文章信息
- 靳建锋, 张峰
- JIN Jianfeng, ZHANG Feng
- 土壤重要动物白符䖴(Folsomia candida)基因组的重新组装与注释
- An improved genome of the soil important animal Folsomia candida
- 南京农业大学学报, 2020, 43(6): 1042-1048
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2020, 43(6): 1042-1048.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201912054
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文章历史
- 收稿日期: 2019-12-27
土壤动物是指终生或某一发育阶段在土壤中度过且对土壤有一定影响的动物[1]。大多数无脊椎动物门类在土壤中都有代表类群, 主要包括原生动物、扁形动物、线形动物、轮形动物、环节动物、缓步动物、软体动物和节肢动物等动物门[1]。其中, 跳虫作为最古老的六足动物[2], 广泛分布于各种陆地生态系统中[3], 它们种类丰富, 体形微小, 颜色多样, 与线虫、螨虫共称为土壤动物三大类群, 在土壤生态系统中起到重要作用[4]。
白符䖴(Folsomia candida)具有分布广泛、生长周期短、孤雌生殖、繁殖率高、易于饲养等优点, 近半个世纪以来一直作为标准化实验土壤动物, 用以评价杀虫剂和环境污染物等对土壤动物的影响[5]。国际上普遍使用白符䖴评价污染物进入陆地生态系统后可能产生的危害。通过毒理相关试验, 调查有毒化学物质在白符䖴体内的积累及对其生活史和行为的影响[6-9]。毒理试验不仅评估污染物的毒性, 而且表明白符䖴的种群动态可以用来评价对污染土壤采取的治理措施是否成功[10]。
近年来, 跳虫基因组研究取得了一些进展, 到目前为止, 共发表了4种跳虫的基因组:Orchesella cincta[11]、Folsomia candida[12]、Holacanthella duospinosa[13]和Sinella curviseta[14]。Faddeeva-Vakhrusheva等[12]发表的白符䖴基因利用Falcon软件进行组装, 组装的基因组大小为221.7 Mb, 共162条scaffolds, scaffold N50的长度为6.5 Mb, 最长scaffold为28.5 Mb, GC含量为37.5%, 组装结果经BUSCO(Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs)基于节肢动物数据集(n=1 066)评估其完整性为97.0%[15]。
随着测序技术的发展, 新的组装工具层出不穷, 使3代测序数据组装基因组仍有较大的提升空间。Falcon[16]和Flye[17]为3代Pacbio数据常用的组装软件, quickmerge[18]可以合并多个软件的组装结果, 以增加组装连续性。
已发表版本的白符䖴基因组注释预测了28 734个蛋白质编码基因, 预测基因数量明显超过其他3种跳虫:Orchesella cincta(20 249)、Holacanthella duospinosa(9 911)和Sinella curviseta(23 943), 经BUSCO评估其完整性为84.0%。蛋白质编码基因可能存在一些冗余或不完整序列, 通过对注释的过程进行优化, 以提高注释的质量。
本研究利用已公开可用的PacBio(Pacific Bioscience)测序数据进行白符䖴基因组重新组装和注释, 以期提升组装的连续性和基因注释的完整性, 并进一步分析基因家族进化, 为六足动物的进化及土壤生态毒理学提供重要的基础资料和新视角。
1 材料与方法 1.1 测序数据白符䖴原始测序数据下载自NCBI数据库, 包括:PacBio(SRR2952806)、Illumina(SRR2743547)和RNA-seq(SRR935329, SRR921597)。本研究所有的数据已上传至figshare数据库(https://figshare.com/projects/Re-assemble_and_re-annotate_of_Folsomia_candida_using_public_sequencing_data/71717)。
1.2 基因组评估Illumina原始数据由BBtools v38.22[19]套件工具进行质控, 即去除重复序列(clumpify)和低质量区域(BBduk)。基因组大小、杂合度和重复序列比例等评估由GenomeScope v1.0.0[20]估算, 所需的k-mer频数分布使用khist.sh(BBtools组件之一)产生, k-mer值设置为17, k-mer最大深度范围设置为1 000。
1.3 基因组和转录组组装Pacbio数据初步组装由Flye v2.5完成。为了提升组装连续性指标, 使用quickmerge将Flye和已发表Falcon组装版本进行合并, 进一步由Pilon v1.22[21]对Illumina数据进行2轮纠错。污染序列检测利用BLAST v2.9.0[22]和HS-BLASTN v0.0.4[23]将组装结果和UniVec、NCBI核酸nt数据库进行比对, 过滤污染序列, 最终保留长度大于1 kb的序列, 获得新版本的基因组组装结果(下文简称“新版本基因组”)。基因组完整性使用BUSCO基于节肢动物数据集(n=1 066)进行评估。
转录组组装采用基于参考基因组的方法, 即使用HISAT2 v2.1.0[24]将转录组数据与新版本基因组进行比对, 并由StringTie v1.3.4[25]进行组装, 组装的结果用于下游的基因组注释。
1.4 基因组注释基因组结构注释首先是识别重复序列, 即由RepeatModeler v1.0.11[26]和RepBase(http://www.girinst.org/repbase)数据库创建重复序列数据库, 并依据该数据库通过RepeatMasker v4.0.9[27]识别重复序列。基因预测由MAKER v2.31[28]完成, 整合从头(de novo)预测、转录本和蛋白质同源等证据。从头预测利用Augustus v3.3[29]和GeneMark-ET v4.38[30]分析, 相应的基因预测训练参数由BRAKER v2.1.0[31]整合转录组数据获取。转录组证据基于StringTie的组装结果, 蛋白质同源证据基于Ensembl数据库下载的蛋白质序列(Daphnia pulex、Acyrthosiphon pisum、Drosophila melanogaster)和2种跳虫(Sinella curviseta、Orchesella cincta)的蛋白质编码基因序列。
基因的功能注释使用Diamond v0.9.18[32]比对UniProtKB(SwissProt+TrEMBL)数据库获得同源基因, 并由InterProScan v5.34-73.0[33]对Pfam[34]、PANTHER[35]、Gene3D[36]、Superfamily[37]和CDD[38]等数据库进行蛋白质域(protein domains)、基因本体(gene ontology)、通路注释(pathway annotation)的搜索。非编码核糖核酸(ncRNAs)注释由Infernal v1.1.2[39]和tRNAscan-SE v2.0[40]完成。
1.5 基因家族进化本研究对11种节肢动物进行基因家族的进化关系推断, 包括8种六足动物(Folsomia candida、Orchesella cincta、Sinella curviseta、Holacanthella duospinosa、Acyrthosiphon pisum、Drosophila melanogaster、Tribolium castaneum、Zootermopsis nevadensis)和3种非六足节肢动物(Ixodes scapularis、Strigamia maritima和Daphnia pulex), 其中I.scapularis为外群。直系同源基因由OrthoFinder v2.2.7[41]聚类, 获得单拷贝同源基因。单拷贝基因利用MAFFT v7.3[42]比对, 冗余的序列由trimAl v1.4[43]剪切。使用IQ-TREE v2[44]基于最大似然法构建系统发育树, 物种的分歧时间由R8s[45]计算, 利用CAFE v4.2[46]分析基因家族进化(扩张或收缩)历程。
2 结果与分析 2.1 基因组评估白符䖴基因组评估结果为:基因组大小255.72~258.35 Mb, 杂合度0.028%~0.134%, 重复序列长度89.30~90.22 Mb。
2.2 基因组组装Flye组装的白符䖴基因组大小为222.80 Mb, 包含144条scaffolds, 其中最长scaffold为22.06 Mb, scaffold N50为7.03 Mb。经quickmerge提升连续性、Pilon纠错以及污染去除后, 最终版本的白符䖴基因组大小为221.09 Mb, 包含113条scaffolds, 最长scaffold为30.07 Mb, scaffold N50为13.5 Mb(表 1)。
| 组装版本 Assembly version |
基因组总长度/Mb Total length |
Scaffold数量 No. of scaffolds |
Scaffold N50长度/kb Scaffold N50 length |
最长scaffold/kb Longest scaffold |
GC/% | BUSCO/%(n=1 066) | |||
| C | D | F | M | ||||||
| 新版本 New version | |||||||||
| Flye | 228.64 | 144 | 7 034 | 22 056 | 37.50 | 96.9 | 1.7 | 0.7 | 2.4 |
| Quickmerge | 222.15 | 124 | 13 530 | 30 110 | 37.48 | 96.5 | 1.4 | 0.7 | 2.8 |
| Pilon | 221.85 | 121 | 13 500 | 30 073 | 37.47 | 96.5 | 1.4 | 0.7 | 2.8 |
| 最终结果 Final genome assembly | 221.09 | 113 | 13 500 | 30 073 | 37.48 | 96.5 | 1.4 | 0.7 | 2.8 |
| 转录组组装 Transcript assembly | 33.60 | 25 971 | 1.76 | 14.03 | 40.38 | 87.0 | 4.5 | 6.3 | 6.7 |
| Faddeeva-Vakhrusheva版本[12] Faddeeva-Vakhrusheva version[12] |
|||||||||
| Falcon | 221.70 | 162 | 6 519 | 28.53 | 37.52 | 97.0 | 1.9 | 0.7 | 2.3 |
| 转录组组装 Transcript assembly | 29.54 | 38 016 | 1.16 | 6.01 | 39.94 | 81.2 | 5.5 | 11.4 | 7.4 |
| 注:C:完整的单拷贝BUSCO基因Complete and single-copy BUSCO; D:完整的多拷贝BUSCO基因Complete and duplicated BUSCO; F:不完整的BUSCO基因Fragmented BUSCO; M:缺失的BUSCO基因Missing BUSCO. | |||||||||
RepeatMasker识别出253 665条(49.33 Mb)重复序列, 占整个基因组大小的22.3%。其中重复序列数量最多的3种类型依次为:简单重复序列(simple repeat)50 375条(0.95%)、Helitron转座子9 633条(1.1%)、低复杂度序列(low complexity)5 884条(0.12%)(表 2)。
| 指标 Elements |
新版本 New version |
Faddeeva-Vakhrusheva版本[12] Faddeeva-Vakhrusheva version[12] |
| 重复序列 Repeats | ||
| 重复片段 Repeat segment | 49 334 367/22.30 | 51 606 299/23.28 |
| 脱氧核糖核酸 DNA | 9 691 017/4.35 | 9 462 341/4.27 |
| 长散在重复序列 Long interspersed elements | 2 252 705/1.02 | 1 939 306/0.87 |
| 长末端重复序列 Long terminal repeats | 2 421 736/1.09 | 2 557 166/1.15 |
| 未分类 Unclassified | 30 040 181/13.59 | 30 170 966/13.60 |
| 简单重复序列 Simple repeats | 2 103 613/0.95 | 5 080 872/2.29 |
| 短分散重复序列 Short interspersed elements | 38 531/0.02 | 22 158/0.01 |
| 其他 Others | 2 786 584/1.28 | 2 373 490/1.07 |
| 蛋白质编码基因 Protein-coding gene | ||
| 基因数No. of genes | 20 080(69.13 Mb) | 28 734(132.62 Mb) |
| 基因平均长度/bp Gene mean length | 3 442.64 | 4 615.44 |
| 外显子数 No. of exons | 143 376(38.19 Mb) | 197 859(70.64 Mb) |
| 外显子平均长度/bp Exon mean length | 266.36 | 357.02 |
| 内含子数 No. of introns | 401 165(30.34 Mb) | 524 921(61.98 Mb) |
| 内含子平均长度/bp Intron mean length | 75.63 | 118.07 |
| 注:符号“/”前数字代表长度(bp); 符号后数字代表比例(%); 括号内数字为长度(Mb)。 Note:The number before the symbol “/”represents the sequence in bp and the number after the symbol “/”represents the proportion in %. The number in parentheses are the length. | ||
MAKER预测了20 080个蛋白质编码基因, 平均每个基因包含7.14个外显子和21.03个内含子, 外显子和内含子的平均长度分别为266.36和75.63 bp。其中80.56%和96%的基因分别获得转录组和UniProt蛋白质支持, BUSCO基于节肢动物数据集(n=1 066)评估预测基因集的完整性为92.4%。InterproScan注释了16 125(80.30%)基因, 其中10 455个基因具GO(gene ontology)注释, 匹配的KEGG通路、MetaCyc和Reactome数据库分别为972、767和3 797个。
2.3.3 非编码RNA注释对于非编码核糖核酸(ncRNA), 本研究共识别出327个转运核糖核酸(tRNA)、68个核糖体核糖核酸(rRNA)、55个小核核糖核酸(snRNA)、26个小分子核糖核酸(miRNA)、5个核糖酶(ribozymess)、2个长链非编码核糖核酸(lncRNA)、119个其他非编码核糖核酸(Others)。
2.4 基因家族进化OrthoFinder将67.90%(148 089)基因分成13 979个基因家族, 平均每个基因家族包含10.6个基因, 其中345个家族发生了快速进化(扩张或收缩)事件。2 670个基因家族存于所有11个物种中, 其中699个是单拷贝基因家族。对于白符䖴, 75.7%(15 027)基因划分为8 876个基因家族, 其中48个家族发生了快速进化(扩张或收缩)事件(图 1)。较大的5个扩张基因家族包括锌指(zinc finger, 235)、羧酸酯酶(carboxylesterase, 87)、SEC14-like proteins(75)、DDE总科核酸内切酶(DDE superfamily endonuclease, 73)和胰蛋白酶(trypsin, 64)。锌指蛋白是1种转录因子, 具有广泛的生物功能, 通过结合DNA、RNA、蛋白质或小分子发挥作用[47]。羧酸酯酶属于α/β水解酶超家族, 是动物体内重要的1相药物代谢酶, 在不同种属动物体内普遍存在[48]。SEC14-like proteins是最早在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现的一类转运蛋白[49], 可以调节脂质代谢, 为高尔基体的分泌提供一个宽松的膜环境[50-53]。DDE总科核酸内切酶包含3个羧酸残基, 负责协调催化所需的金属离子[54]。胰蛋白酶具有较高的蛋白水解活性和裂解特异性, 它会将蛋白质水解为肽, 进而分解为氨基酸[55]。3种弹尾虫(Sinella curviseta、Orchesella cincta、Folsomia candida)扩张较大的基因家族具有较高的相似性, 参与解毒和药物代谢、核酸代谢、信号传导等。基因家族的进化对于跳虫适应复杂的土壤环境起重要作用, 解释了这3个种在北半球或局部区域广泛分布的原因。
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图 1 系统发育树及基因家族进化 Fig. 1 Phylogenetic tree and gene family evolution 节点的3个数字分别代表扩增、收缩、快速进化的基因家族数量。每个物种的基因家族数量如图所示。 Gain and loss are indicated with symbol + and -. Numbers of gene families for each species are shown following species name. |
本研究对白符䖴基因组进行了重新组装, 与Faddeeva-Vakhrusheva等[12]组装的版本相比, 新版本的组装连续性更好, 原因如下:原版本使用Falcon进行基因组组装, 而新版本则首先利用Flye组装, 然后经quickmerge对Flye和Falcon的组装结果进行两轮合并, 集成了两者的优点, 将原版本scaffold N50由6.52 Mb提高到13.53 Mb, 从而显著提高了组装结果的连续性[19]。由于基因组初始Flye和Falcon组装中不可避免地存在一些错误, 会一直留存至最终的组装版本中, quickmerge无法对其进行识别和矫正, 可能会对结果造成一定的影响。
基因组注释部分结果更加合理, 新版本使用MAKER共预测了20 080个蛋白质编码基因, 其中80.56%和96%的基因分别获得转录组和UniProt蛋白质等数据支持, BUSCO基于节肢动物数据集(n=1 066)评估预测蛋白编码基因完整性为92.4%, 高于原版本的84%。2种注释版本结果的差异, 主要有2个原因:1)转录组组装的结果更好。原版本利用从头组装方法进行组装, 新版本使用基于参考序列的方法进行组装。基于参考序列的组装结果更好, 低表达量的转录组可以顺利组装出来, 并且能够预测出转录本上的gap序列以及UTR区域[56]。基于从头组装的转录组结果中, 存在大量的冗余, 从而导致后续基因组注释的蛋白质编码基因数量偏多(28 734), 即有可能同一编码区域被注释为多个亚型。2)增加了2种近源物种的蛋白质参考序列。新版本预测蛋白质编码基因时, 增加了已发表的2种跳虫(Sinella curviseta和Orchesella cincta)的蛋白质信息, 相对于仅使用亲缘关系较远的3种模式生物(Daphnia pulex、Drosophila melanogaster、Acyrthosiphon pisum)来说, 预测的基因更为准确。新版本的20 080基因与已经发表的其他3种弹尾虫基因数目相近。
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