南京农业大学学报  2020, Vol. 43 Issue (6): 1097-1106   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.202001038
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任胜林, 梅慧玲, 李映萱, 杜彭涛, 文涛, 乔亦铸, 张赫, 麦远愉, 董银霜, 李静, 黄启为
REN Shenglin, MEI Huiling, LI Yingxuan, DU Pengtao, WEN Tao, QIAO Yizhu, ZHANG He, MAI Yuanyu, DONG Yinshuang, LI Jing, HUANG Qiwei
百合枯萎病病原菌的分离鉴定及其接种浓度对发病程度的影响
Isolation and identification of lily Fusarium wilt pathogen and the effect of spore suspension concentration on the extent of disease
南京农业大学学报, 2020, 43(6): 1097-1106
Journal of Nanjing Agricultural University, 2020, 43(6): 1097-1106.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.202001038

文章历史

收稿日期: 2020-01-17
百合枯萎病病原菌的分离鉴定及其接种浓度对发病程度的影响
任胜林 , 梅慧玲 , 李映萱 , 杜彭涛 , 文涛 , 乔亦铸 , 张赫 , 麦远愉 , 董银霜 , 李静 , 黄启为     
南京农业大学资源与环境科学学院/江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室/江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心/国家有机类肥料工程技术研究中心, 江苏 南京 210095
摘要[目的]江苏宜兴是我国百合生产的传统优势产区,百合枯萎病是严重阻碍百合产业化健康发展的一个关键因子。通过分离鉴定百合枯萎病的致病菌株,接种不同浓度的病原菌孢子悬液,研究百合的发病程度,为江苏宜兴百合枯萎病的生物防治提供科学基础。[方法]采集宜兴百合种植区典型枯萎病发病严重的植株及鳞茎分离致病菌株,通过柯赫氏法则回接试验初步确定致病性,对致病性强的菌株进行DNA提取、PCR扩增和测序,基于病原菌rDNA-ITS基因序列和GenBank中已有相关尖孢镰刀菌序列,应用MEGA 7.0软件构建系统发育树;采用刺伤百合鳞片接种不同浓度的病原菌孢子悬液与在土壤中接种不同浓度病原菌孢子悬液的方法,评估不同浓度孢子悬液对百合枯萎病发病程度的影响。[结果]从典型枯萎病严重发病的植株上共分离得到4株病原菌株:P-OF、P-PF、P-RF和P-BF,分离率分别为25%、20%、10%和5%。柯赫氏法则回接试验表明:接种菌株P-OF、P-PF百合发病率为100%,鳞片病情指数分别为92.50、48.25、15.00、30.00;盆栽试验表明:接种菌株P-OF的百合植株最先发病,初步确定菌株P-OF的致病性最强;通过形态学和分子生物学对菌株P-OF的鉴定结果表明,从典型枯萎病严重发病百合植株中所分离的病原菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。百合枯萎病的病情指数与接种病原菌孢子悬液浓度相关,百合鳞片接种试验和盆栽试验结果表明,土壤病原菌浓度为103 CFU·g-1,是导致百合植株发病的临界浓度,当土壤病原菌浓度低于105 CFU·g-1时,病情指数随接种浓度增加而增加,当土壤病原菌浓度高于105 CFU·g-1时,病情指数不再显著增加。[结论]从江苏宜兴百合枯萎病的典型发病植株中分离到4株病原菌株,其中菌株P-OF的致病性最强,经鉴定为尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysporum sp.f.lilii),导致百合植株发病的临界土壤病原菌浓度为103 CFU·g-1
关键词百合   枯萎病   病原菌分离   孢子悬液浓度   病情指数   发病率   
Isolation and identification of lily Fusarium wilt pathogen and the effect of spore suspension concentration on the extent of disease
REN Shenglin, MEI Huiling, LI Yingxuan, DU Pengtao, WEN Tao, QIAO Yizhu, ZHANG He, MAI Yuanyu, DONG Yinshuang, LI Jing, HUANG Qiwei    
College of Resources and Environmental Sciences/Jiangsu Provincial Key Laboratory for Organic Solid Waste Utilization/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Solid Organic Waste Resource Utilization/National Engineering Research Center for Organic-Based Fertilizers, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] Lily(Lilium spp.) is one of the dominant traditional production areas in Yixing City, Jiangsu Province, China. Fusarium wilt is a key stunting factor for the healthy development of lily production. The isolation and identification of the pathogenic strains of lily Fusarium wilt in Yixing City, inoculation of spore suspensions of pathogens of different concentrations and the relationship between occurrence degree and the concentration of spore suspensions of pathogens were carried out for providing scientific basis in biological control technology of lily Fusarium wilt in Yixing. [Methods] The pathogenic strains were isolated from the plants with severe blight disease and bulbs in the lily field of Yixing. The pathogenicity was preliminarily determined by the Koch's rule backhaul experiment. The highly pathogenic strains were subjected to DNA extraction, PCR amplification and sequencing. The phylogenetic dendrogram was constructed based on the rDNA-ITS gene sequence of the pathogens and the related Fusarium oxysporum sequence in GenBank by using MEGA 7.0 software. The incidence of lily Fusarium wilt was evaluated by inoculating experiments both in inoculating pathogen spore suspension to the soil and in wounded inoculating pathogen spore suspension on the plants. [Results] A total of 4 pathogenic strains of P-OF, P-PF, P-RF and P-BF were isolated from severely blighted plants, with isolation rates of 25%, 20%, 10% and 5%, respectively. The back-to-back experiments of the law showed that the incidence of P-OF and P-PF was 100%, and the scale index was 92.50, 48.25, 15.00 and 30.00, respectively. The results of pot experiment showed that the treatment of lily plants inoculated with P-OF was the first to develop the disease. This hinted that the pathogenicity of P-OF might be the strongest. The identification of P-OF by morphology and molecular biology showed that the pathogen isolated from lily plants with severe wilt was Fusarium oxysporum. The results of lily scale inoculation and pot experiment showed that the concentration of soil pathogen at 103 CFU·g-1 was the critical concentration of lily Fusarium wilt. The disease index increased with increasing inoculation concentration within 105 CFU·g-1 and no longer increased significantly if the pathogen concentration in soil was higher than 105 CFU·g-1. The disease index of lily Fusarium wilt was related to the concentration of spore suspension of inoculated pathogens. [Conclusions] Four pathogenic strains identified as Fusarium oxysporum were isolated from Fusarium wilt plants in Yixing lily field. The P-OF was the most pathogenic strain, identified as Fusarium oxysporum sp. f. lilii. The critical concentration of soil pathogen was 103 CFU·g-1.
Keywords: lily    Fusarium wilt    pathogen isolation    spore suspension concentration    disease index    incidence of a disease   

百合(lily)是单子叶植物亚纲百合科(Liliaceae)百合属(Lilium spp.)多年生草本植物[1], 全国各地均有种植, 主产于湖南、四川、河南、江苏、浙江, 江苏宜兴就是我国百合生产的传统优势产区[2]。百合是具有药用、食用、观赏价值的植物[3], 目前正在向规模化、产业化和多用高效化的方向发展。在百合产业的发展过程中, 土传病害引起的连作障碍是影响百合产量和品质的关键技术问题, 而百合枯萎病是连作障碍引起的最重要病害, 可造成不同程度的产量和质量损失[4]

百合枯萎病也称为百合茎腐病、根腐病, 是一种由土传真菌引发的一类严重土传病害。百合枯萎病的病原菌主要为尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysporum sp. f. lilii), 还有茄腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和串珠镰刀菌(Fusarium moniliform)[5], 其中由尖孢镰刀菌引起的百合枯萎病是最严重的病害。病原菌主要从百合肉质根或鳞茎盘基部的伤口侵入, 然后鳞茎从基盘处腐烂和剥落, 被病原菌侵染的植株生长缓慢, 不能向上运输养分, 同时叶子从基盘处逐渐变黄和脱落, 造成肉质根和鳞茎盘基变褐腐烂[6-8]。在贮存和运输过程中镰刀菌还会持续影响百合植株, 致使大量鳞茎发生腐烂坏死[9]。枯萎病是百合病害中最严重、造成经济损失最大的病害之一。准确、快速地鉴定百合枯萎病病原菌, 对于进一步明确该病的发病机制、研发百合枯萎病的防控技术、促进百合产业的健康发展都具有重要意义。

百合枯萎病的发生与诸多因素相关, 例如百合品种的抗性、百合生长时期、环境条件(湿度和温度等)以及土壤中病原菌的状态等[10]。外界环境条件相对稳定时, 作物土壤病害的发病率以及发病程度与土壤中病原菌数量呈正相关关系[9-11], 然而在相对稳定的环境中, 百合枯萎病病原菌接种浓度对百合发病程度的影响还鲜有报道。本研究对江苏宜兴百合枯萎病病原菌进行分离及鉴定, 研究百合枯萎病病原菌数量与百合发病的关系, 旨在为江苏宜兴百合枯萎病的生物防治提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 供试百合植株

从江苏省宜兴市柯铭生态园百合种植基地采集10株严重发病的具有典型枯萎病症状的百合植株, 品种为‘宜兴百合’, 分类学定名为卷丹(Lilium lancifolium Thunb)。

1.1.2 培养基配方

PDA培养基:20%马铃薯浸出液1 000 mL(200 g马铃薯煮沸15 min, 定容至1 000 mL)、葡萄糖20 g、琼脂18 g。

尖孢镰刀菌的选择性培养基:KH2PO4 1.0 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、Fe-Na-EDTA 0.01 g、L-天门冬酰胺2.0 g、D-半乳糖20.0 g、蒸馏水1 000 mL。抗生素类物质:二硝基苯(75%可湿性粉剂)1.0 g、牛胆汁0.5 g、Na2B4O7·10H2O 1.0 g、硫酸链霉素0.3 g。培养基用10%(体积分数)磷酸调节pH值至3.8±0.2。配制参照文献[12-13]。

1.2 试验方法 1.2.1 病原菌的分离和纯化

选择发病百合的根、茎、鳞茎作为分离材料, 从其病健交界处切取1 cm×1 cm的小块组织, 先在75%乙醇中浸3 min以除去气泡, 无菌水冲洗3次, 再用5%次氯酸钠浸泡5 min进行表面消毒, 用无菌水冲洗7次, 用灭菌滤纸吸干表面水分, 然后以五点法将组织转移在PDA培养基上, 置于28 ℃培养箱中培养。待长出菌丝后, 挑取部分菌丝接种在PDA平板上, 经3次纯化后, 根据菌落颜色和形态进行分类编号, 采用稀释法进行单孢分离和培养。

1.2.2 回接试验

根据柯赫法则(Koch’s rule), 为验证分离纯化得到的4株病原菌菌株的致病性, 进行回接试验。回接试验采用鳞片接种法[14]和盆栽试验。鳞片接种法试验于2018年10月10日—25日在实验室进行, 盆栽试验于2019年4月15日—6月15日在温室内进行。

鳞片接种法:选取健康的百合鳞茎片, 用75%的乙醇表面消毒, 无菌水冲洗5次, 用灭菌牙签在健康百合鳞片上刺孔, 将带有培养基的菌饼贴在孔上, 以刺孔但不贴菌饼的鳞片作为对照。将百合鳞片放置于28 ℃培养箱内培养。

菌饼制备:将分离的菌株(P-RF、P-BF、P-PF、P-OF)在PDA平板上培养, 培养至菌落铺满整个平板, 使用直径为5 mm的菌饼打孔器, 将长满病原菌的平板制备成多个直径为5 mm的菌饼, 备用。

设置5个处理:1)接种菌株P-RF的菌饼(简称P-RF); 2)接种菌株P-BF的菌饼(简称P-BF); 3)接种菌株P-PF的菌饼(简称P-PF); 4)接种菌株P-OF的菌饼(简称P-OF); 5)未接病原菌的菌饼(CK)。每个处理重复4次(5片健康百合鳞片组成1次重复, 每片鳞片上接2个菌饼, 即5片健康百合鳞片上的10个菌饼组成1次重复; 未接菌饼作为对照)。

盆栽试验共设置5个处理:1)对照(CK, T1):无菌水; 2)菌株P-RF的孢子悬液(T2);3)菌株P-BF的孢子悬液(T3);4)菌株P-PF的孢子悬液(T4);5)菌株P-OF的孢子悬液(T5)。每处理重复9次。

菌株孢子悬液制备:用直径5 mm的无菌打孔器分别取分离纯化后不同菌株的菌丝块, 分别接种至液体PDA培养基, 28 ℃摇床振荡培养5~7 d后, 将培养液用4层无菌纱布过滤, 8 000 r·min-1离心10 min, 收集孢子, 加无菌水重悬, 制成每毫升孢子数量为108的孢子悬液, 待用。

盆栽试验每盆装1 kg水稻土(经检测, 无百合枯萎病病原菌), 每盆定植1株健康百合苗。待百合苗成活后, 采用针刺伤根法接种, 除对照(接无菌水)外, 其他处理分别接种不同菌株的孢子悬液, 接种量1 mL, 常规管理。

1.2.3 病原菌的形态学鉴定

将分离纯化的枯萎病病原菌菌株接种到PDA平板上, 采用稀释法进行单孢分离和培养[15], 28 ℃培养5 d后, 观察菌落形态, 在显微镜下观察菌丝、分生孢子的形态以及生长情况, 根据菌落直径、大型分生孢子的形态及产生方式、有无小型分生孢子及产生方式、有无厚垣孢子及产生方式等为主要形态, 根据《镰刀菌属》《真菌鉴定手册》《尖孢镰刀菌生物学及其生物防治》等的方法进行鉴定。

1.2.4 病原菌的分子生物学鉴定

18S rDNA鉴定:使用土壤DNA提取试剂盒(DNeasy Power Soil Kit)提取真菌总DNA。以提取的病原菌基因组总DNA作模板, PCR扩增ITS(internal transcribed spacer)核酸片段。ITS引物:ITS1(5′-TCCGTAGGTAACCTGGGG-3′); ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。PCR反应体系(25 μL):引物ITS1/ITS4 0.5 μL, dNTP(2.5 mmol·L-1)2.5 μL, 10×PCR Buffer(含MgCl2 25 mmol·L-1)2.5 μL, DNA模板1 μL, Taq DNA酶(5 U·μL-1)0.5 μL, ddH2O 17.5 μL。扩增条件:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 54 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35个循环; 72 ℃ 10 min, 4 ℃ 10 min。PCR产物经纯化后测序。将18S rDNA基因序列与GenBank数据库中的已有序列进行比对分析, 并用MEGA 7.0软件进行序列分析并构建系统发育树, 确定该菌株的分类地位。

1.2.5 不同浓度病原菌孢子悬液对百合枯萎病的影响

采用鳞片接种法和盆栽试验进行, 鳞片接种方法同1.2.2节。2018年11月20日—12月5日在实验室进行鳞片接种法试验, 2019年4月15日—6月15日在温室内进行盆栽试验。

孢子悬液制备:用直径5 mm的无菌打孔器取分离菌株P-OF的菌丝块接种到液体PDA培养基中, 28 ℃摇床振荡培养5~7 d后, 将培养液用4层无菌纱布过滤, 8 000 r·min-1离心10 min, 收集孢子, 加无菌水重悬, 制成每毫升孢子数量为108的孢子悬液。

鳞片接种法试验设9个处理:1)对照(CK):鳞片接种无菌水; 2)T1处理:鳞片接种101 CFU·mL-1病原菌孢子悬液; 3)T2处理:鳞片接种102 CFU·mL-1病原菌孢子悬液; 4)T3处理:鳞片接种103 CFU·mL-1病原菌孢子悬液; 5)T4处理:鳞片接种104 CFU·mL-1病原菌孢子悬液; 6)T5处理:鳞片接种105 CFU·mL-1病原菌孢子悬液; 7)T6处理:鳞片接种106 CFU·mL-1病原菌孢子悬液; 8)T7处理:鳞片接种107 CFU·mL-1病原菌孢子悬液; 9)T8处理:鳞片接种108 CFU·mL-1病原菌孢子悬液。

选取健康的百合鳞片, 用灭菌牙签在鳞片上刺孔, 制备菌株P-OF悬液浓度分别为101、102、103、104、105、106、107和108 CFU·mL-1, 分别向百合刺伤处注射100 μL不同浓度病原菌孢子悬液, 对照注射100 μL无菌水。每个处理重复6次, 每次重复含6片健康百合鳞片。百合鳞片置于28 ℃培养箱内培养。

盆栽试验设6个处理:1)对照(CK):无菌水; 2)T22处理:接种102 CFU·g-1病原菌的土壤处理; 3)T33处理:接种103 CFU·g-1病原菌的土壤处理; 4)T44处理:接种104 CFU·g-1病原菌的土壤处理; 5)T55处理:接种105 CFU·g-1病原菌的土壤处理; 6)T66处理:接种106 CFU·g-1病原菌的土壤处理。

盆栽试验:每盆装1 kg水稻土(经检测, 无百合枯萎病病原菌), 除对照外, 其他处理分别接种菌株P-OF的孢子悬液, 每盆总液体量相同(不够部分用无菌水补充), 采用稀释涂布控制各处理土壤病原菌浓度分别为102、103、104、105和106 CFU·g-1, 平衡2~3 d。再选择8~10 cm高的健康百合苗定植, 每盆定植1株, 每处理重复9次, 常规水肥管理。

1.3 测定项目 1.3.1 鳞片及盆栽试验病情指数(disease severity index, DSI)的统计

接种不同浓度的病原菌孢子悬液后, 10 d后记录发病症状, 测量每个发病百合鳞片的病斑直径(d), 计算病斑占鳞片面积比例。将鳞片发病级数划分为5级:0级, 鳞片健康无病斑现象; 1级, 病斑侵染面积约占百合鳞片面积0%~10%;2级, 病斑侵染面积约占百合鳞片面积10%~20%;3级, 病斑直侵染面积约占百合鳞片面积20%~30%;4级, 病斑侵染面积约占百合鳞片面积30%以上。

接种不同浓度的病原菌孢子悬液后, 当第1株病株出现后, 每隔5 d调查发病情况。病情严重度分为4级:0级为健康植株; 1级为1至2片叶片变黄萎蔫; 2级为3片以上至全株1/3叶片变黄萎蔫, 茎轻微腐烂; 3级为全株叶片1/2至3/4变黄萎蔫, 茎中度腐烂; 4级为3/4以上或全株叶片变黄萎蔫, 茎严重腐烂。病情指数(DSI)=100×[∑(病害发病级数×该级别的植株数)/(供试植株或鳞片数×总植株或鳞片数)]。

1.3.2 统计发病率

鳞片接种不同浓度的病原菌孢子悬液试验:10 d后统计发病率, 观察百合鳞片刺伤接种孢子悬液部位是否出现褐色病斑。发病率=处理发病株数/处理重复次数×100%。

盆栽试验:百合移苗后, 每天观察百合生长情况, 至植株发病严重时, 记录发病植株数。

1.4 数据分析

采用Excel 2016和SPSS 24软件进行数据统计和显著性水平检验。

2 结果与分析 2.1 百合枯萎病病原菌菌株的分离

从严重发病的典型枯萎病症状的10株百合植株上分离得到4株病原菌菌株, 分别编号为P-OF、P-PF、P-RF、P-BF。其他病原菌未分离成功, 分离结果见表 1

表 1 宜兴百合枯萎病病原菌菌株分离 Table 1 Isolation of Fusarium wilt pathogens in Yixing
菌株
Strain
分离部位
Separation site
组织块数
Number of organization blocks
感染菌块数
Number of infected bacteria
分离率/%
Separation rate
P-OF 鳞片Scales 20 5 25
P-PF 鳞片Scales 20 4 20
P-RF 鳞片Scales 20 2 10
P-BF 鳞片Scales 20 1 5
2.2 病原菌回接试验

刺伤接菌后的百合鳞片发病症状与田间发病症状相同。回接分离的4株病原菌株的百合鳞片, 刺伤口出现褐色病斑, 同时向周围蔓延(图 1)。接种不同病原菌的百合鳞片的病情指数显著高于未回接病原菌的百合鳞片, 回接P-OF病原菌处理的病情指数显著高于菌株P-RF、P-BF、P-PF, 同时, 回接菌株P-OF和P-PF的百合鳞片发病率高达100%(表 2)。

图 1 病原菌回接试验 Fig. 1 Pathogenic bacteria back grafting test 接种第8天照片, 温度28 ℃, 湿度为室内湿度。On day 8 after inoculation, temperature is 28 ℃, humidity is indoor humidity.
表 2 回接病原菌对百合枯萎病发病病情指数和发病率的影响 Table 2 Effect of pathogen on the disease index and incidence of lily Fusarium wilt
处理
Treatment
鳞片接种试验Scale inoculation experiment 盆栽回接试验Potted back connection experiment
病情指数
Disease index
发病率/%
Incidence
发病率/%
Incidence
最初发病出现时间
Time of initial onset
CK 0
P-OF 92.50±2.89a 100 100 接种后14 d
14 d after inoculation
P-PF 48.25±6.29b 100 100 接种后16 d
16 d after inoculation
P-BF 30.00±14.14c 85 100 接种后17 d
17 d after inoculation
P-RF 15.00±4.08d 60 100 接种后18 d
18 d after inoculation
注:同列不同小写字母表示同列间差异显著(P < 0.05)。下同。
Note:The different lowercase letters indicate significant difference in the same column at 0.05 level. The same as follows.

除对照外, 接种百合枯萎病4个菌株13 d后, 百合植株开始发病, 最先发病的是接种菌株P-OF的处理, 其他依次分别为接种菌株P-PF、P-BF、P-RF的处理。以上结果表明:菌株P-OF、P-PF、P-BF和P-RF均是导致宜兴百合枯萎病的病原菌, 其中菌株P-OF的致病性最强, 后续相关研究均以此菌株为基础展开。

2.3 百合枯萎病病原菌菌株P-OF的显微镜观察

将分离得到的菌株P-OF接种于PDA平板上, 28 ℃培养5 d后, 观察其菌落形态。由图 2可见:菌株在PDA培养基上菌落呈圆形, 其菌丝具有条纹, 气生菌丝呈白色絮状或绒毛状, 初期菌落呈白色, 菌落中央呈淡紫色, 背面带有淡紫色的色素(图 2-A、B)。菌株菌落繁茂, 气生菌丝丰厚。

图 2 百合枯萎病病原菌菌株P-OF的形态观察 Fig. 2 Morphological observation of lily Fusarium wilt pathogen strain P-OF A.菌落正面形态; B.菌落反面形态; C.大、小型分生孢子; D.菌丝形态; E.厚垣孢子; F.分生孢子梗。 A. Positive colony morphology; B. Reverse side colony morphology; C. Large and small conidia; D. Mycelial morphology; E. Chlamydospore; F. Conidiophore.

采用插片法显微(400×)观察病原菌菌丝和分生孢子, 其大型分生孢子呈镰刀型, 顶细胞趋尖, 基细胞足状, 一般为3~5个隔, 多数为3隔, 大小为(12.56~32.68)μm×(2.11~3.85)μm; 小型分生孢子呈椭圆形或卵形, 0~1隔, 大小为(3.89~12.47)μm×(2.23~3.56)μm(图 2-C)。具有厚垣孢子, 其顶生或间生, 呈球形或椭圆形(图 2-E)。分生孢子梗呈长条形(图 2-F)。依据文献[16], 初步确认该菌株为尖孢镰刀菌。

2.4 百合枯萎病病原菌菌株P-OF的分子生物学鉴定

DNA测序结果表明, 病原菌菌株P-OF rDNA-ITS序列长度为547 bp(GenBank No. MN883862)。将其在NCBI网站中进行BLAST比对, 用邻接法通过MEGA 7.0软件构建系统发育树, 结果(图 3)表明, 该病原菌菌株与Fusarium oxysporum的同源性高达99%以上, 结合菌株的形态特征以及ITS序列相似性分析, 确定该病原菌菌株为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。

图 3 基于菌株P-OF rDNA-ITS序列构建的系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic dendrogram constructed based on the rDNA-ITS sequence of strain P-OF 标尺代表菌株的遗传距离。The scale represents the genetic distance of the strain.
2.5 接种不同浓度百合枯萎病病原菌菌株P-OF孢子悬液对百合枯萎病的影响

图 4可知:病原菌孢子悬液接种浓度临界值为103 CFU·mL-1。当病原菌孢子悬液接种浓度为101 CFU·mL-1时, 百合鳞片无发病现象; 当病原菌孢子悬液接种浓度为102 CFU·mL-1时, 百合鳞片出现轻微病斑; 当病原菌孢子悬液接种浓度在103 CFU·mL-1及以上时, 随病原菌孢子悬液接种浓度的增加, 百合鳞片的病斑也随之增大。

图 4 鳞片接种不同浓度百合枯萎病病原菌孢子悬液试验 Fig. 4 Test on scales inoculated with different concentration of spore suspension of lily wilt pathogen CK(对照):无菌水处理; T1:接种101 CFU·mL-1病原菌孢子悬液; T2:接种102 CFU·mL-1病原菌孢子悬液; T3:接种103 CFU·mL-1病原菌孢子悬液; T4:接种104 CFU·mL-1病原菌孢子悬液; T5:接种105 CFU·mL-1病原菌孢子悬液; T6:接种106 CFU·mL-1病原菌孢子悬液; T7:接种107 CFU·mL-1病原菌孢子悬液; T8:接种108 CFU·mL-1病原菌孢子悬液浓度。下同。 CK(control):Sterile water treatment; T1:Inoculation with pathogenic spore suspension concentration of 101 CFU·mL-1; T2:Inoculation with pathogenic spore suspension concentration of 102 CFU·mL-1; T3:Inoculation with pathogenic spore suspension concentration of 103 CFU·mL-1; T4:Inoculation of pathogenic spore suspension concentration of 104 CFU·mL-1; T5:Inoculation of pathogenic spore suspension concentration of 105 CFU·mL-1; T6:Inoculation of pathogenic spore suspension concentration of 106 CFU·mL-1; T7:Inoculation of pathogenic spore suspension concentration of 107 CFU·mL-1; T8:Inoculation of pathogenic spore suspension concentration of 108 CFU·mL-1. The same as follows.

鳞片接种试验结果(表 3)表明:健康百合鳞片上接种不同浓度病原菌孢子悬液后, 28 ℃培养10 d, T1处理百合鳞片没有出现病斑, T2处理出现轻微病斑, 当接种浓度为103 CFU·mL-1时, T3处理发病率、病情指数显著高于T1与T2, 随着接种浓度的升高, 病情指数显著增加, T8处理百合鳞片伤口腐烂严重, 病情指数最高。

表 3 接种不同浓度百合枯萎病病原菌孢子悬液对百合枯萎病的病情指数和发病率的影响 Table 3 Effects of scale inoculation with different concentrations of pathogens spore suspensions on the disease index and incidence of lily wilt
处理
Treatment
鳞片接种(A)Scale inoculation(A) 处理
Treatment
盆栽试验(B)Pot experiment(B)
病情指数Disease index 发病率/% Incidence 病情指数Disease index 发病率/% Incidence
CK 0h 0 CK 0e 0
T1 0h 0 T22 9.26±0.52d 6.45
T2 0.69±0.02g 2.80 T33 27.08±2.13c 49.50
T3 26.36±5.01f 47.22 T44 56.52±3.69b 75.82
T4 39.58±5.74e 91.66 T55 92.96±2.47a 100.00
T5 52.08±4.37d 100.00 T66 100a 100.00
T6 63.19±3.14c 100.00
T7 79.17±5.27b 100.00
T8 93.06±6.27a 100.00
注:CK(对照):无菌水; T22:土壤病原菌孢子浓度102 CFU·g-1; T33:土壤病原菌孢子浓度103 CFU·g-1; T44:土壤病原菌孢子浓度104 CFU·g-1:T55:土壤病原菌孢子浓度105 CFU·g-1; T66:土壤病原菌孢子浓度106 CFU·g-1
Note:CK(control):Sterile water; T22:Soil pathogen spore concentration 102 CFU·g-1; T33:Soil pathogen spore concentration 103 CFU·g-1; T44:Soil pathogen spore concentration 104 CFU·g-1:T55:Soil pathogen spore concentration 105 CFU·g-1; T66:Soil pathogen spore concentration 106 CFU·g-1.

盆栽试验结果(表 3)表明:土壤接种不同浓度孢子悬液对百合植株病情指数的影响不同。随接种病原菌浓度增加, 植株病情指数显著增加, T55和T66处理病情指数显著高于其他病原菌孢子悬液浓度处理, T55与T66处理之间无显著差异。试验期内, CK处理百合植株没有出现发病现象。

结合百合鳞片接种试验与盆栽试验结果:导致宜兴百合植株发病的土壤病原菌临界浓度为103 CFU·g-1。当病原菌孢子悬液浓度大于103 CFU·g-1时, 百合枯萎病发病严重, 若病原菌浓度低于103 CFU·g-1, 发病缓慢且发病率低, 而当土壤中病原菌浓度达到105 CFU·g-1, 百合植株几乎全部出现枯萎病症状。

2.6 接种不同浓度百合枯萎病病原菌孢子悬液与百合枯萎病病情指数的关系

图 5可知:各处理中的百合鳞片和百合植株接种不同浓度的病原菌孢子悬液与枯萎病病情指数呈正相关关系, 病原菌浓度在一定范围内, 随着病原菌孢子悬液浓度的增加, 病情指数也增加。

图 5 百合枯萎病病原菌孢子悬液浓度与百合枯萎病病情指数的关系 Fig. 5 Relationship between the concentration of spore suspension of pathogenand disease severity index of lily Fusarium wilt A.盆栽试验Pot experiment; B.鳞片接种试验Scale inoculation experiment.
3 讨论

植物真菌性枯萎病是一种毁灭性土传病害, 其主要的致病菌是尖孢镰刀菌, 它寄主范围广泛, 可引起100多种植物发生病害[17-18]。病原菌由根部开始侵染植物, 一方面镰刀菌侵染植物导管, 产生有害物质堵塞导管, 引起维管束病害; 另一方面, 镰刀菌会产生植物毒素, 例如伏马菌素(fumonisins)、镰刀菌素C(fusarin C)、串珠镰刀菌素(moniliformin)和镰刀菌酸(fusaric acid), 毒素导致细胞坏死和茎秆破裂, 最后致使植物枯死, 此病害在植物整个生育期都可能发生, 有着“植物癌症”之称[19-20]。本试验首先从大田染病的百合植株鳞茎、茎基部和根茎分离得到4株病原菌, 通过回接试验对病原菌进行柯赫氏法则验证, 初步确定P-OF为强致病菌株, 并进一步通过显微镜观察其形态特征, 分子生物学鉴定, 确认该病原菌菌株为百合枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f. sp. lilii)。因为缺乏不同百合品种和病原菌参比生理小种的鉴别标准, 因此未做病原菌生理小种鉴定。

尖孢镰刀菌是世界范围内许多作物的重要致病菌, 因此尖孢镰刀菌的准确鉴定对防控作物枯萎病意义重大。本研究从百合发病植株分离筛选得到4株病原菌, 通过形态学和分子生态学鉴定菌株P-OF为尖孢镰刀菌。边小荣等[21-22]通过刺伤接菌, 得到导致兰州百合发病的病原菌为尖孢镰刀菌。本研究中筛选得到的尖孢镰刀菌, 通过回接试验培养之后, 病情指数显著高于未接菌与其他菌株处理, P-OF处理首先发病。有研究表明引起兰州百合枯萎病的病原菌为三线尖孢镰刀菌[23], 导致山西地区百合发生枯萎病的病原菌为层出镰刀菌[24]。笔者认为导致百合枯萎病的病原菌具有地域性, 病原菌在不同地区不完全相同, 但是都会有一个最强的致病菌, 研究表明尖孢镰刀菌是引起百合枯萎病最严重的病原菌[25]。百合枯萎病的发生受植株的抗病能力、健康状况、土壤中病原菌数量、外界环境的湿度和温度等因素的影响。研究表明, 大豆、西瓜、生姜是否发病取决于土壤中病原菌的数量, 枯萎病的病情指数与病原菌孢子浓度呈正相关关系, 随着病原菌数量的增多, 枯萎病发病指数也增加[26-28]。本研究的结果与之相似。

本研究中, 鳞片接种不同浓度病原菌结果表明, 当接种病原菌孢子悬液浓度低于103 CFU·mL-1时, 百合枯萎病发病程度缓慢且发病率低, 然而接种浓度高于103 CFU·mL-1, 植株病情指数随着接种孢子悬液浓度的升高而增加, 当病原菌孢子悬液浓度为105 CFU·mL-1, 百合鳞片发病率达到100%。同时, 盆栽试验表明, 当土壤病原菌浓度不高于105 CFU·g-1时, 植株病情指数随接种量的增加而显著增加, 当土壤病原菌浓度高于105 CFU·g-1时, 病情指数不再显著增加。随着病原菌孢子悬液浓度的升高与病情指数的增加, 百合鳞片和百合植株发病更加严重。分析可能原因是, 百合枯萎病病原菌不仅在生长期危害百合, 同时在收获后还会持续导致百合发生严重病害, 其主要从百合的鳞茎种球入侵, 危害其根、鳞茎部位, 随着时间逐步向上侵染, 使其腐烂以致死亡。González-Jartín等[29]研究表明尖孢镰刀菌产生一种毒力很强的尖孢镰刀菌毒素, 通过植株受伤部位, 抑制愈伤组织生长并使之褐变, 降低游离脯氨酸和可溶性蛋白质的含量, 造成百合鳞片和植株发病。当接种不同浓度病原菌孢子悬液, 百合鳞茎给病原菌提供了丰富的营养, 在适宜的温度和湿度条件下, 侵染百合的尖孢镰刀菌数量将显著增加, 同时病原菌的增加又对百合组织进行侵害。有研究表明, 植物根系或者组织受线虫或病原菌侵染时, 会分泌一些酚、酸类物质、总氨基酸和总糖, 可有效促进尖孢镰刀菌的生长, 致使镰刀菌数量显著增加, 有利于枯萎病的发生[30]。因此, 当不同浓度病原菌孢子悬液接种到百合鳞片刺伤部位和种植百合土壤时, 病原菌通过百合刺伤部位吸取所需营养进行繁殖, 释放毒素侵害百合鳞片, 随着病原菌孢子悬液浓度的升高, 百合枯萎病的病情指数随之增加。结合接种病原菌孢子悬液浓度以及百合枯萎病的病情指数分析发现, 连作会导致百合种植土壤的病原菌浓度升高, 致使百合枯萎病发病程度一年比一年更加严重。

综上所述, 从江苏省宜兴市柯铭生态园百合种植基地采集10株严重发病的具有典型枯萎病症状的百合植株上分离纯化获得了4株致病菌株, 通过百合鳞片回接试验和盆栽试验, 初步筛选出1株致病性强的菌株P-OF。通过形态学、分子生物学鉴定确认该菌株为尖孢镰刀菌; 通过刺伤接菌和盆栽试验, 发现菌株P-OF不同浓度孢子悬液对百合枯萎病的影响不同, 随着病原菌孢子悬液浓度的增加, 百合病情指数随之增加。

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