活性高、暗毒性低、不易产生抗性等一系列优点[35]。在光照条件下，HA受光和氧的激发，跃迁至激发态再回到基态只需10 ms，同时快速、高效释放大量活性氧，而HA本身作为催化剂不会减少[35,36]。HA作为自然界的天然物质，对人体及家畜无毒副作用，对环境无害，是一种应用前景广阔的光活化绿色农药。
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