南京农业大学学报  2020, Vol. 43 Issue (6): 1024-1032   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.202001019
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高真, 张成才, 罗丽娜, 张子璇, 王将, 向增旭
GAO Zhen, ZHANG Chengcai, LUO Lina, ZHANG Zixuan, WANG Jiang, XIANG Zengxu
茅苍术二倍体及其同源四倍体的生理特征与转录组差异分析
Physiological characteristics and transcriptome differences analysis of diploid and autotetraploid of Atractylodes lancea
南京农业大学学报, 2020, 43(6): 1024-1032
Journal of Nanjing Agricultural University, 2020, 43(6): 1024-1032.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.202001019

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收稿日期: 2020-01-10
茅苍术二倍体及其同源四倍体的生理特征与转录组差异分析
高真 , 张成才 , 罗丽娜 , 张子璇 , 王将 , 向增旭     
南京农业大学园艺学院, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本文旨在探究茅苍术二倍体与同源四倍体基因表达谱差异情况,为关键调控基因定位及基因工程育种等提供参考。[方法]以二倍体及其同源四倍体茅苍术为材料,比较两者的叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白及淀粉含量等生理指标,并进行转录组测序分析。[结果]茅苍术同源四倍体叶片和茎的可溶性糖、可溶性蛋白及可溶性淀粉含量均显著高于二倍体。转录组测序结果共得到差异表达基因(DEG)4 446个,其中上调DEG为3 066个,下调DEG为1 380个;共有4 446个差异表达基因注释到GO功能库的生物进程、细胞组分与分子功能3大功能区,与细胞组分、代谢过程、酶催化活性等密切相关。通路(Pathway)分析发现,茅苍术二倍体与同源四倍体在碳水化合物代谢、氨基酸代谢、氨基酸生物合成、氨酰-tRNA生物合成等途径差异显著。差异转录因子分析发现,同源四倍体植株中MYB转录因子家族表达量显著高于二倍体。[结论]叶绿素含量较高导致同源四倍体植株叶色更深;更高含量的可溶性蛋白、可溶性糖与淀粉能够为四倍体植株提供更多的能量,使叶片变大变厚;参与碳水化合物代谢和氨基酸合成、代谢等通路的差异表达基因与四倍体植株在表型、生理上的变化有关;MYB转录因子的差异表达导致二倍体和同源四倍体在外观性状、生理特征、抗逆抗胁迫等方面的差异。
关键词茅苍术   二倍体   同源四倍体   生理特征   转录组测序   差异表达基因   
Physiological characteristics and transcriptome differences analysis of diploid and autotetraploid of Atractylodes lancea
GAO Zhen, ZHANG Chengcai, LUO Lina, ZHANG Zixuan, WANG Jiang, XIANG Zengxu    
College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] The purpose of this study was to explore the difference of gene expression profiles between diploid and autotetraploid of Atractylodes lancea, and provide reference for key regulatory gene location and gene engineering breeding. [Methods] The diploid and autotetraploid of A. lancea were used as materials to compare their physiological indexes, such as chlorophyll, soluble sugar, soluble protein and starch contents, and analyze their transcriptome sequencing. [Results] The contents of soluble sugar, soluble protein and soluble starch in leaf and stem of autotetraploid of A. lancea were significantly higher than those in the counterparts of diploid. The results of transcriptome sequencing showed that there were 4 446 differentially expressed genes(DEG), of which 3 066 were up regulated and 1 380 were down regulated. 4 446 DEG were annotated into the three functional areas of GO library, including biological process, cell component and molecular function, which were closely related to cell component, metabolic process and enzyme catalytic activity. Pathway analysis showed that there were significant differences between diploid and autotetraploid plants in carbohydrate metabolism, amino acid metabolism, amino acid biosynthesis, aminoacyl tRNA biosynthesis and other pathways. The analysis of the different transcription factors showed that the amount of MYB transcription factor family in autotetraploid plants was significantly higher than that in diploid plants. [Conclusions] The higher content of chlorophyll leads to the deeper leaf color of autotetraploid plants; the higher contents of soluble protein, soluble sugar and starch can provide more energy for the autotetraploid plants and make the leaves larger and thicker; the DEG involved in carbohydrate metabolism, amino acid synthesis, metabolism and other pathways is related to the phenotypic and physiological changes of the autotetraploid plants. The differential expression of MYB transcription factors leads to the differences in appearance, physiological characteristics, stress resistance and other aspects between diploid and tetraploid, but the specific differences between them need further experimental study.
Keywords: Atractylodes lancea    diploid    autotetraploid    physiological characteristics    transcriptome sequencing    differentially expressed genes(DEG)   

茅苍术[Atractylodes lancea(Thunb.)DC]为菊科苍术属多年生植物, 以干燥根茎入药, 具有燥湿健脾, 祛风散寒, 明目等功效[1]。江苏茅山及周边地区是茅苍术的道地产区, 其质量和疗效备受历代医家推崇[2-3]。药理研究发现,茅苍术具有抗缺氧、抗血糖、抗菌、抗病毒等作用[4]。近年来, 由于其适生环境的变化和滥采滥挖等导致茅苍术野生资源濒临枯竭, 进行茅苍术的育种研究对保存其种质资源具有重要意义。

多倍体药用植物具有活性成分含量高、抗逆性强等特点, 多倍体育种是药用植物新品种选育的重要手段[5]。陈桂平等[6]研究发现, 四倍体菘蓝与其二倍体相比, 根中氨基酸含量显著提高, 其中精氨酸可能为菘蓝根中发挥药效的主要氨基酸。李雅婷等[7]发现, 甜叶菊四倍体能够有效利用弱光和低浓度CO2, 抗逆性更强。南京农业大学园艺学院中药学生物技术实验室前期通过离体诱导与鉴定, 建立了茅苍术同源四倍体株系, 其形态特征变异明显, 表现出叶片变大变厚、叶色深绿、气孔变大等特征[8], 为选育优质高产茅苍术新品种提供了材料。目前, 对于茅苍术同源四倍体的生理指标及其变异机制等研究还鲜见报道。

利用转录组测序技术可以获得特定器官组织在特定条件下的全部转录本信息[9], 该技术现已成为研究差异基因表达的重要技术手段[10]。目前, 转录组测序在药用植物领域应用十分广泛, 如人参[11]、西洋参[12]、丹参[13]、甘草[14]等多种药用植物都已获得转录组分析数据。本研究以茅苍术为试验材料, 建立无菌系进行离体诱导、鉴定得到同源四倍体试管苗, 分析比较茅苍术二倍体及其同源四倍体的生理指标, 并采用BGISEQ-500测序技术进行转录组学的测序分析, 探讨四倍体产生的基因谱表达变化及性状变异, 旨在为关键调控基因定位及基因工程育种等研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

供试材料为茅苍术[Atractylodes lancea(Thunb.)DC]二倍体及其同源四倍体组培苗, 来自南京农业大学园艺学院中药学生物技术实验室。组培室内温度维持在25 ℃, 光周期为光照14 h/黑暗10 h。选取继代60 d生长健壮的二倍体和四倍体茅苍术组培苗, 转接到生根培养基(1/2MS+0.5 mg·L-1NAA)上, 生根后20 d进行生理指标的测定及转录组测序。

随机选取二倍体和四倍体组培苗各5株, 测定叶片和茎叶绿素含量, 重复3次。同时, 分别随机选取5株, 采集叶片和茎, 重复3次, 取样后迅速放入-80 ℃冰箱保存, 用于可溶性糖、可溶性蛋白、可溶性淀粉含量测定。

1.2 茅苍术同源四倍体诱导与鉴定

取茅苍术二倍体幼芽进行离体诱导, 并经根尖染色体鉴定获得同源四倍体, 具体操作步骤参考王红娟[8]的方法, 并适当修改。取待鉴定植株根尖1.0~1.5 cm, 经0.002 mol·L-1 8-羟基喹啉预处理4 h, 4 ℃卡诺氏固定液固定24 h, 1 mol·L-1盐酸60 ℃水浴下解离6~8 min, 卡宝品红染色8~15 min, 最后压片镜检。

1.3 生理指标测定

采用CCM-200 PLUS叶绿素测定仪测定茅苍术叶绿素含量; 可溶性糖含量采用蒽酮比色法[15]; 可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法[15]; 可溶性淀粉含量采用计禹[16]的方法。

1.4 转录组测序

采用快速通用植物提取试剂盒提取和纯化茅苍术二倍体及其同源四倍体试管苗全株总RNA, 分别用NanoDropTM和Agilent RNA 6000 Nano Kit进行总RNA的浓度和纯度检测, 由武汉华大基因股份有限公司通过BGISEQ-500平台进行转录组测序分析。

1.5 数据处理

通过对raw reads进行过滤, 获得高质量的clean reads。由于茅苍术没有相应的参考基因组序列, 本研究运用Trinity软件[17]对clean reads进行组装, 利用TGICL软件[18]对转录本聚类去冗余, 得到Unigene作为后续分析的参考序列。

1.6 差异基因GO分类和KEGG分析

采用log2(Fold Change)≥2.00, Adj. P value≤0.01筛选差异基因, 基于负二项分布原理进行差异表达基因检测。根据差异基因检测结果, 通过Blast2GO软件[19]获得茅苍术每个样本基因的GO注释并进行统计; 采用KOBAS软件[20]对检测到的差异基因进行KEGG通路分类以及富集分析。

2 结果与分析 2.1 茅苍术二倍体及其同源四倍体染色体

通过根尖染色体鉴定发现, 茅苍术二倍的体染色体数目为2n=2x=24, 同源四倍体染色体的数目为2n=4x=48(图 1)。

图 1 茅苍术根尖细胞的染色体鉴定 Fig. 1 The chromosome identification of root tip cells in Atractylodes lancea
2.2 茅苍术二倍体及其同源四倍体的生理指标

表 1可见:茅苍术同源四倍体叶片和茎的可溶性糖、可溶性蛋白及可溶性淀粉含量均显著高于二倍体, 其中叶片可溶性糖、可溶性淀粉含量分别比二倍体高65.30%、59.76%, 可溶性蛋白与叶绿素含量则分别比二倍体高38.70%和35.08%;不同组织间可溶性糖、可溶性蛋白及可溶性淀粉含量差异不显著, 但同源四倍体茎和叶片的叶绿素含量差异显著。

表 1 茅苍术二倍体及其同源四倍体茎、叶片不同生理指标对比 Table 1 Comparison of different physiological indexes in stem and leaf of diploid and autotetraploid of Atractylodes lancea mg·g-1
材料
Material
组织
Tissue
叶绿素含量
Chlorophyll content
可溶性蛋白含量
Soluble protein content
可溶性糖含量
Soluble sugar content
可溶性淀粉含量
Soluble starch content
二倍体
Diploid
茎 Stem 20.83±0.35a 8.43±0.25a 5.50±0.30a 4.23±0.25a
叶 Leaf 24.07±0.31ab 8.87±0.15a 5.03±0.15a 4.53±0.25a
同源四倍体
Autotetraploid
茎 Stem 24.87±0.40ab 14.20±0.30b 8.67±0.35b 6.60±0.20b
叶 Leaf 33.03±0.15c 14.90±0.10b 9.23±0.25b 6.57±0.51b
注:同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。
Note:Different letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.
2.3 茅苍术二倍体及其同源四倍体的测序结果

对供试样品进行转录组测序, 有效数据统计如表 2所示, 经过原始数据处理共获得42.31 Gb数据, 各样品Q30均在86%以上, 有效碱基比例在87%以上, GC含量均在41%以上。利用Trinity软件对clean reads进行合并组装、去冗余后共得到132 097个Unigene, 平均长度为1 156 bp。这些数据表明茅苍术二倍体及同源四倍体的转录组组装效果较好。

表 2 有效数据评估统计 Table 2 Valid data evaluation statistics
材料
Material
样本
Sample
原始reads数/Mb
Number oforiginal reads
过滤后reads总数/Mb
Total readsafter filtering
过滤后的碱基总数/Gb
Total bases numberafter filtering
Q20/% Q30/% 有效碱基比例/%
Effective basesratio
GC含量/%
GCcontent
二倍体
Diploid
1 49.83 43.86 6.58 96.38 86.80 88.02 41.90
2 50.32 44.03 6.60 96.48 87.16 87.49 42.01
3 57.67 50.80 7.62 97.39 89.19 88.08 41.54
同源四倍体
Autotetraploid
1 50.76 45.19 6.78 97.31 88.94 89.03 41.92
2 54.46 48.62 7.29 97.23 88.67 89.29 41.90
3 56.21 49.60 7.44 97.34 89.04 88.23 41.92
注:Q20:测序质量值大于20的碱基所占比例; Q30:测序质量值大于30的碱基所占比例; GC含量:在所研究的对象中鸟嘌呤和胞嘧啶所占比例。
Note:Q20:The ratio of bases with sequencing quality value greater than 20;Q30:The ratio of bases with sequencing quality value greater than 30;GC content:The ratio of guanine and cytosine in the research objects.
2.4 茅苍术二倍体及其同源四倍体的差异表达基因

图 2可见:对茅苍术二倍体及其同源四倍体的差异表达基因(DEG)数进行统计, 共计有4 446个基因存在差异表达, 其中, 上调表达基因数为3 066个, 下调表达基因数为1 380个, 上调DEG数显著高于其下调DEG数。

图 2 茅苍术同源四倍体与二倍体差异表达基因的火山图 Fig. 2 The volcano map of differentially expression genes between autotetrapliod and dipliod of Atractylodes lancea
2.4.1 差异表达基因GO功能分析

为了对比茅苍术二倍体及其同源四倍体之间差异表达基因的生物学功能, 将差异表达基因进行GO分析。由表 3可知:4 446个差异表达基因被GO注释, 包括生物学过程、细胞组分以及分子功能3大类别, 分别占总DEG的30.92%、44.01%和25.07%。其中, 在生物学过程中, 差异表达基因注释了24种功能, 主要功能有细胞过程(1 312, 29.53%)、代谢过程(1 240, 27.91%)和生物调控(355, 8.00%); 在细胞组分中, 差异表达基因注释了16种功能, 且多与细胞和机体的构建有关, 如细胞(870, 19.57%)、细胞成分(858, 19.30%)和细胞膜(714, 16.08%); 而在分子功能中, 差异表达基因注释了13种功能, 主要功能为催化活性(1 921, 43.21%)、结合(1 957, 44.03%)以及转运活性(234, 5.28%)。由以上数据可知, 茅苍术二倍体与其同源四倍体之间差异表达基因注释的功能均与生长发育以及细胞代谢活动等方面有关。

表 3 差异表达基因的GO功能分布 Table 3 GO function distribution of differentially expressed genes(DEG)
一级分类
Classify 1
二级分类
Classify 2
所有基因数
All gene number
差异表达基因数
DEG number
比例/%
Ratio
生物学过程
Biological process
细胞过程 Cellular process 7 172 1 312 29.53
代谢过程 Metabolic process 6 780 1 240 27.91
生物调控 Biological regulation 1 944 355 8.00
生物过程调控 Regulation of biological process 1 730 316 7.12
定位 Localization 1 555 284 6.40
细胞组分或生物合成 Cellular component organization or biogenesis 1 368 250 5.63
胁迫应答 Response to stimulus 1 366 249 5.62
信号传导 Signaling transduction 460 84 1.89
发育过程 Developmental process 355 64 1.46
多细胞生物过程 Multicellular organismal process 329 60 1.35
生物过程的负调节 Negative regulation of biological process 271 49 1.12
生殖 Reproduction 217 39 0.89
生殖过程 Reproductive process 217 39 0.89
生物过程的正调节 Positive regulation of biological process 212 38 0.87
多有机体过程 Multi-organism process 149 27 0.61
生长 Growth 79 14 0.33
免疫系统过程 Immune system process 41 3 0.17
解毒 Detoxification 18 3 0.07
节律过程 Rhythmic process 10 2 0.04
细胞增殖 Cell proliferation 9 2 0.03
运动 Locomotion 3 1 0.01
生物附着 Biological adhesion 2 1 0.01
氮素利用 Nitrogen utlization 2 1 0.01
碳素利用 Carbon utlization 1 1 0.01
细胞组分
Cellular component
细胞 Cell 6 767 870 19.57
细胞部位 Cell part 6 674 858 19.30
细胞膜 Membrane 5 560 714 16.08
细胞膜部位 Membrane part 5 065 651 14.65
细胞器 Organelle 4 736 609 13.70
细胞器部位 Organelle part 2 362 303 6.83
高分子复合物 Macromolecular complex 2 292 294 6.63
膜封闭腔 Membrane-enclosed lumen 631 80 1.82
胞外区 Extracellular region 124 16 0.36
超分子复合物 Supramolecular complex 98 12 0.28
细胞连接点 Cell junction 84 10 0.24
共质体 Symplast 83 10 0.24
病毒体 Virion 37 4 0.11
病毒体部分 Virion part 37 4 0.11
胞外区部位 Extracellular region part 17 2 0.05
拟核 Nucleoid 10 2 0.03
分子功能
Molecular function
结合Binding 8 674 1 957 44.03
催化活性 Catalytic activity 8 512 1 921 43.21
转运活性 Transporter activity 1 040 234 5.28
结构分子活性 Structural molecule activity 478 108 2.43
转录调节活性 Transcription regulator activity 355 80 1.80
分子功能调节剂 Molecular function regulator 219 48 1.11
信号传导活性 Signal transducer activity 195 44 0.99
抗氧化活性 Antioxidant activity 119 26 0.60
分子载体活性 Molecular carrier activity 81 18 0.41
营养库活性 Nutrient reservoir activity 20 4 0.10
分子传感器活性 Molecular transducer activity 5 1 0.03
蛋白质标签 Protein tag 1 1 0.01
翻译调节器活性 Translation regulator activity 1 1 0.01
2.4.2 差异表达基因KEGG分析

表 4所示:茅苍术二倍体及其同源四倍体共有47 098个基因注释到5大类特定的KEGG通路中, 分别为细胞过程(4.88%)、环境信息处理(5.99%)、遗传信息处理(23.62%)、代谢机制(61.65%)和组织系统(3.86%)。其中, 在代谢机制中差异表达基因被注释到的数目最多, 占所有被注释差异表达基因的61.65%, 共注释11个亚类, 主要为全局路径(23.60%)、碳水化合物代谢(10.14%)、氨基酸代谢(5.42%)、脂质代谢(4.56%)、能量代谢(3.67%)等。另外, 在翻译(8.71%), 折叠、分类和降解(7.75%), 运输和分解代谢(4.88%), 信号传导(4.82%), 转录(4.81%)和环境适应(3.86%)等代谢通路也注释了较多的差异表达基因。根据差异表达基因在KEGG中的注释结果, 共有25条代谢通路显著富集(P<0.05)(表 5)。其中氨基酸的生物合成(ko01230), 氨酰-tRNA生物合成(ko00970), 同源重组(ko03440), 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(ko00260)和脂肪酸代谢(ko01212)等代谢通路差异表达基因的数目较多。而氨基酸的生物合成(ko01230)、柠檬酸循环(TCA循环)(ko00020)以及糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定生物合成(ko00563)等通路的差异基因显著性最为明显。

表 4 差异表达基因的KEGG功能注释分布表 Table 4 Distribution of KEGG functional annotation of DEG
一级分类
Classify 1
二级分类
Classify 2
所有基因数
All genenumber
差异表达基因数
DEGnumber
比例/%
Ratio
细胞过程 Cellular processes 运输和分解代谢 Transport and catabolism 2 302 199 4.88
环境信息处理
Environmental information processing
信号传导 Signal transduction 2 271 214 4.82
跨膜运输 Membrane transport 549 52 1.17
遗传信息处理
Genetic information processing
翻译 Translation 4 100 387 8.71
折叠、分类和降解 Folding, sorting and degradation 3 652 344 7.75
转录 Transcription 2 265 213 4.81
复制和修复 Replication and repair 1 106 104 2.35
代谢机制 Metabolism 全局路径 Global and overview maps 11 115 1 049 23.60
碳水化合物代谢 Carbohydrate metabolism 4 776 450 10.14
氨基酸代谢 Amino acid metabolism 2 554 240 5.42
脂质代谢 Lipid metabolism 2 150 202 4.56
能量代谢 Energy metabolism 1 727 163 3.67
辅酶和维生素代谢 Metabolism of cofactors and vitamins 1 576 148 3.35
其他次生代谢的生物合成
Biosynthesis of other secondary mtabolism
1 446 136 3.07
其他氨基酸代谢 Metabolism of other amino acids 1 190 112 2.53
聚糖生物合成与代谢 Glycan biosynthesis and metabolism 948 89 2.01
萜类化合物和聚酮类化合物的代谢
Metabolism of terpenoids and polyketides
853 80 1.81
核苷酸代谢 Nucleotide metabolism 702 66 1.49
组织系统 Organismal systems 环境适应 Environmental adaptation 1 816 171 3.86
表 5 差异表达基因的KEGG Pathway富集分析 Table 5 Analysis of KEGG pathway enrichment of DEG
ID 代谢通路
Pathway name
差异表达基因数
DEG number
P
P value
ko01230 氨基酸的生物合成 Biosynthesis of amino acids 2 393 0.000 0
ko00970 氨酰-tRNA生物合成 Aminoacyl-tRNA biosynthesis 773 0.002 3
ko03440 同源重组 Homologous recombination 687 0.001 4
ko00260 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 Glycine, serine and threonine metabolism 664 0.007 6
ko01212 脂肪酸代谢 Fatty acid metabolism 616 0.004 5
ko01210 2-氧羰基水杨酸代谢 2-oxocarboxylic acid metabolism 564 0.029 4
ko00400 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成 Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis 516 0.023 8
ko00020 柠檬酸循环(TCA循环) Citrate cycle(TCA cycle) 510 0.000 1
ko00511 其他聚糖降解 Other glycan degradation 507 0.001 1
ko00051 果糖和甘露糖代谢 Fructose and mannose metabolism 472 0.004 3
ko03050 蛋白酶体 Proteasome 466 0.011 1
ko00250 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 Alanine, aspartate and glutamate metabolism 402 0.002 2
ko00061 脂肪酸生物合成 Fatty acid biosynthesis 370 0.032 7
ko00592 α-亚麻酸代谢 Alpha-linolenic acid metabolism 356 0.004 8
ko00220 精氨酸生物合成 Arginine biosynthesis 324 0.031 8
ko00531 糖胺聚糖降解 Glycosaminoglycan degradation 310 0.001 9
ko00563 糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定生物合成 Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-anchor biosynthesis 300 0.000 1
ko00604 神经节苷脂生物合成系列 Glycosphingolipid biosynthesis-ganglio series 264 0.016 6
ko00780 生物素代谢 Biotin metabolism 195 0.011 9
ko00909 倍半萜和三萜生物合成 Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis 191 0.031 1
ko00300 赖氨酸生物合成 Lysine biosynthesis 154 0.011 9
ko00261 单杆菌胺生物合成 Monobactam biosynthesis 128 0.002 0
ko00750 维生素B6代谢Vitamin B6 metabolism 96 0.042 4
ko00902 单萜生物合成 Monoterpenoid biosynthesis 82 0.003 6
2.5 茅苍术二倍体及其同源四倍体的差异转录因子

为进一步分析茅苍术染色体加倍后转录因子表达水平变异情况, 对二倍体和四倍体茅苍术进行了转录因子功能预测。由图 3可见:与转录因子相关的差异基因共1 821个(FC>1.5, FDR<0.05), 编码57种转录因子。其中, 编码MYB转录因子的差异表达基因数最多, 为192个, 编码bHLH、C3H转录因子的基因数次之, 分别为176和124个, 其中MYB转录因子上调73个, 下调11个。

图 3 差异表达基因所属转录因子家族分类 Fig. 3 Family classification of transcription factors of DEG
3 讨论

多倍体药用植物通常具有抗逆性强、药用成分含量高等特点, 外观性状则表现为根、茎、叶、花、果实的巨大型。本研究比较了茅苍术二倍体及其同源四倍体的生理指标, 发现与二倍体相比, 茅苍术四倍体植株的叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白以及可溶性淀粉含量均显著高于二倍体。说明茅苍术染色体加倍后不仅外观性状发生了改变, 生理指标也有显著变化, 这与周玉丽等[21]的研究结果一致。同时, 这些生理指标的差异可能是其外观性状产生变化的主要原因, 叶绿素含量较高可能导致同源四倍体植株叶色更深绿, 叶片光合作用更强, 能够合成更多淀粉, 为植株提供更多能量, 而可溶性蛋白与可溶性糖也会提供更多能源物质, 最后使四倍体植株的叶片变大变厚。

转录组能够揭示植物生长发育、生理代谢活动的分子机制, 对了解植物基因表达情况、挖掘关键基因具有非常明显的优势, 对于茅苍术这类未完成基因组测序的物种来说, 转录组测序已成为研究其基因和功能的重要手段之一[22]。研究表明, 基因表达是细胞生命活动调控机制的核心[23], 而基因表达的改变往往是引起植物表型及生理状态发生变异的主要原因。本研究以茅苍术二倍体及其同源四倍体共6个样品为材料进行转录组测序分析, 已知差异基因表达量的变化是同源四倍体茅苍术变异的分子基础, 通过对二倍体和四倍体茅苍术的差异表达基因进行分析发现, 共有4 446个差异表达基因参与表达, 上调DEG数为3 066个, 下调DEG数为1 380个。GO分析表明, 四倍体与二倍体的差异表达基因主要集中在生物学过程和细胞组分2个功能区, 对分子功能区的调控相对不大。李萌等[24]发现胁迫应答、生物调控、发育、生长过程和免疫系统5个过程在GO功能分析中差异基因显著。本研究通过GO Ontology分析发现, 在结合、催化活性、细胞过程、代谢过程等过程中差异基因显著富集, 说明四倍体植株在生长发育、细胞代谢活动等方面与其二倍体存在差异。

基于KEGG功能注释结果发现, 差异基因在碳水化合物、氨基酸代谢、脂质代谢和能量代谢等代谢通路显著上调表达, 在酸枣的KEGG通路分析发现, 差异基因显著富集在碳水化合物、氨基酸代谢、信号传递、植物激素信号转导和淀粉及蔗糖代谢方面显著上调表达, 表明KEGG路径在不同倍性材料之间有较大不同[24]。本研究中, 与二倍体相比, 茅苍术同源四倍体植株更粗壮, 叶片也更大更厚, 在其生长发育的过程中细胞生长、分裂、代谢活动更为旺盛, 需要消耗更多的能源物质以维持自身正常生命活动运转, 这也是差异基因在能量代谢途径显著富集的原因。碳水化合物代谢与氨基酸代谢注释了较多差异表达基因, 其中碳水化合物代谢过程中的淀粉、可溶性糖等都能为植株生长提供能量, 而氨基酸代谢方面丙氨酸与叶绿素合成, 与调节气孔开放有关[25]; 并且氨基酸代谢方面的氨酰-tRNA是蛋白质生命合成保真性的关键之一[26], 在生物体合成蛋白质过程中发挥着重要作用, 以满足自身生命活动的需要。通过对不同倍性茅苍术的差异基因进行Pathway富集分析发现, 差异基因多集中在糖类物质代谢方面。在果糖和甘露糖代谢途径中发现135个基因上调表达, 与氨基糖、核苷糖和糖胺聚糖等糖类物质代谢相关的基因也有上调表达, 在糖胺聚糖降解和其他聚糖降解代谢途径中, 相关差异基因则下调表达。这些参与糖类代谢基因的表达改变, 可能就是二倍体和四倍体抗逆性发生改变的基础。不同倍性茅苍术的差异基因还在许多次生代谢途径上富集, 柠檬酸循环(TCA循环)、赖氨酸生物合成途径基因上调, 倍半萜和三萜生物合成、维生素B6代谢途径相关基因则下调。

作为调控下游功能基因的重要因子, 转录因子可以通过激活或抑制其他基因的转录, 调控基因表达以改变植株性状。其中, MYB类转录因子是植物体内最大的转录因子家族之一, 通过调控功能基因的表达, 在植物抗逆抗胁迫过程中起着重要的作用[27]。目前, 有关MYB家族基因的研究已在许多植物中得到研究报道, 如莲藕[28]、棉花[29]等。除了能够抗逆抗胁迫之外, MYB转录因子在次生代谢[30]、植物生长发育[31]等方面也起到非常重要的作用。本研究通过分析茅苍术二倍体及其同源四倍体的差异转录因子发现, 四倍体植株中编码MYB转录因子的基因表达量显著高于二倍体, 且基因数最多。四倍体在表型和生理方面的变异特征可能与编码MYB转录因子上调表达有关, 说明MYB转录因子的差异表达导致茅苍术同源四倍体比二倍体具有更强的抗逆性, 这一结果与前人在菘蓝[32]、酸枣[24]四倍体变异研究中的结果一致。因此, 今后应该进一步对茅苍术四倍体的抗逆性、次生代谢和生长发育特征进行研究。

本研究以茅苍术二倍体及其同源四倍体为材料, 利用转录组测序技术并结合两者的生理特征, 分析同源四倍体产生的基因表达变化, 发现两者在外观性状、生长发育以及抗逆抗胁迫等方面存在差异, 以上结果可为进一步定位关键调控基因及基因工程育种等奠定基础。

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