农药学学报  2014, Vol.16 Issue (1): 61-65   PDF    
引用本文
曾俊源, 崔巧利, 刘曙照. 直接竞争酶联免疫吸附分析法测定桃中氰戊菊酯的残留量[J]. 农药学学报,2014,16(1): 61-65  
ZENG Junyuan, CUI Qiaoli, LIU Shuzhao. Determination of fenvalerate residue in peach by direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2014,16(1): 61-65  
直接竞争酶联免疫吸附分析法测定桃中氰戊菊酯的残留量
曾俊源a, 崔巧利b, 刘曙照a    
a. 扬州大学 环境科学与工程学院, 江苏 扬州 225009;
b. 扬州大学 园艺与植物保护学院, 江苏 扬州 225009
收稿日期:2012-2-28;修回日期: 2013-10-16 .
基金项目：国家自然科学基金（21247002，20777064）资助项目.
作者简介：男，曾俊源，硕士研究生
通讯作者：刘曙照，男，教授，博士生导师，研究方向为环境与食品安全分析新原理与新技术，E-mail：szliu@yzu.edu.cn
摘要：采用包被抗体、酶标半抗原直接竞争酶联免疫吸附分析法（ELISA）测定了氰戊菊酯在桃中的残留量。结果表明：在氰戊菊酯多克隆抗体包被浓度为4.0 mg/L、辣根过氧化物酶（HRP）标记氰戊菊酯半抗原稀释1.0×105倍条件下，ELISA法检测氰戊菊酯的线性浓度范围为0.01~10 mg/L，氰戊菊酯对抗体-酶标半抗原反应的抑制中浓度（IC50）为193 μg/L，相对标准偏差（RSD，n=5）为4.5%，IC20为13.5 μg/L。在2、0.2和0.05 mg/kg添加水平下，ELISA法测定桃中氰戊菊酯的回收率分别为81%~89%、85%~98%和85%~106%，RSD（n=5）分别为5.1%、5.6%和7.7%。ELISA法对桃中氰戊菊酯的最低检出浓度为0.014 mg/kg。
关键词： 氰戊菊酯     桃     直接竞争酶联免疫吸附分析     高效液相色谱     残留    
Determination of fenvalerate residue in peach by direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay
ZENG Junyuana, CUI Qiaolib, LIU Shuzhaoa    
a. College of Environmental Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;
b. College of Horticulture and Plant Protection, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
Abstract: The method of antibody immobilized direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was employed to determine fenvalerate residue in peach. The result showed that the linear concentration of ELISA ranged from 0.01 to 10 mg/L, the half maximal inhibitory concentration (IC50) of fenvalerate to antibody hapten-HRP reaction was 193 μg/L with relative standard deviation (RSD, n=5) of 4.5% and the IC20 was 13.5 μg/L. The fenvalerate recoveries from peach determined by ELISA were 81%-89%, 85%-98% and 85%-106% with RSDs (n=5) of 5.1%, 5.6% and 7.7% at the spiked levels of 2 mg/kg, 0.2 mg/kg and 0.05 mg/kg, respectively. The minimum detection concentration of the method was 0.014mg/kg.
Key words: fenvalerate     peach     direct competitive ELISA     high performance liquid chromatography     residue    

氰戊菊酯(fenvalerate)，化学名称α-氰基-3-苯氧基苄基(R,S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸酯，是目前我国应用量最大的拟除虫菊酯类杀虫剂，具有高效低毒、低残留的特点[1]，对鳞翅目、同翅目、直翅目、半翅目害虫有良好的防治效果[2]，但对蜜蜂、鱼虾[3]、家禽等毒性高，有一定的生殖毒性[4]。我国GB 2763—2012中规定，氰戊菊酯在叶菜类、水果类、根块类作物中的最大残留限量(MRL)分别为0.5～3 mg/kg、0.2～1 mg/kg和0.05 mg/kg[5]。

目前氰戊菊酯的残留检测方法主要有气相色谱法(GC)[ 6, 7, 8, 9, 10]、高效液相色谱法(HPLC)[ 11, 12, 13, 14]和薄层层析法(TLC)[15]。由于仪器分析法需要昂贵的仪器、专业化的实验室和专门的技术人才，且样品前处理过程复杂、费用高、费时长，因此难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。薄层层析法则灵敏度和准确度较低，速度慢。而免疫分析具有特异性强、灵敏度高、简便快捷、样品容量大、样品前处理简单、分析成本低等特点，在大量样本和现场样本快速筛选检测中优势明显。Shan等[16]以氰戊菊酯全分子的衍生物为半抗原，建立了氰戊菊酯的间接竞争ELISA法，与常用含间苯氧基苄基结构的拟除虫菊酯间交叉反应比较明显；Wang等[17]建立了氰戊菊酯的免疫亲和层析法，用于样品的前处理；麻文生等[18]采用免疫共振散射光谱分析法测定氰戊菊酯。本研究应用本实验室制备的具氰戊菊酯特异性结构的酶标半抗原和对氰戊菊酯具有特异性识别能力的多克隆抗体[19]，拟建立特异性强、方法更加简便快速的直接竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA)，用于测定桃中的氰戊菊酯残留量，并采用高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UVD)进行验证。

1 材料与方法
1.1 药剂、试剂和仪器

99.2%氰戊菊酯，上海中西药厂、同济大学测试中心、上海测试技术中心联合研制；抗氰戊菊酯多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记氰戊菊酯半抗原、0.02 mol/L不同pH(6.6、6.8)的磷酸盐缓冲液(PB)和封闭液(0.5%明胶水溶液，含0.03%NaN3)，均为本实验室自制；洗涤液为无菌蒸馏水；显色液：0.2 mmol过氧化脲溶于1L柠檬酸-磷酸盐缓冲液(5.2 g柠檬酸、8.4 g磷酸氢二钠溶于蒸馏水并定容至1 L)作A液、0.1 g 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶于10 mL二甲基甲酰胺(DMF)作B液，用前取100 μL B液加到10 mL A液中混匀；终止液为2 mol/L硫酸水溶液；甲醇为色谱纯。

Biofuge primo R台式高速冷冻离心机，德国Heraeus公司；Model 680酶标仪，美国BIO-RAD公司；DK-S28型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；JYL-510匀浆机，山东九阳小家电有限公司；移液器(5～50、20～200和100～1 000 μL 单道手动可调，50～300 μL 8道手动可调)，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司；8孔酶标条，江苏海门爱苯德实验器材有限公司；XW-80A漩涡混合器，上海青浦沪西仪器厂；YXQ.SG41.280手提式压力蒸汽灭菌锅，上海华线医用核子仪器有限公司；Waters 2487高效液相色谱仪，美国Waters公司。

1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液的配制

将氰戊菊酯标样10 mg溶于甲醇并定容至100 mL作为储备液，用0.02 mol/L pH 6.8的PBS(含0.1 mol/L氯化钠)将储备液梯度稀释成质量浓度为10、1、0.1、0.01、0.001和0.000 1 mg/L的系列标准溶液。

1.2.2 直接竞争ELISA法最适酶标半抗原-包被抗体工作浓度的筛选

分别用质量浓度为1、2、4和8 mg/L的抗氰戊菊酯多克隆抗体包被酶标板的不同列，酶标半抗原梯度稀释15 000、30 000、60 000和100 000 倍后加入酶标板的不同行，于37 ℃反应1 h，倾去反应液，用无菌蒸馏水洗除游离物，拍干，加入显色液(100 μL/孔)，于37 ℃下避光反应15 min，加入终止液50μL/孔 终止反应，用酶标仪测定OD450值，筛选抗体和酶标半抗原工作浓度。选择标准：抗体和酶标半抗原用量少、酶促显色反应后OD450在1.0左右的实验组合，作为进一步建立直接竞争ELISA法的最适酶标半抗原-包被抗体工作浓度。

1.2.3 直接竞争ELISA法的建立

在上述选定的酶标半抗原和包被抗体最适工作浓度下，进行直接竞争免疫反应，测定不同浓度氰戊菊酯对抗体与酶标半抗原结合反应的抑制率I。具体操作步骤为：用0.02 mol/L pH 6.6的PB将抗体稀释至最适浓度(4 mg/L)包被酶标板，以0.02 mol/L pH 6.6的PB包被酶标板作为空白对照，用封闭液封闭后于4 ℃下保存备用。

取按1.2.1节配制的不同浓度的标准工作溶液，分别与2倍最适浓度(稀释5×104倍)的酶标半抗原溶液等体积混合，加入到包被了抗体并封闭过的酶标板内(100 μL/孔)，于37 ℃下反应1 h，倾去反应液，用无菌蒸馏水洗除游离物，拍干，加入显色液100 μL/孔，于37 ℃下避光反应15 min，加入终止液50 μL/孔终止反应，用酶标仪测定OD450值。计算不同浓度的氰戊菊酯对酶标半抗原与抗体结合反应的抑制率I，计算公式为I/%=[(OD对照-OD氰戊菊酯)/OD对照] ×100，绘制I对氰戊菊酯浓度(ρ)的关系曲线，建立回归方程I =B ρ+ A并进行相关分析，分别计算抑制率为50%和20%时氰戊菊酯的浓度(IC50和IC20)。在实际样品测定时，根据样品的抑制率及回归方程计算样品中氰戊菊酯的含量，以IC20为最低检测浓度。

1.2.4 样品的提取与净化

提取：将桃洗净晾干，切成块状后置匀浆机中粉碎至糊状，称取10 g糊状样品于60 mL离心管中，加入50%甲醇水溶液，定容至20mL，混匀，振荡提取15 min，5 000 r/min离心15 min后取上清液。提取液用0.02 mol/L pH 6.8的PBS稀释2.5倍后用于直接竞争ELISA法测定。另取10 g糊状样品于60 mL离心管中，加V(石油醚)∶V丙酮=1∶1混合溶剂定容至20 mL，混匀，振荡提取15 min，离心后取上清液17.5 mL用无水硫酸钠脱水后浓缩至约1 mL，进一步净化后用于HPLC测定。

净化[6]：依次在250 mm×25 mm(内径)玻璃柱中加入高度为20 mm的无水硫酸钠、5 g弗罗里硅土、20 mm高无水硫酸钠，然后依次用40 mLV(石油醚)∶V(乙醚)=7∶3和40 mL石油醚淋洗柱。将样品提取浓缩液加入柱内，先用5 mL石油醚洗涤，弃去流出液，再用V(石油醚)∶V(乙醚)=7∶3 混合溶剂洗脱，控制流速约5 mL/min，收集流出液60 mL，浓缩至约5 mL后用N2吹干，用色谱纯甲醇溶解定容至2 mL，经0.45 μm滤膜过滤后，待HPLC测定。

1.2.5 HPLC条件

采用250 mm×4.6 mm，5 μm化学键合C18柱；流动相为V(甲醇)∶V(水)=8∶2 混合溶液，流速1 mL/min；检测波长为220 nm；进样体积20 μL；峰面积定量。

1.2.6 标准添加回收率试验

在桃中分别按0.05、0.2和2 mg/kg 3个水平添加氰戊菊酯标准溶液，每个水平重复5次。按1.2.4节方法处理后分别采用直接竞争ELISA法和HPLC法测定，计算添加回收率。

在采用直接竞争ELISA法测定时，将未经净化处理的空白样品提取液用0.02 mol/L pH 6.8的PBS稀释2.5倍后按1.2.1配置系列工作溶液，然后按1.2.3步骤建立ELISA工作曲线，同时测定不同添加水平的样品提取稀释液的抑制率，根据工作曲线计算添加回收率。

2 结果与分析
2.1 直接竞争ELISA法最适工作条件

从图1可以看出，当抗体浓度为4.0 mg/L、酶标半抗原稀释1.0×105倍时，二者的用量最少，最终酶促显色反应的OD450≈1.0，确定为下一步直接竞争ELISA法中包被抗体和酶标半抗原的最适工作浓度。

图1 抗体和酶标半抗原工作浓度筛选结果

Fig.1 The proper concentration of antibody and fenvalerate-Hp-HRP

2.2 氰戊菊酯直接竞争ELISA标准曲线与回归分析

图2 氰戊菊酯直接竞争ELISA标准曲线(n=5)

Fig.2 Standard calibration curve of direct competitive ELISA for fenvalerate (n=5)
以抑制率的平均值为纵坐标(I)，氰戊菊酯的浓度为横坐标(ρ)绘制标准曲线，结果见图2。氰戊菊酯在0.01～10 mg/L范围内与抑制率呈线性关系，回归方程为I=25.97ρ+68.55，相关系数r=0.999 5，抑制中浓度为IC50=193 μg/L，5次重复测定IC50的相对标准偏差(RSD，n=5)为4.5%，IC20=13.5 μg/L，最小检出量为0.68 ng。

2.3 桃中氰戊菊酯测定的直接竞争ELISA工作曲线及回归分析

结果(图3)表明：样品中抗体-酶标半抗原结合的抑制率(I)对氰戊菊酯浓度(ρ)的回归方程为I=23.68ρ+63.99，r=0.997，IC50=256 μg/L，5次重复测定IC50的RSD=9.0%，IC20=13.9 μg/L。桃中氰戊菊酯的最小检出量为0.70 ng，最低检出浓度为0.014 mg/kg。虽然样品基质使IC50有一定程度增大，但工作曲线与标准曲线以及IC20总体上基本一致。

图3 桃中氰戊菊酯直接竞争ELISA工作曲线(n=5)

Fig.3 Working calibration curve of direct competitive ELISA for fenvalerate in peach(n=5)

2.4 桃中氰戊菊酯残留ELISA的添加回收率

结果(见表1)表明：在2、0.2和0.05 mg/kg添加水平下，ELISA法测定的平均回收率分别为83%、92%和96%，符合氰戊菊酯残留检测的要求[5]。

表1 桃中氰戊菊酯标准添加回收试验结果

Table 1 Recovery of fenvalerate from peach

2.5 桃中氰戊菊酯残留的HPLC测定结果

HPLC-UVD测定法对桃中氰戊菊酯的测定结果见图4。

样品按文献[6]的方法进行柱层析净化和过滤，虽然不能完全去除杂质，但可用于HPLC-UVD检测(见图4B和4C)，图4B中未见氰戊菊酯的色谱峰。氰戊菊酯在2mg/kg添加水平下，HPLC-UVD法测定的平均回收率为86%(n=5)。但柱层析净化处理花费时间较多，难以适应大量样品快速检测的需求。

图4 氰戊菊酯HPLC图谱

Fig.4HPLC chromatogram of fenvalerate

3 结论与讨论

成功建立了对氰戊菊酯具特异性的包被抗体直接竞争ELISA法并用于测定桃中的氰戊菊酯残留量。氰戊菊酯的经典检测手段是GC-ECD，具有较高的灵敏度，但需要SPE等繁杂的净化过程。本研究将桃样匀浆后用50%甲醇水溶液提取，离心取上清液，稀释2.5倍后直接采用直接竞争ELISA法检测，前处理十分简便，减少了有机溶剂的使用，且直接竞争ELISA法特异性强、简便快速、可多个样品同时检测、检测费用低，在大量样品高通量快速检测中优势明显。与间接竞争ELISA法相比，直接竞争ELISA法只有一步免疫反应，省去了与二抗反应的步骤，方法更加简便快捷，系统误差小。HPLC-UVD法对氰戊菊酯测定的灵敏度低于GC-ECD、GC-MS和ELISA法，但可用于氰戊菊酯顺反异构体的分离与分析。

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