文章信息
- 李明通, 孟凡强, 周立邦, 陈美容, 陆兆新
- LI Mingtong, MENG Fanqiang, ZHOU Libang, CHEN Meirong, LU Zhaoxin
- 生姜根腐病的病原菌鉴定及抗菌脂肽的防治效果
- Identification of the pathogen of ginger root rot and the control effeciency of antifungal lipopeptides
- 南京农业大学学报, 2020, 43(6): 1134-1142
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2020, 43(6): 1134-1142.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.202002009
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文章历史
- 收稿日期: 2020-02-11
生姜是一种重要的香辛料, 而且具有很高的食用和药用价值。根腐病是生姜生产过程中危害性较大的一种土传病害, 主要致病菌为腐霉菌[1-9]、镰刀菌[10-14]等真菌和肠杆菌、芽胞杆菌、Erwinia chrusanthemi等细菌[15-17]。根腐病可导致生姜减产50%~80%, 甚至绝产。目前生姜根腐病的防治措施主要是化学防治, 常用的药剂有精甲霜·锰锌、恶霉灵等, 但过量使用化学农药会严重影响人类健康, 且产生致病菌耐药性等问题, 因此寻找广谱、高效、低毒的生物农药已成为科研人员及农药使用人员的共识[18]。抗菌肽是一类短序列多肽, 氨基酸残基一般少于50个。微生物抗菌脂肽是抗菌肽的一种, 是微生物产生的、有抑菌作用的代谢产物, 由氨基酸链和脂肪酸链组成。抗菌脂肽对病原菌的作用方式分为作用于细胞壁、细胞膜或胞内物质。
2018年夏季山东省潍坊地区出现强降水, 降水过后生姜根腐病病情严重, 生姜种植地受到感染, 病害传播迅速, 难以遏制, 农民损失惨重。为生物控制生姜根腐病, 我们采集病姜样本, 分离鉴定根腐病病原菌, 研究芽胞杆菌源抗菌脂肽对病原菌的抑菌作用, 并进一步探究其对生姜根腐病的离体防效, 为生姜根腐病的生物防治提供理论依据和技术参数。
1 材料与方法 1.1 材料和试剂 1.1.1 病姜样本于2018年9月从山东省潍坊市安丘市生姜种植地采集典型的根腐病发病生姜样本, 带回实验室进行病原菌的分离、培养。
1.1.2 培养基玉米粉琼脂(CMA)培养基:量取1 000 mL蒸馏水, 加热至60 ℃, 加入30 g玉米粉, 保持60 ℃水浴1 h; 8层纱布过滤去渣, 加入16 g琼脂, 加入适量蒸馏水补足1 000 mL; 1×105 Pa灭菌20 min, 用于病原菌的分离和菌丝抑制率的测定。马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)培养基用于菌丝培养。Petri培养液[5]:Ca(NO3)2 0.4 g, KH2PO4 0.15 g, CaCl2 0.06 g, 蒸馏水1 000 mL, 1×105 Pa灭菌20 min, 用于病原菌的形态学观察。
1.1.3 抗菌脂肽bacillomycin D(纯度:72%)提取自解淀粉芽胞杆菌fmbJ; iturin A(纯度:65%)提取自解淀粉芽胞杆菌LZ-5;fengycin(纯度:75%)提取自解淀粉芽胞杆菌fmb60;brevibacillin V(纯度:90%)和brevibacillin(纯度:90%)提取自侧孢短芽胞杆菌fmb70。以上菌种均保藏于南京农业大学酶工程实验室。
1.1.4 主要试剂真菌基因组DNA快速抽提试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司; 碘化丙啶(PI)购自美国Sigma公司。
1.2 试验方法 1.2.1 病原菌的分离先将病姜表面的泥土用流水冲洗干净, 在2%次氯酸钠溶液中浸泡10 min, 并用无菌水清洗3~4次; 随后切取病健交界处5 mm×5 mm的姜块置于CMA培养基表面, 于30 ℃培养, 取生长出的菌丝尖端进行反复纯化, 得到纯培养菌株[19]。
1.2.2 病原菌的致病性测定1) 离体侵染:取健康的生姜, 经过表面消毒后, 用直径6 mm的打孔器在菌丝表面打孔, 并挑取该菌丝饼接种于生姜表面, 置于30 ℃培养箱在无菌环境下培养2 d, 观察发病情况。以接无菌水的生姜作为对照。2)活体侵染:采用灌根接种法, 用直径6 mm的打孔器打取CMA培养基上培养2 d的菌丝饼10块, 接种于PDB培养基中, 在30 ℃、180 r·min-1恒温摇床中培养72 h, 得病原菌菌丝; 用组织破碎机将菌丝均质后倒入盆栽生姜植株根茎处, 25~35 ℃培养10 d, 每天观察发病情况。以倒入等量无菌水的生姜植株作为对照。3)人工侵染生姜的病原菌组织分离方法同1.2.1节。
1.2.3 病原菌的形态学鉴定滴1滴融化好的PDA培养基于无菌培养皿中, 将直径6 mm的菌丝饼接于PDA表面, 并滴上数滴Petri培养液于30 ℃密封培养15 h; 吸取15 mL Petri培养液加入培养皿, 没过菌丝, 于22 ℃培养, 每12 h更换1次新鲜的Petri培养液, 更换3次培养液; 挑取菌丝用乳酸酚棉蓝染液染色固定后置于光学显微镜下观察、拍照, 并记录形态和尺寸。
1.2.4 病原菌的分子生物学鉴定使用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取病原菌基因组DNA, 以真菌通用引物ITS1和ITS4对病原菌的ITS保守序列进行PCR扩增, 扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。所得基因序列与GenBank中的序列进行比对, 最后用MEGA 6.0软件构建系统发育进化树。
1.2.5 抗菌脂肽对病原菌的毒力测定采用菌丝生长速率法测定5种抗菌脂肽(bacillomycin D、iturin A、fengycin、brevibacillin V和brevibacillin)对病原菌的菌丝抑制率。用直径6 mm的打孔器打取菌丝饼并置于含有抗菌脂肽的CMA培养基平板中央, 以不含抗菌脂肽的CMA培养基平板为对照, 30 ℃培养箱中培养。待对照组的菌丝长满平板时, 用十字交叉法测量各处理组的菌丝直径, 计算菌丝抑制率。每个处理设3个平行。菌丝生长抑制率=(对照组菌落增长直径-处理组菌落增长直径)/对照组菌落增长直径×100%, 其中:菌落增长直径=菌落直径-菌饼直径。
1.2.6 brevibacillin对群结腐霉孢子囊和卵孢子发育的影响1) brevibacillin对群结腐霉孢子囊发育的影响:滴1滴融化好的PDA培养基于无菌培养皿中央, 将菌丝饼接于PDA培养基表面, 并滴上数滴Petri培养液, 培养皿密封后于30 ℃培养15 h; 加入适量Petri培养液至没过菌丝饼, 并在22 ℃培养12 h; 将Petri培养液更换为含有抗菌脂肽的培养液继续培养12 h, 以不含抗菌脂肽的培养液作为对照。光学显微镜观察抗菌脂肽处理组和对照组孢子囊。2)brevibacillin对群结腐霉卵孢子发育的影响:滴1滴融化好的PDA培养基于无菌培养皿中, 将菌丝饼接于PDA培养基表面, 并滴上数滴Petri培养液, 培养皿密封后于30 ℃培养15 h; 加入适量Petri培养液至没过菌丝饼, 并在22 ℃培养12 h; 每12 h换液1次, 在第3次换液时, 将Petri培养液更换为含有抗菌脂肽的培养液继续培养12 h, 以不含抗菌脂肽的培养液为对照。光学显微镜观察抗菌脂肽处理组和对照组卵孢子。
1.2.7 brevibacillin对群结腐霉微观形态的影响取PDB培养基中培养24 h的菌丝, 用生理盐水洗涤2次, 置于含26 μg·mL-1的brevibacillin的生理盐水中处理4 h, 用生理盐水再次洗涤2~3次。用2.5%戊二醛固定过夜, 经乙醇梯度洗脱、干燥和喷金后用扫描电镜观察。以不含brevibacillin的生理盐水处理组为对照。
1.2.8 brevibacillin对群结腐霉细胞膜通透性的影响1) 采用溴化丙啶(PI)染液检测, 方法如下:滴1滴融化好的PDA培养基于无菌培养皿中央, 将菌丝饼接于PDA培养基表面, 加入适量PDB培养液至没过菌丝饼, 培养24 h; 用生理盐水将菌丝洗涤2次, 加入含26 μg·mL-1brevibacillin的生理盐水处理4 h; 用PI染液(终质量浓度2.5 μg·mL-1)避光染色15 min, 再用生理盐水再次洗涤3~4次, 置于荧光显微镜下拍照。以不含brevibacillin的生理盐水处理组为对照。2)取PDB中培养24 h的菌丝, 用生理盐水洗涤2次, 分别置于含26和39 μg·mL-1 brevibacillin的生理盐水中处理, 在0、1、2、3、4 h时取样, 用紫外分光光度计测定260和280 nm处吸光值的变化用于检测菌丝核酸、蛋白的泄露情况[20]。
1.2.9 brevibacillin对生姜根腐病的防治效果1) 切片制备:生姜经0.1%次氯酸钠浸泡15 min; 用无菌水冲洗4次; 用灭菌刀片将生姜切成厚度为0.5~1.0 cm的薄片备用。2)抗菌脂肽处理:向含500 g无菌土的无菌均质袋中分别加入50 mL质量浓度为26和52 μg·mL-1的brevibacillin, 作为处理组; 加入50 mL 30 μg·mL-1精甲霜·锰锌(总有效成分含量68%, 其中精甲霜灵含量4%, 代森锰锌含量64%)作为阳性对照组; 空白对照组和阴性对照组均加入50 mL无菌水。3)病原菌接种液的制备:用6 mm的打孔器打取10块生长于PDA培养基平板上的菌丝饼, 置于100 mL PDB中, 于30 ℃、180 r·min-1的恒温摇床中培养3 d, 培养结束后用组织破碎机在无菌条件下将菌丝破碎, 并用无菌水稀释25倍备用。4)病原菌接种:分别向处理组、阳性对照组和阴性对照组加入50 mL病原菌接种液, 以不接病原菌接种液为空白对照。每处理3个重复。5)培养及观察:将各组土壤混合均匀后置于30 ℃培养箱中培养1 d后, 每个均质袋中放入10块姜片, 于30 ℃培养箱培养3 d后取出各组, 统计发病情况, 并计算发病率及病情指数[19]。
病情指数=100×∑(病级块数×代表数值)/块数总和×发病最重级的代表数值。
分级标准:病级1, 无病或几乎没有病, 代表数值0;病级2, 软腐部分少于25%, 代表数值1;病级3, 软腐部分占25%~50%, 代表数值2;病级4, 软腐部分多于50%, 代表数值3。
1.3 数据分析系统发育进化树的构建采用MEGA 6.0软件。试验数据处理使用Excel 2007软件, 采用SAS 8.1软件的Duncan’s多范围测试进行显著性检验, 每组3个重复; EC50的计算采用DPS 7.5软件。
2 结果与分析 2.1 病原菌分离及其致病性确定首先从病姜中分离得到1株疑似致病真菌O, 将其接种于健康的生姜块茎横切面(图 1-a), 生姜产生明显的病变, 生姜横切面出现水渍状、褐色病斑, 与菌丝接触的部位出现凹陷, 组织变软, 并伴有臭味(图 1-b)。随后, 将疑似病原菌O接种于生姜植株, 病原菌接种组在第3天开始出现发病症状, 自下而上变为褐色水渍状, 最终倒伏(图 1-c、d), 无菌水对照组未发病(图 1-e)。分别从离体块茎和活体块茎中再次分离到病原真菌, 并对该真菌形态进行观察, 其菌丝形态结构与疑似病原菌O完全相同。根据科赫法则, 可证明菌株O为生姜根腐病的病原菌。
2.2 病原菌的鉴定病原菌O在PDA培养基中生长迅速, 30 ℃培养48 h即可在直径9 cm的平板中长满白色菌丝, 菌丝茂密。在Petri培养液的诱导下病原菌可产生孢子囊、卵孢子和游动孢子(图 2)。显微镜观察菌丝无隔膜, 直径1.60~5.98 μm(平均3.13 μm); 藏卵器球形, 偶有2~3个串生, 直径19.82~33.47 μm(平均26.86 μm), 每个藏卵器附着多个雄器, 雄器与藏卵器异丝生; 卵孢子球形, 壁厚1.12~4.04 μm(平均2.41 μm), 孢子囊指状膨大, 直径4.25~11.12 μm, 长度294.62 μm; 游动孢子肾形, 游动停止后迅速变为圆形的休止孢子; 休止孢子球形, 萌发产生芽管, 直径6.54~10.39 μm(平均9.13 μm)。根据形态学特征[4]初步鉴定生姜根腐病病原菌为群结腐霉。
运用MEGA 6.0软件, 选取病原菌ITS保守序列(878 bp, NCBI检索号为SUB7032836 It MT110680), 使用Clustal W算法比对序列; 随后构建系统发育树, 设置Bootstrap为1 000。图 3结果表明:分离菌株O与群结腐霉(Pythium myriotylum)在同一分支, 自展值达100%;将该序列与Pythium myriotylum voucher CBS69579的ITS序列于NCBI数据库中比对, 其同源度达到99.63%。因此, 结合形态学鉴定和分子生物学鉴定, 将生姜根腐病病原菌鉴定为群结腐霉。
2.3 群结腐霉对抗菌脂肽的敏感性测定通过菌丝生长速率法测定5种抗菌脂肽对群结腐霉的抑制作用, 结果(表 1)表明:brevibacillin和brevibacillin V对群结腐霉的抑菌作用最强, 当其质量浓度为50 μg·mL-1时, 在CMA培养基中测得的菌丝抑制率分别为80.2%和75.3%;此外fengycin抑菌作用较强, 在50 μg·mL-1下的菌丝抑制率为67.4%, 而iturin A和bacillomycin D抑菌作用较弱, 菌丝抑制率分别为26.2%和17.4%。因此又测定了不同浓度brevibacillin对群结腐霉的菌丝抑制率, 并确定brevibacillin对群结腐霉的EC50为13.08 μg·mL-1(表 2)。
处理 Treatment | ρ/(μg·mL-1) | 菌丝直径/cm Colony diameter | 抑制率/% Inhibition rate |
对照 Control | 0 | 8.35a | |
bacillomycin D | 50 | 6.90±0.10b | 17.4 |
iturin A | 50 | 6.16±0.13c | 26.2 |
fengycin | 50 | 2.73±0.32d | 67.4 |
brevibacillin V | 50 | 2.06±0.08e | 75.3 |
brevibacillin | 50 | 1.65±0.09f | 80.2 |
注:不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05)。 Note:Different lowercase letters indicate significant difference among treatments(P < 0.05). |
处理 Treatment | ρ/(μg·mL-1) | 菌丝直径/cm Colony diameter | 抑制率/% Inhibition rate |
对照 Control | 0 | 8.02±0.06 | |
6.25 | 5.35±0.09 | 33.26 | |
12.50 | 3.95±0.28 | 50.73 | |
brevibacillin | 25.00 | 3.00±0.10 | 62.58 |
50.00 | 1.72±0.19 | 78.59 | |
100.00 | 1.22±0.18 | 84.89 |
用26 μg·mL-1 brevibacillin处理将要发育出孢子囊和卵孢子的菌丝, 处理12 h后, 相较于未处理的对照组(图 4-a、b), 发现未发育出孢子囊(图 4-c)及卵孢子(图 4-d), 说明26 μg·mL-1 brevibacillin抑制了群结腐霉营养体的生长和生殖结构的发育。
2.4 brevibacillin对群结腐霉微观形态的影响利用扫描电镜观察brevibacillin对群结腐霉菌丝微观形态的影响(图 5)。在菌丝形态上对照组与brevibacillin处理组明显不同。对照组的菌丝饱满、完整、均匀(图 5-a), 而经过brevibacillin处理的菌丝表面出现了明显的褶皱和枯萎(图 5-b), 说明brevibacillin可以改变群结腐霉菌丝的微观形态, 可能是由于brevibacillin增大群结腐霉细胞膜通透性, 导致胞内物质泄露, 从而使菌丝产生褶皱和萎缩。
2.5 brevibacillin对群结腐霉细胞膜通透性的影响从图 6可见:brevibacillin处理的菌丝经过PI荧光染色后发出的红色荧光几乎充满了每根菌丝, 而对照组则只有少量红色荧光。证明brevibacillin处理菌丝后, 细胞膜通透性增大, PI染料进入菌丝内并与核酸相结合, 从而发出明显的红色荧光。
2.6 brevibacillin对群结腐霉核酸、蛋白泄露的影响为进一步验证brevibacillin引起的群结腐霉细胞膜通透性的变化, 根据核酸和蛋白分别在260和280 nm处有最大吸收的原理, 利用紫外分光光度计测定了brevibacillin处理后的菌丝上清液中蛋白和核酸的浓度。由图 7可见:随着处理时间的延长, 生理盐水处理的对照组吸光值比较平稳, 处理4 h后D260和D280分别增加了0.05和0.04;而brevibacillin处理组的吸光值上升趋势明显, 26 μg·mL-1brevibacillin处理4 h后D260和D280分别增加了0.28和0.12, 39 μg·mL-1 brevibacillin处理4 h后D260和D280分别增加了0.37和0.18。因此, 通过PI荧光染色试验和核酸、蛋白泄露试验证明brevibacillin处理会导致群结腐霉的细胞膜受损, 增加细胞膜通透性, 使其胞内物质泄露, 从而起到抑菌和杀菌作用。
2.7 brevibacillin对生姜离体切片根腐病的防治效果由表 3可见:未接种病原菌的生姜未发病, 而仅接种病原菌的阴性对照组的生姜发病率为100%, 使用精甲霜·锰锌的阳性对照组的生姜发病率为36.7%, 而26、52 μg·mL-1 brevibacillin处理组的发病率分别为60.0%和43.3%, 较阴性对照组的发病率分别降低了40.0%和56.7%;阴性对照病情指数为97.7, 阳性对照为13.3, brevibacillin处理组的病情指数分别为56.7和38.8, 较阴性对照组分别降低了41.0和58.9。表明brevibacillin能够较有效地控制生姜根腐病, 但这2种浓度的发病率还较高, 今后尚需进一步研究增加brevibacillin处理浓度, 减少发病率, 以及在大田环境下的应用研究。
组别 Group | 发病率/% Disease incidence | 病情指数 Disease index |
空白对照 Control | 0 | 0 |
阴性对照 Negative control | 100.0 | 97.7 |
68%精甲霜·锰锌68% metalaxyl-M mancozeb | 36.7 | 13.3 |
26 μg·mL-1brevibacillin | 60.0 | 56.7 |
52 μg·mL-1brevibacillin | 43.3 | 38.8 |
本研究通过组织分离方法从山东潍坊发病生姜中分离出根腐病病原菌, 并利用Petri培养液诱导出孢子囊和卵孢子, 进行了形态学鉴定, 并结合分子生物学鉴定手段鉴定出该病原菌为群结腐霉(Pythium myriotylum)。与元菊丹[5]和胡鲜梅[6]的研究结果一致, 表明群结腐霉多年来一直存在于潍坊生姜种植地块。
利用化学杀菌剂防治生姜根腐病是一种有效的防治手段。刘振伟等[21]研究了不同杀菌剂对群结腐霉的菌丝生长抑制作用, 并进行了田间试验验证, 结果表明68%精甲霜·锰锌水分散粒剂对生姜茎腐病的防治效果最好; 元菊丹等[22]通过测定不同杀菌剂对群结腐霉的抑菌性能, 筛选到恶霉灵、吡唑醚菌酯·代森联、啶菌恶唑、吡唑醚菌酯和溴硝醇等抑菌性能较强的化学杀菌剂。化学杀菌剂的优点有杀菌性强, 见效快等。但是, 化学杀菌剂的过量使用会导致病原菌产生耐药性, 对人类健康产生影响。
生物防治是一种有力的替代化学防治的方法。刘振伟等[23]发现青霉和绿色木霉对生姜茎腐病的防治效果较好, 盆栽防效分别为74.83%和61.9%;胡鲜梅等[24]研究表明在田间条件下, 施甲壳胺对生姜茎基腐病的防治效果达到98.02%;Tambong等[25]发现铜绿假单胞菌PNA1可有效降低由群结腐霉引起的根腐病发病率, 并且进一步发现该菌株分泌的吩嗪类物质是其中有效成分之一; Zouari等[26]研究发现解淀粉芽胞杆菌CEIZ-11的发酵上清液中含有的脂肽类物质, 包括iturin、surfactin和fengycin等, 其脂肽粗提物对瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)的MIC为9.8 μg·mL-1, 并发现该菌株可以作为瓜果腐霉引起的番茄立枯病的生防菌株。然而, 目前尚未有利用抗菌脂肽防治群结腐霉引起的生姜根腐病的报道。brevibacillin是由本实验室保存的侧孢短芽胞杆菌fmb70的发酵产物, 此产物在2016年由Yang等[27]首先从侧孢短芽胞杆菌OSY-I1发酵液中分离鉴定, 是一种阳离子线性脂肽; Wu等[28]发现brevibacillin对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌都具有较好的抑菌活性。因此本研究分别测定了芽胞杆菌源抗菌脂肽bacillomycin D、iturin A、fengycin、brevibacillin V及brevibacillin对群结腐霉的抗菌活性, 结果表明, 在同等浓度下, brevibacillin抗菌能力最强。brevibacillin处理可抑制群结腐霉生殖结构的发育, 进一步研究发现brevibacillin处理改变了其细胞膜的通透性, 使其胞内物质泄露, 菌丝表面褶皱, 进而产生抑菌作用。通过人工接种生姜离体切片验证了brevibacillin在土壤环境下对生姜根腐病中有一定的防控效果。26和52 μg·mL-1 brevibacillin处理组的发病率分别比阴性对照组的发病率降低40.0%和56.7%;病情指数分别比阴性对照组降低41.0和58.9。
本研究鉴定的山东潍坊生姜根腐病病原菌为群结腐霉, 确定了抗菌脂肽brevibacillin对群结腐霉的抑菌作用及离体防治效果, 为生姜根腐病的生物防治, 保障食品安全和减少环境污染提供了理论依据。由于土壤环境对抗菌脂肽的药效发挥有一定影响, 因此对于筛选出的brevibacillin对生姜根腐病的防治效果还有待进行田间试验。
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