草铵膦是德国赫斯特公司创制的有机磷类非传导型灭生性除草剂，其有效成分为phosphinothricin (简称PPT)，化学名称为(RS)-2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸铵^[1]。原药为白色至浅黄色结晶粉末，密度1.4 g/mL(20 ℃)，熔点215 ℃，沸点99.5 ℃，蒸气压<0.1 mPa (25 ℃)，高度稳定，25 ℃可贮存2 年；20 ℃、pH=7 时其在水中的溶解度为 1.37×10³ g/L，20 ℃时在几种常规有机溶剂中的溶解度(g/100 mL) 分别为：丙酮0.016，乙醇0.065，乙酸乙酯0.014，正己烷0.02，甲苯0.014^{[2, 3, 4]}。目前草铵膦已被广泛用于咖啡园、柑橘园、葡萄园等，对双子叶及禾本科杂草防效显著。根据1999年联合国粮农组织及世界卫生组织农药残留联合专家会议(JMPR)报告^[5]，草铵膦的主要代谢产物N-乙酰草铵磷(简称NAG)和 3-(甲基膦基)丙酸 (简称MPP)均为有毒代谢物，存在一定的风险，因此同时对其代谢产物进行检测甚为必要。

目前关于草铵膦的检测方法已有报道：谢建军等^[6]采用液相色谱柱后衍生法测定了双丙胺磷及草铵膦在土壤和柑橘中的残留量；Sabcho等^[7]采用柱前荧光标记液相色谱法，快速测定了水体中草铵膦及草甘膦等农药残留；次素英等^[8]采用液相色谱法测定了草铵膦铵盐的含量；李维宏等^[9]采用液相色谱法测定了草铵膦原药含量；林永辉等^[10]采用柱前衍生化液相色谱-串联质谱法测定了茶叶中草铵膦的残留量。但均未见涉及代谢产物NAG和MPP检测的报道，也未见到有关咖啡基质中草铵膦残留检测的报道。因此，笔者研究建立了采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定咖啡鲜果中草铵膦及其代谢产物残留量的方法，该方法操作简便，且避免了衍生化过程中的不确定因素，结果能满足农药残留检测的要求。

1 材料与方法 1.1 主要仪器、药剂及样品

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；API4000⁺三重四级杆质谱仪(美国AB公司)；IKAT25高速分散匀浆机(上海万捷科技有限公司)；GL-10C型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)等。

草铵膦(glufosinate-ammonium)标准品(纯度97.5%)、N-乙酰草铵磷(NAG)标准品(10 ng/μL)及3-(甲基膦基)丙酸(MPP)标准品(10 ng/μL)，均购自Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers·Bgm。试剂均为色谱纯。

咖啡鲜果：小叶种，采自海南省澄迈县福山镇咖啡基地。 1.2 检测方法 1.2.1 标准溶液配制

标准储备液：分别准确称取草铵膦、NAG和MPP标准品0.01 g于3个100 mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容，配成100 mg/L的标准储备液，于4 ℃ 保存，待用。

混合标准溶液：分别准确移取1.0 mL草铵膦、NAG及MPP的标准储备液于同一个10 mL容量瓶中，用体积比1∶1的甲醇-水溶液定容，得到10 mg/L的混合标准溶液。

试剂标准工作溶液：分别准确移取0.1、0.2、0.5、1和2 mL混合标准溶液于10 mL容量瓶中，用体积比1∶1 的甲醇-水溶液定容，分别得到0.1、0.2、0.5、1和 2 mg/L 的试剂标准工作溶液。

基质匹配标准工作溶液：分别准确移取0.1、0.2、0.5、1和2 mL混合标准溶液于10 mL容量瓶中，用空白咖啡鲜果基质溶液定容，分别得到0.1、0.2、0.5、1和2 mg/L的基质匹配标准工作溶液。 1.2.2 色谱-质谱检测条件

Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱温35 ℃；进样体积2 μL；流动相A：甲醇，流动相B：0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program 时间 Time/min 流速 Rate/(mL/min) φ(流动相) φ(Mobile phase)/% A B 0.4 20 80 2.00 0.4 80 20 2.60 0.4 80 20 2.80 0.4 20 80 5.00 0.4 20 80 注：流动相A，甲醇；流动相B，0.1%甲酸水溶液。 Note: mobile phase A,methanol；mobile phase B,0.1% formic acid.

表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program

采用电喷雾(ESI^-)模式测定，多离子反应监测(MRM)模式扫描，外标法定量。碰撞气CAD 6 psi(41.37 kPa)；气帘气(CUR)20 psi(137.9 kPa)；雾化气(Gas1，Gas2)：50 psi(344.75 kPa)；电离电压(IS)-4 500 V；离子源温度(TEM)600.0 ℃。相关质谱检测参数见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 串联质谱监测模式下待测化合物的检测条件 Table 2 Tandem mass spectrometry conditions 化合物 Compounds 保留时间 Retention time/min 定性及定量 离子对 Quantitative ion pair and qualitative ion pair，m/z 锥孔 电压 DP/V 碰撞 能量 CE/V 草铵膦 glufosinate-ammonium 0.41 180/85 180/95* -68 -23 -23 N-乙酰草铵磷 NAG 0.47 222/63 222/136* -61 -60 -29 3-(甲基膦基)丙酸 MPP 0.43 151/107 151/133* -54 -21 -18 *为定量离子对。*Indicate quantitative ion pair.

表 2 串联质谱监测模式下待测化合物的检测条件 Table 2 Tandem mass spectrometry conditions

将咖啡鲜果样品于组织粉碎机中混匀，称取(5.0±0.2)g样品于50 mL离心管中，加入10.0 mL 0.1 mol/L的氨水，涡旋提取2 min，超声波振荡提取30 min，静置1 h；于4 000 r/min 离心20 min。移取4 mL上清液于圆底烧瓶中，减压浓缩至近干，用V(甲醇)∶ V(水)=1∶1的混合溶液定容至1 mL，待UPLC-MS/MS检测。 1.2.4 方法的线性范围及准确度、精密度

采用基质匹配标准溶液进样分析。按照1.2.2节所述条件，在0.1～2.0 mg/L质量浓度范围内，分别检测草铵膦、NAG和MPP各自的定量离子色谱峰面积(y)与进样质量浓度(x)之间的线性相关性。

准确称取3组不含3种待测化合物的咖啡鲜果空白样品各(5.0±0.2)g，分别添加3种待测化合物的混合标准溶液，添加水平为0.05、0.25和0.5 mg/kg，每个水平重复5次，按照1.2.2节和1.2.3节条件进行样品提取及分析测定，计算添加回收率和相对标准偏差(RSD)。 1.2.5 基质效应测定

采用基质匹配标准溶液拟合曲线方程斜率与试剂标准工作溶液拟合曲线方程斜率之比(ME)来评价基质效应^[11]，其计算公式见式(1)。

ME/%=B/A×100(1)

式中B为基质匹配标准溶液曲线斜率，A为标准工作溶液曲线斜率。

ME值大于100%，说明基质的存在增强了待测物的离子响应强度，为基质增强效应；ME值小于100%，则认为存在基质减弱效应^[12]。 2 结果与讨论 2.1 样品前处理条件优化

由于目标化合物为水溶性，微溶于有机溶剂，因此前处理时先采用去离子水提取，但发现提取率偏低。经过不断优化，最终确定采用0.1 mol/L的氨水，并结合超声提取30 min，结果可满足残留检测要求^[13]。 2.2 液相色谱-质谱条件优化

根据化合物的理化性质，本试验选用BEH HILIC色谱柱进行分离，分别以甲醇-水、甲醇-0.01%氨水和甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相。针对标准品而言，采用甲醇-0.01%氨水可促进化合物的离子化，比采用甲醇-水时灵敏度有明显提高；但在检测基质匹配标准工作溶液时，采用甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相灵敏度明显提高；因此最终确定以甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相。 2.3 方法的线性范围、检出限、定量限、准确度及精密度

在1.2.2节仪器条件下检测，以进样质量浓度为横坐标，所对应的峰面积为纵坐标作图，经最小二乘法拟合得各自的曲线方程(表 3)，在0.1～2.0 mg/L 质量浓度范围内，3种化合物进样质量浓度与峰面积之间具有良好的线性关系，相关系数r均大于0.99。

表 3(Table 3)

表 3 供试3种化合物的线性方程、相关系数、检出限(LOD)及定量限(LOQ) Table 3 The linear equations,correlation coefficient,limit of detection(LOD) and limit of quantification (LOQ) for the tested compounds 化合物 Compounds 线性方程 Linear equations 相关系数 Correlation coefficient,r LOQ/ (mg/kg) LOD/ (mg/kg) 草铵膦 glufosinate- ammonium y=1.76×104 x +3.02×103 0.997 0.05 0.01 N-乙酰草铵磷 NAG y=5.82×104 x +3.73×103 0.998 0.05 0.01 3-(甲基膦基)丙酸 MPP y= 1.08×105 x +7.90×103 0.991 0.05 0.01

表 3 供试3种化合物的线性方程、相关系数、检出限(LOD)及定量限(LOQ) Table 3 The linear equations,correlation coefficient,limit of detection(LOD) and limit of quantification (LOQ) for the tested compounds

添加回收试验结果(表 4)表明：在3个添加水平下，3种化合物在咖啡鲜果中的平均回收率在92%～107%之间，RSD在2.0%～4.9%之间，均满足残留分析要求^[13]。图 1分别为3种化合物的定量离子谱图和标准品、咖啡鲜果空白样品及添加回收样品总离子谱图。

图 1

Fig. 1

图a、b、c依次为草铵膦、NAG和MPP的定量离子谱图;图d、e、f依次为草铵膦、NAG和MPP的标准品、咖啡鲜果空白样品和咖啡鲜果基质添加(0.25 mg/kg)样品的总离子谱图。 Picture a,b,c are daughter ion chromatograms of glufosinate-ammonium,N-acetyl-glufosinate and 3-[hydroxy (methyl) phosphinoyl];picture d,e,f are total ion chromatograms of standard,blank sample,respectively (the concentration is 0.25 mg/kg). 图 1 多反应监测模式下3种化合物的定量离子谱图及标准品、咖啡鲜果空白样品及添加样品总离子谱图 Fig. 1 Daughter and total ion chromatograms of the compounds′ standard,blank and spiked samples under multiple reaction monitoring (MRM) mode

表 4(Table 4)

表 4 咖啡鲜果样品中的添加回收率和相对 标准偏差(n＝5) Table 4 Average recovery and the relative standard deviation (RSD)of the tested compounds(n＝5) 化合物 Compounds 添加水平 Spiked level/ (mg/kg) 平均回收率 Average recovery/ % 相对标准 偏差 RSD/ % 草铵膦 glufosinate-ammonium 0.05 105 3.1 0.25 104 3.3 0.5 98 4.9 N-乙酰草铵磷 NAG 0.05 92 3.9 0.25 104 2.0 0.5 105 3.6 3-(甲基膦基)丙酸 MPP 0.05 106 3.3 0.25 107 3.5 0.5 105 2.6

表 4 咖啡鲜果样品中的添加回收率和相对 标准偏差(n＝5) Table 4 Average recovery and the relative standard deviation (RSD)of the tested compounds(n＝5)

2.4 基质效应

从表 5中可看出，ME值均小于100%，表明存在明显的基质减弱效应。若使用纯溶剂配制的标准曲线进行定量，则测定结果将比实际结果低，易产生误差。因此，为保证定量的准确性，测定时应采用基质匹配标准溶液校正方法对基质效应进行补偿。

表 5(Table 5)

表 5 基质效应 Table 5 Matrix effects 化合物 Compounds 基质 Matrix 线性方程 Linear equations y= 基质效应 Matrix effect, ME/% 草铵膦 glufosinate- amonium 甲醇-水 Methanol-water 5.32×105 x+6.87×103 - 咖啡鲜果 Coffee cherries 1.76×104 x+3.02×103 3.30 N-乙酰 草铵磷 NAG 甲醇-水 Methanol-water 5.10×105 x+7.11×103 - 咖啡鲜果 Coffee cherries 5.82×104 x+3.73×103 11.4 3-(甲基膦 基)丙酸 MPP 甲醇-水 Methanol-water 1.51×106 x+8.44×103 - 咖啡鲜果 Coffee cherries 1.08×105 x+7.90×103 7.15

表 5 基质效应 Table 5 Matrix effects

本研究建立了一种可同时测定咖啡鲜果中草铵膦及其代谢产物残留量的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测方法。样品采用0.1 mol/L的氨水提取，并结合超声振荡提取30 min，离心、浓缩后用V(甲醇)∶ V(水)=1∶1的混合溶液定容，UPLC-MS/MS检测。

该方法优化了样品前处理及UPLC-MS/MS检测条件，不需经过衍生化，避免了衍生化试剂对检测结果的影响，整个检测过程仅需5 min，大大缩短了检测时间。在试验添加水平下，3种化合物在咖啡鲜果中的平均回收率在92%～107%之间，RSD在2.0%～4.9%之间。所建立方法前处理简单，定量准确，能够满足农药残留检测要求^[13]。

根据JMPR报告^[5]，检测草铵膦的残留量应包括母体草铵膦及其代谢产物NAG、MPP三者之和。因此，本研究结果为草铵膦的残留检测提供了一种简单、可靠、准确的方法。