水稻恶苗病是水稻上的重要病害, 自1828年在日本首次报道以来, 几乎在世界各水稻种植区均有发生, 是影响水稻生产的重要病害之一^[1]。水稻恶苗病在我国分布较广泛, 在各稻区均造成不同程度危害^[2-5]。水稻恶苗病一般会造成减产10%~20%, 严重时减产50%以上^[6]。水稻恶苗病的病原菌有藤仓镰孢(Fusarium fujikuroi)、层出镰孢(F.proliferatum)、拟轮枝镰孢(F.verticilliodes)和F.andiyazi, 其中藤仓镰孢致病力最强, 分布最广, 是引起水稻恶苗病的主要致病菌。水稻恶苗病在水稻苗期的症状有徒长、叶片细长呈淡绿色、矮化、死苗等, 在成株期引起根部和茎基部腐烂, 严重时整株枯死^[7]。

带菌种子是恶苗病的主要初始菌源, 不仅影响种子的质量和萌发率, 带菌稻种播种后, 还会引起秧苗发病。恶苗病菌在病苗上产生分生孢子, 分生孢子随风雨传播, 侵染健康植株使其发病, 引起再侵染^[8-9]。因此做好种子带菌检测, 对指导该病防治有重要意义。传统的种子带菌常用检测方法有:水琼脂平皿法、吸水纸保湿法、水洗法和分离培养法。这些检测方法耗时长, 对所获得分离物需要依据形态和生物学特征进行鉴定, 对相近种极易造成鉴定失误^[10-11]。一些常规的分子检测技术, 如普通PCR、实时荧光定量PCR等, 极大地提高了种子带菌检测的效率和准确性, 但这些技术仍存在某些不足, 如所需反应时间长、对DNA模板质量要求高、需要昂贵的仪器等, 不能满足基层检测的需求^[12-13]。自21世纪初建立并发展起来的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术具有灵敏度高、特异性强、反应时间短、结果可肉眼判别、对模板质量要求低和成本低廉等优点^[14-15]。

目前对当前江苏省水稻种子携带恶苗病菌的状况及其病原菌种类组成仍知之甚少。南京农业大学卵菌与真菌分子生物学实验室(以下简称本实验室)曾对从江苏省收集的65份稻种携带恶苗病菌情况进行过检测^[16], 但由于所检测稻种样本数量偏小, 种子来源地偏少, 且种子的生产年份不详, 仍不足以准确反映江苏省稻区当前水稻种子携带恶苗病菌的状况。本研究应用本实验室建立的能够特异性检测藤仓镰孢、层出镰孢、拟轮枝镰孢、F.andiyazi的4个LAMP技术体系和可快速检测水稻种子携带恶苗病菌的LAMP检测方法, 对江苏省13个地区2017年收获的103份水稻种子携带的恶苗病菌进行检测, 旨在了解江苏当前水稻栽培品种种子携带恶苗病菌的状况及所携带病原菌的种类组成, 研究结果将为该病的防治提供有价值的参考。

1 材料与方法 1.1 供试品种

2018年3至5月收集江苏省2017年收获的103份水稻种子, 品种和来源地见表 1。收集的稻种用牛皮纸袋分装, 并用密封袋封口保存, 编号记录品种和种子产地信息。

1.2 供试水稻种子携带恶苗病菌的DNA提取

采用本实验室建立的水洗法^[16]。将供试稻种混匀后, 每份称取50 g放入250 mL的三角瓶中, 加入200 mL ddH₂O, 滴加20%吐温3~5滴。锡箔纸封口, 放入超声波清洗器内, 以40 kHz的频率振荡洗涤10 min。将洗涤液用75 μm孔径的钢筛过滤至干净的空瓶中, 并用少量的ddH₂O冲洗稻种。滤液经6 500 r · min^-1离心5 min, 弃上清液, 保留沉淀。将沉淀物放置在37 ℃的烘箱中烘干。沉淀物DNA提取采用美国MOBIO公司的微生物DNA提取试剂盒(PowerSoil^Ⓡ DNA Isolation Kit), 方法步骤参照说明书。

1.3 水稻种子携带恶苗病菌的LAMP检测

采用本实验室建立的可分别特异性识别藤仓镰孢、层出镰孢、拟轮枝镰孢和F.andiyazi的LAMP检测技术^[17-19], 以1.2节提取的基因组DNA为模板进行检测。

LAMP反应的总体积为26 μL, 其中:10×ThermoPol Buffer[0.1% Trion-X, 20 mmol · L^-1 Tris-HCl, 10 mmol · L^-1 KCl, 10 mmol · L^-1(NH₄)₂SO₄, pH8.8]2.5 μL, MgSO₄(50 mmol · L^-1)4 μL, 甜菜碱(5 mol · L^-1) 4 μL, dNTPs(10 mmol · L^-1)3.5 μL, 内引物FIP和BIP(20 μmol · L^-1)各2 μL, 外引物F3和B3(10 μmol · L^-1)各0.5 μL, 环引物LF和LB(10 μmol · L^-1)各1 μL, HNB(2.4 mmol · L^-1)2 μL, Bst DNA聚合酶(8 U · μL^-1)1 μL, 模板DNA 2 μL(从水稻种子样本提取)。反应结束后肉眼观察指示剂颜色变化来判断检测结果, 阴性呈紫色, 阳性呈天蓝色。阴性对照以ddH₂O替代DNA模板, 阳性对照以病原菌纯培养的DNA作为模板。试验重复3次。

4种水稻恶苗病菌的LAMP反应条件和灵敏度:藤仓镰孢、层出镰孢和拟轮枝镰孢的反应条件为62 ℃ 70 min, 检测灵敏度分别为100、400和100 pg · μL^-1; F.andiyazi的反应条件为64 ℃ 80 min, 灵敏度为100 pg · μL^-1。

1.4 LAMP检测稻种带菌结果的验证

为验证LAMP检测水稻种子上携带恶苗病菌的结果, 选择藤仓镰孢、层出镰孢、拟轮枝镰孢和F.andiyazi呈阳性的样本播种。将稻种混匀后, 每个品种称取10 g置于培养皿中, 常温下用ddH₂O浸泡18 h, 随后将种子转移至28 ℃恒温培养箱直到稻种露白。将露白的稻种播种在直径为10 cm的塑料盆中, 每盆播种30~40粒, 放置在28 ℃、12 h光暗交替的温室中培育14 d。选取疑似水稻恶苗病(徒长、褪绿、矮化和死苗)的稻苗10株, 剪取根茎部0.5 cm大小的组织, 混匀后分为2份。一份用来提取DNA进行LAMP检测, 另一份用体积分数为70%的乙醇消毒30 s, 再用2%次氯酸钠消毒2.5 min, 无菌水冲洗3次。将表面消毒的病组织置于PDA培养基平板上, 在25 ℃黑暗条件下培养48 h, 从菌落边缘切取2 mm× 2 mm菌丝块移至新的PDA培养基上纯化, 获得纯培养分离物。秧苗病组织和病原菌分离物基因组DNA提取方法采用天根生化科技(北京)有限公司的新型植物基因组DNA提取试剂盒。病原菌分离物依据其形态和TEF- 1α 序列比对进行种的鉴定。试验重复3次。

2 结果与分析 2.1 江苏省水稻种子携带水稻恶苗病菌的LAMP检测结果

应用可分别特异性识别4种水稻恶苗病菌的LAMP检测技术, 用水洗法^[16]提取水稻种子上携带病菌的基因组DNA为模板, 对江苏省13个地区2017年收获的103份水稻种子上携带的恶苗病菌进行检测。以品种‘盐粳15’种子带菌检测结果为例(图 1), 反应结果呈紫色为阴性, 蓝色为阳性, 通过肉眼观察可直接判定‘盐粳15’供试稻种上同时携带藤仓镰孢、层出镰孢和拟轮枝镰孢3种病原菌。

供试103个水稻品种的种子样本中, 有89个品种携带水稻恶苗病菌(表 1), 带菌率占总样本的86.4%, 表明当前江苏省稻种携带恶苗病菌十分普遍。在供试稻种样本中, 4种恶苗病菌均被检测到, 但不同恶苗病菌出现频率有差异。其中, 检出率最高的病原菌是藤仓镰孢, 有86份样本携带该菌, 其次是层出镰孢16份, 拟轮枝镰孢和F.andiyazi各有2份, 检出率依次为83.5%、15.5%、1.9%和1.9%。

103份种子携带恶苗病的状况大致包括以下4种类型:1)仅携带1种病原菌。仅携带藤仓镰孢的品种有73份, 占所检测总样本的70.9%;仅携带层出镰孢的品种有3份, 占所检测总样本的2.9%。2)携带2种病原菌。同时携带藤仓镰孢和层出镰孢的有11份; 携带藤仓镰孢和F.andiyazi有1份(无锡的‘武运粳31’)。3)携带3种病原菌。同时携带藤仓镰孢、层出镰孢和拟轮枝镰孢的有1份(‘盐粳15’)。4)携带4种水稻恶苗病菌有1份(镇江的‘镇稻21’)。

从检测结果可以看出, 有部分稻种可同时携带不止一种恶苗病菌, 在供试的103份稻种中, 有14份携带2种或2种以上水稻恶苗病菌, 占总样本数的13.6%。此外, 有14份稻种未检测到携带恶苗病菌。

2.2 LAMP检测稻种上携带水稻恶苗病菌的分离结果

为验证LAMP检测水稻种子带菌结果的准确性, 我们选取6个品种进行播种育苗, 包括:1)不携带恶苗病菌的‘华粳8号’作为对照; 2)只携带藤仓镰孢的‘镇稻14号’、仅携带层出镰孢的‘连粳12’和‘徐稻8’; 3)同时携带藤仓镰孢和层出镰孢的‘镇稻99’; 4)4种病原菌都携带的‘镇稻21’。从表 2可以看出:除‘镇稻21’外, 其余5个品种发病秧苗的LAMP检测结果和病原菌分离结果及种子带菌的检测结果一致。而‘镇稻21’发病秧苗病组织的LAMP检测和病原菌分离结果有差异, LAMP检测出除拟轮枝镰孢外的其他3种病原菌, 但从病组织中只分离出藤仓镰孢和层出镰孢2种恶苗病菌。‘镇稻21’种子携带的拟轮枝镰孢在发病秧苗中未能检测到, 可能与种子带菌量低从而不足以致病有关。已有研究报道稻种上鲜有携带拟轮枝镰孢, 种子带菌可能不是该菌所致恶苗病的主要初侵染源^[16]。F.andiyazi虽然在秧苗病组织中被检测到但未能分离出来, 主要原因可能是该病原菌致病力较弱, 在病组织中未能竞争过优势病菌。由于LAMP检测灵敏度显著高于组织分离法, 此外还有诸多因素如病菌致病力强弱和竞争力、病组织质量的好坏等均可能影响到分离结果。此外, 经LAMP检测种子未携带恶苗病菌的‘华粳8号’, 其种子所育秧苗的LAMP检测和组织分离均未检出恶苗病菌。上述结果表明, 本研究种子带菌的LAMP检测结果是可靠的。

表 2结果还显示, 仅携带层出镰孢的‘连粳12’和‘徐稻8’稻种所育发病秧苗, 对层出镰孢特异的LAMP检测呈阳性, 并从发病秧苗病组织中分离出层出镰孢, 说明种子上携带的层出镰孢可以单独引起水稻恶苗病, 提示种子带菌是层出镰孢所致恶苗病的重要初侵染源。

3 结论与讨论

本研究采用可分别特异性识别藤仓镰孢、层出镰孢、拟轮枝镰孢和F.andiyazi 4种恶苗病菌的LAMP检测技术, 对来自江苏省13个地区2017年生产的103份水稻种子携带的水稻恶苗病菌进行检测, 共检测出89份稻种样本携带水稻恶苗病菌, 水稻恶苗病已知的4种病原菌均被检测到。其中, 检出率最高的是藤仓镰孢, 在所测13个地区均有检出; 其次是层出镰孢, 在8个地区有检出; 而拟轮枝镰孢和F.andiyazi种子带菌率低。研究结果表明, 当前江苏省水稻栽培品种种子携带恶苗病菌十分普遍, 藤仓镰孢是江苏稻种携带恶苗病菌的优势种, 其次是层出镰孢。而对于拟轮枝镰孢和F.andiyazi, 种子带菌可能不是其所致恶苗病菌的主要初侵染源。提示, 今后对江苏稻种的种子处理剂研发应主要针对藤仓镰孢和层出镰孢。

本研究共检测到14个水稻品种不携带恶苗病菌, 但以往的研究并未发现对水稻恶苗病表现完全抗病的品种^[20]。本研究从泰州收集的‘武运粳24’稻种上未检测到恶苗病菌, 但已有的报道均指出‘武运粳24’为恶苗病感病品种, 在扬州、如东、靖江和南通等地发病都比较重, 病株率可达30%^[21-22]。本研究对其中8个品种采用分生孢子液浸种方法^[19]接种藤仓镰孢, 供试8个品种的秧苗均不同程度发病(结果未显示), 由此推测上述品种的稻种未检出恶苗病菌, 可能主要与种子产地的局部环境及穗期气候条件有关。

从稻种上获取所携带病原菌的方法主要有:水琼脂平皿法、吸水纸保湿法、研磨法和水洗法。琼脂平皿法和吸水纸保湿法适于对种子带菌部位进行检测, 分离与鉴定病原菌所需的时间较长, 通常需要10~15 d才能完成^[11]。研磨法适于对稻种内部病原菌的检测, 但稻种质地坚硬, 研磨耗时耗力, 难以满足大批量种子样本的检测。水洗法适于种子表面的带菌检测, 方法简单易行, 便于对大批量样本进行检测。本实验室建立的改良水洗法在种子水洗过程中加入超声波处理, 可显著提高从种子上提取所携带病原菌的效率, 从获得的沉淀物中提取的基因组DNA可以用作LAMP检测模板^[16]。环介导等温扩增技术对DNA模板质量的要求极低, 可从混杂有稻种组织、病原菌以及其他各种微生物的基因组DNA中检测出目标病原菌, 同时还具有检测所需时间短(完成一次种子带菌检测仅需4 h左右)、病原菌的检测与种的鉴定同步完成、反应结果可用肉眼直观判定等优点, 显著提高检测效率。

袁咏天等^[16]在研发水稻种子携带恶苗病菌的LAMP检测方法过程中, 曾收集部分江苏水稻种子样本用于该检测方法的可靠性验证。该研究所检测稻种的样本数偏小, 种子来源地仅包含江苏8个地区, 缺少来自苏南苏州和无锡以及苏东南通的种子样本, 且供测稻种主要购自种子公司门市部, 故而种子生产年份不详。相比较之下, 本研究结果更能准确反映当前江苏水稻栽培品种种子携带恶苗病菌的状况及其病原菌种类组成, 研究结果对指导江苏水稻恶苗病的防治更具实际价值。本研究从来自江苏镇江和南通的2份种子上首次检出携带拟轮枝镰孢, 但在所育秧苗的LAMP检测和组织分离物中均未检出该病原菌。有报道指出, 由拟轮枝镰孢引起的恶苗病在江苏的南京和镇江大田成株期具有一定的发病率^[18], 提示由该病原菌所致恶苗病的初侵染源可能来自稻田。