由土壤病原菌引起的土传病害是当前农业可持续发展的限制因子。土壤病原菌在表达致病因子、侵染作物根系表皮组织之前, 需经历从土体向根际迁移、在根际定殖和增殖以及在根表形成生物膜等重要的根际入侵过程。病原菌这一入侵过程并非畅通无阻, 而是受到根际生态系统中物理、化学和生物因子的多重防御。最近有学者将根际生态系统抵御土壤病原菌入侵的现象和能力定义为根际免疫, 并指出根际免疫形成的核心是形成一个具有特定结构和互作关系的根际菌群^[1]。由于根际菌群构成及其互作关系的复杂性, 大部分微生物难以分离培养, 并且难以在根际原位进行验证性研究, 目前还难以清楚解析根际菌群影响根际免疫的机制。解析免疫型根际菌群中的核心功能微生物组(与特定宿主植物或根际其他微生物关联较为紧密的微生物)、根际菌群互作、菌群-植物互作与根际免疫的关系是实现根际菌群精准调控, 提升根际免疫能力和保障作物健康的前提。

合成菌群(synthetic microbial community)是基于生态学和合成生物学基本理论, 人为地将2个或多个已知分类地位、功能特性等明确的不同微生物, 在特定条件下以确定的比例进行混合, 进而获得效率高、功能强、可控性好、易保存且便于应用的有机群体^[2]。合成菌群的构成可以是从自然环境中分离得到的野生型菌株, 也可以是通过基因改造得到的微生物, 在明确菌群成员互作、菌群与寄主和环境互作以及菌群功能等方面有巨大的优势, 已经在医学^[3]、农业^[4-5]、工业^[6]和环境生态^[7]等领域中广泛研究和应用。本文阐述合成菌群在根际免疫研究中的重要性, 从解析免疫型根际核心微生物组、根际菌群成员互作、根际菌群-植物互作方面总结合成菌群在根际免疫研究中的重要进展, 从群落多样性、互作关系和稳定性角度阐述提升根际免疫的合成菌群的构建原则, 总结合成菌群在根际免疫研究中亟待强化的方向, 以便更好地服务于根际健康提升和农业可持续发展。

自Hiltner提出“根际”这个概念以来, 科研工作者就开始探究根际微生物与作物健康的关系^[8], 阐述根际微生物对抵御土壤病原菌入侵和维持作物健康的重要性和其中的作用机制, 提出一系列基于根际微生物防控土传病害的策略并开发了产品^{[4-5, 9-11]}。总的来说, 根际微生物与土传病害防控的研究经历了3个阶段。由于研究条件和认知的局限, 第1阶段主要聚焦在功能菌的筛选、作用机制和应用效果探究, 并开发了相应的生物制剂^[12-13]。由于植物根际存在大量且复杂的微生物群落, 单一种类的功能菌无法有效在根际定殖和生长, 限制其生防功能的发挥, 因此田间生防效果常常不稳定。为了更加深入地研究根际微生物群落特征, 人们开始把研究对象扩大到整个根际菌群, 阐述其与抑病功能的关系, 即第2个阶段的研究重点。这一阶段的研究方法从DGGE和FPLA等逐步发展到第2代测序技术, 人们才真正打开了根际微生物组的“黑匣子”, 根际微生物组与作物健康之间的研究也逐渐发展^[14-16]。尽管大量研究发现, 根际菌群与作物健康密切相关, 但根际微生物群落构成及其互作关系复杂, 根际菌群影响植物健康机制的相关科学问题仍不清楚。例如, 共发生网络等方法预测的根际抑病核心微生物是否发挥着关键作用?根际菌群成员间的互作关系如何决定群落抵御病原菌入侵的能力?根际菌群如何与植物互作, 进而影响植物免疫和健康?这些问题仍缺乏直接的证据。研究者逐渐意识到简化根际菌群, 建立可控的变量是探明根际菌群与作物健康关系的关键^[5]。因此, 逐渐发展出以生态学理论为指导的第3个阶段的研究, 即结合宏基因组、宏转录组和宏培养组学以及大数据分析、数学模型构建和微流控等技术, 经分析预测、筛选鉴定等流程获得可培养功能微生物, 然后构建合成菌群, 相对精准控制群落多样性、群落构成、互作关系、群落成员特性等群落特征参数, 进而探究微生物群落特征与作物健康的关系。值得注意的是, 尽管合成菌群无法做到完全重现根际菌群构成, 但可以更清晰阐明根际菌群影响作物健康的机制, 科学指导根际菌群调控, 进而控制土传病害的发生, 实现促进作物健康的目标。

根际核心微生物组、根际菌群内部互作和根际菌群与植物互作是根际免疫研究的3个核心科学问题。目前, 国内外学者在利用合成菌群挖掘根际抑病相关核心功能微生物^[17]、揭示根际菌群互作与抵御病原菌入侵关系^[18-21]和探明根际核心菌群与植物免疫关系^[22]等方面中已经取得重要的进展。

大量研究表明根际核心微生物在抵御土传病原菌入侵和维持植物健康中发挥关键作用^[23-24], 并且在土传病害防控实践中, 也常将抑病土部分转移到感病土中, 使后者获得抗病能力, 其本质就是核心微生物发挥了作用^[25]。因此, 识别、探究和应用管理核心微生物可能为提高植物健康提供了新的途径^[26]。近年来, 甜菜立枯病^[25]、番茄青枯病^[15]、香蕉枯萎病^[27]、香草兰枯萎病^[28]等抑病土壤中的核心微生物组被解析出来。但是, 由高通量测序技术分析的结果仅具有相关性, 这些核心微生物是否发挥核心作用仍缺少直接因果关系验证。基于明确分类地位和功能特性的微生物构建合成菌群, 可检验核心微生物对促进植物健康的重要作用。Niu等^[17]构建了由7种生防细菌组成的合成菌群, 发现该合成菌群可明显抑制轮状镰刀霉菌(Fusarium verticillioides)定殖, 有效控制玉米苗枯病的发生, 并且发现在合成菌群中没有Enterobacter cloacae的情况下, Curtobacterium pusillum丰度增加, 而其他物种则在群落中消失, 这表明E.cloacae是这7个物种构成的简化微生物组中的核心微生物。因此, 代表根际微生物组的合成菌群可以为研究核心微生物对其他微生物之间的相互作用、群落组成的动态变化以及对宿主健康的有益功能等提供有力的理论支撑。

作物健康不仅受根际微生物群落构成的影响, 也由群落与病原菌以及群落内部的物种互作关系决定。大量研究利用多种互作网络分析方法解析微生物群落网络特征(如节点数、连接度、模块性、网络直径等)与植物抵御病原菌入侵能力的关系^{[15, 27]}。以土传青枯病为例, Wei等^[15]利用宏基因组分析发现作物初始根际细菌群落结构和互作网络决定后期作物的健康状况, 但网络分析不能直接证明互作关系影响土传青枯菌入侵根际的机制。为阐明其机制, Li等^[18]基于6株不同属的细菌构建合成菌群, 在明确合成菌群成员间互作关系对病原菌入侵的影响后, 发现便利型的根际细菌群落利于土传青枯菌的入侵, 而竞争型的群落则抑制病原青枯菌的入侵。此外, Wei等^[19]和Hu等^[20]以5株劳尔氏属细菌和8株假单胞菌为材料构建合成菌群, 分别从营养竞争和拮抗竞争的角度进一步阐述根际菌群的竞争互作与抵御青枯菌入侵能力间的关系, 发现合成菌群在资源利用上的互补效应和在拮抗物质抑菌中的协同效应, 在合成菌群抑制土传青枯病发生中起关键作用。Durán等^[21]结合宏基因组和宏培养组学, 在分离筛选大量细菌和真菌之后, 通过合成菌群阐明拟南芥根部细菌和丝状真菌之间的跨界竞争互作对作物抵御病原真菌和卵菌有重要影响。总之, 结合网络互作预测和合成菌群互作分析方法能较好阐明根际菌群互作与根际免疫的关系。

根际微生物与植物免疫有密切的相互作用关系^[29]。植物免疫系统不仅能直接参与对根际病原菌的防御^[30], 也能通过模式识别受体(pattern recognition receptors)识别微生物相关分子模式(microbe-associated molecular patterns), 进而影响根际有益微生物的定殖^[31]。根际有益微生物除了直接抑制土壤有害微生物外, 还可以调节植物免疫系统, 提高植物地上部分的防御能力^[32]。由有益微生物引起的诱导系统抗性能激发植物免疫系统加速进入防御状态^[33]。传统的植物-根际有益微生物互作研究主要集中在一些模式有益微生物(如荧光假单胞菌和芽胞杆菌), 对单个根际有益微生物诱导系统抗性已经开展了较为全面的研究^[34-36]。近些年, 学者们开始呼吁关注根际菌群与植物免疫关系的研究^[37-38]。Kwak等^[14]发现番茄青枯病抗病和易感品种的根际菌群差异显著, 并且黄杆菌属可能在抗青枯病中发挥关键作用。尽管他们筛选到1株黄杆菌并证明其具有防御番茄青枯病的能力, 但依然没有回答根际菌群是如何影响植物免疫的。值得指出的是, Lebeis等^[39]首次通过构建由38个不同细菌构成的合成菌群来探究植物免疫对根际菌群装配的影响, 并发现拟南芥水杨酸信号的传导能显著影响拟南芥根际菌群的装配。Castrillo等^[22]研究发现, 在磷饥饿条件下, 一个由35种细菌构成的人工菌群增强了磷酸盐胁迫响应基因PSR、PHR1和PSR转录调节因子的活性, 并且PHR1不仅激活了这些条件下磷酸盐胁迫反应的基因, 而且直接抑制植物免疫基因的表达, 从而明确根际微生物介导的植物调控营养利用和病害防御平衡的分子机制^[22]。这些研究表明根际菌群和植物免疫系统之间的相互作用可能在形成有益的植物-微生物群落共同体(holobiont)和维持植物健康以及微生物群落稳定方面起着关键作用。

在探究微生物群落功能和互作特征的理论时, 可以采用随机组合菌株的方式来构建合成菌群以开展研究。为了实现菌群特定的生态功能, 则需要遵循一定的生态学原理来设计合成菌群, 比如依据生物多样性与生态系统功能模型^[40], 借鉴自然群落中共生体之间的分工合作^[41], 考虑微生物间的相互作用、时空协调和稳定性等^[42], 掌握合成菌群的酶功能、细胞能量需求、与代谢产物交换相关的代谢参数以及与突变、选择、基因漂移相关的遗传进化参数^[43]。笔者主要从群落构成、群落互作关系和群落稳定性3个方面探讨高效抑病的合成菌群设计原则。

菌群结构特征如物种多样性^[44]、关键物种(keystone species)^[45]和群落成员初始比例^[46]影响微生物群落功能。因此, 构建能够提升根际免疫的合成菌群时也需要关注这3个关键特征。一般认为, 多样性高的合成菌群对土传病原菌的抵抗能力较高。首先, 不同物种的生态位或对环境压力的敏感性不同^[47], 多样性高的合成菌群能够在复杂多变的环境中(如土壤或根际)更好地存活和定殖; 其次, 多样性高的群落具有较高的资源利用互补性, 可充分利用环境中的资源, 仅留给病原菌极少未被完全利用的资源, 降低病原菌的生长繁殖能力, 最终降低入侵宿主的可能性^[48]; 最后, 多样性高的合成菌群还会通过协同作用产生更多的抑菌物质, 更好地抑制土传病原菌的生长^{[20, 49]}。需要注意的是, 合成菌群的多样性并非越多越好, 在有限的资源环境条件下, 多样性的增加也会加剧群落内部各个物种之间竞争的风险, 导致群落整体生物量下降以及降低抵抗土传病原菌的能力^[50]。在构建合成菌群的过程中不仅要考虑群落的多样性, 还需考虑构成合成群落中的关键功能物种。合成复杂性较低的菌群往往有利于研究群落成员的作用, 但是随意剔除合成群落的成员可能会导致关键物种缺失, 进而影响群落互作关系以及整体的抑病功能^[17]。当菌群成员明确后, 设计合成菌群还需要考虑成员间初始的复配比例。大量研究表明初始接种比例对群落互作和功能产生重要影响^[46]。由于试验操作的复杂性, 明确初始接种比例对群落互作和功能的影响, 需要将合成菌群多样性控制在较低的水平或者采用计算机模拟。

合成菌群成员间的互作关系对合成菌群的功能发挥具有重要作用。同一营养级微生物之间积极的相互作用可能来自分泌的公共物质^[51]或代谢交叉喂养^[52], 这种互作关系中微生物受益于彼此的存在; 而资源竞争^[19]或直接干扰竞争^[20]可能导致消极的相互作用, 这些积极或消极的互作关系可能以各种方式影响土传病原菌入侵的结果。促进和竞争可能会影响资源的可利用性, 从而影响生物入侵的可能性^[53-54]。高度竞争的合成菌群如果能够有效利用和消耗原本可供入侵生物使用的资源, 则该合成菌群不太容易受到入侵^[55-56]。相反, 相互促进的合成菌群可能通过产生次级代谢物或公共物质来增加资源生态位的数量, 这些物质也可以被入侵生物利用^[57]。需要注意的是, 合成菌群的有毒代谢物可能对合成菌群本身产生负面影响^{[58, 50]}, 如果毒素对土著群落的成员产生很大的负面影响, 那么这种干扰竞争则有望促进入侵。越来越多的研究表明, 竞争型的合成菌群具有更高的稳定性^[59-60], 更能抵抗土传病原菌的入侵^[18]。选择合成菌群成员不仅需要考虑同一营养级物种间的互作(竞争、互利等), 还应考虑多营养级生物间的互作关系, 如捕食和寄生^[61]。另外, 还可以构建代谢互养模型^[62], 利用群感效应调节群体数量^[63], 以及引入第三方调解种间关系形成稳定共存的“剪刀-石头-布”模型^[64]等, 综合运用以上原理设计的合成菌群, 可在一定条件下有效抵抗土传病原菌的入侵。

施用合成菌群到植物根际防治土传病害的过程中会遭遇外界环境变化的扰动、土著微生物的竞争排斥和上一营养级生物的捕食等。为了使合成菌群在根际中长期发挥其功能, 有必要维持其鲁棒性(robustness)和稳定性(stability)。鲁棒性指系统在扰动或不确定的情况下仍能保持它们的特征行为。只有合成菌群具有一定的鲁棒性, 才能在动态变化的环境中稳定发挥其功能。由于长期的演化、群落成员间合理的分工合作, 自然菌群具有很高的鲁棒性, 可以很好地抵御外界环境的干扰。从这些天然菌群中受到启发, 菌群中的成员不是一个个孤立的个体, 而是彼此之间相互依赖的整体, 因此设计具有鲁棒性的抑病合成菌群应先从建立密切的种间交流着手。合成菌群在面对环境温度、pH、养分浓度^[65-66]等变化后, 其菌群结构、互作关系以及代谢网络的变化对病原菌入侵的抵抗力是衡量其抑病功能稳定性的另一重要指标。目前大多数合成菌群是在充分混合的条件下进行研究, 但自然界中, 尤其是土壤环境中, 微生物仍存在于空间界定的结构中, 因此有必要研究空间结构对合成菌群的影响, 以理解合成菌群成员之间在时空上的互作及其抵御土传病原菌入侵的稳定性。

合成生态学是当前生态学研究的热点之一, 而合成菌群的构建是合成生态学的重要研究内容之一, 主要是利用合成生物学、生态学和生物信息学的最新理论和研究进展来合理设计适应各种环境, 具有更高应用价值的微生物群落。尽管学者们利用合成菌群对根际核心微生物、群落互作关系以及群落与植物互作相关的某些科学问题进行了探索, 并取得阶段性的成果, 但合成菌群在根际免疫领域研究尚处于起步阶段, 以下几个方面值得关注和研究。

1) 根际核心菌群的结构和功能特性。亟须利用合成菌群探究根际核心微生物群落的装配机制(如随机型/决定型)和影响因素(如土壤类型/植物生长阶段), 揭示核心菌群的结构和功能特性及其时空演化规律与根际免疫的关系。为进一步揭示根际核心微生物在根际免疫中的作用机制, 需要借助培养组学分离更多可培养微生物, 进行基因组测序及微生物分子标记, 并接种到改进的无菌苗种植系统中对核心微生物组成员进行系统研究。

2) 多营养级合成菌群的构建。除了利用合成菌群探究单一营养级生物(如细菌)功能基因、信号分子、生理特性对群落互作和功能的影响, 还需要开展长期的共进化试验研究微生物群落互作演化规律、共进化机制以及影响因素。此外, 通过构建多营养级的合成群落, 比如包含细菌、噬菌体、真菌和原生动物的复杂群落, 对阐明根际微食物网结构和互作关系(竞争、捕食、寄生等)与根际免疫的关系具有重要意义。

3) 植物对合成菌群的响应与识别机制。除了利用合成菌群探究植物抗性相关基因在根际菌群装配的贡献和作用机制, 还应在研究植物影响根际单一功能微生物定殖和功能发挥的基础上, 探究植物面对复杂的根际微生物群落时的识别和响应机制。此外, 植物往往同时免疫养分胁迫和病菌侵染问题, 利用合成菌群探究根际微生物介导的植物矿质养分(如铁营养和磷营养)胁迫与免疫的系统调控机制, 对农业生产综合管理具有重要意义。

4) 模型构建与精准预测。建立连接根际菌群结构与生态功能的预测模型对于精准调控根际菌群功能至关重要, 其中关键的挑战是将根际微生物组实证数据进行简化、标准化, 进而进行可靠的预测模型。将生态学理论、基础试验数据与工程开发策略(如设计-构建-测试-学习循环^[67])、大数据机器学习等技术结合, 设计和研究合成菌群, 有利于更好地理解群落结构与根际免疫的关系。此外, 合成菌群中物质与信息交换驱动的互作关系及机制还有待探究。通过计算机模型来进行合成菌群各组成的设计是一种有效的方法, 根据微生物数据库中提供的微生物组信息来推断微生物的功能。如代谢模型的建立, 用来评估不同微生物之间是否具有代谢相关的联系; 结合机器学习算法, 降低模型对数据细节的依赖性, 也将成为突破瓶颈的有效手段^[14]。

总体来说, 如何从数量巨大的微生物组成员中, 构建出一个稳定高效的合成菌群以提升根际免疫能力, 依然是广泛关注的问题。此外, 植物微生物除了在帮助植物应对土壤病原真菌、病原细菌和病菌线虫等生物胁迫, 还在缓解作物面临干旱、水涝、盐渍化、污染、养分缺乏等非生物胁迫中发挥重要作用^{[22, 68-70]}。因此, 尽管本文重点论述合成菌群在根际免疫研究中的意义和进展, 但关于合成菌群构建的思考也同样适合于理解和解决其他相关领域问题。

致谢: 浙江大学马斌研究员和东北林业大学牛犇教授在文章写作中给予了宝贵建议, 谨致谢意。