南京农业大学学报  2020, Vol. 43 Issue (4): 629-636   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201912037
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陈静, 鲁秀梅, 任琴琴, 孙亚亭, 包卫红, 陈雯倩, 钱春桃
CHEN Jing, LU Xiumei, REN Qinqin, SUN Yating, BAO Weihong, CHEN Wenqian, QIAN Chuntao
甜瓜circRNA及其蔓枯病抗性靶基因鉴定
Identification of circRNA and their target genes related to resistance to gummy stem blight in melon
南京农业大学学报, 2020, 43(4): 629-636
Journal of Nanjing Agricultural University, 2020, 43(4): 629-636.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201912037

文章历史

收稿日期: 2019-12-20
甜瓜circRNA及其蔓枯病抗性靶基因鉴定
陈静1 , 鲁秀梅1 , 任琴琴1 , 孙亚亭1 , 包卫红2 , 陈雯倩2 , 钱春桃1     
1. 南京农业大学园艺学院/作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏 南京 210095;
2. 海门市农业科学研究所, 江苏 南通 226100
摘要[目的]本文旨在通过甜瓜接种蔓枯病菌前、后circRNA的研究及靶基因的筛选验证,探究circRNA在甜瓜抗蔓枯病过程中的作用。[方法]利用感病品种‘白皮脆’和抗病材料PI420145,分别在接种前、后取样,构建circRNA文库,通过RNA-Seq、Real-time PCR验证以及基因结构分析,探索circRNA在抗蔓枯病过程中的作用。[结果]12个circRNA文库中共鉴定出3 136个circRNA,过滤后共获得1 511个circRNA。聚类分析结果表明,circRNA的种类和表达具有品种差异性,且接种蔓枯病菌会引起circRNA的变化。接种蔓枯病菌前、后,在PI420145和‘白皮脆’中分别筛选到4个和3个差异表达的circRNA,其中1个circRNA在2种材料中都有差异表达;对6个靶标基因的结构域分析及RT-qPCR分析结果表明,MELO3C022310MELO3C002560MELO3C010763基因与甜瓜蔓枯病抗性相关。[结论]circRNA参与了甜瓜材料PI420145对蔓枯病入侵的防御反应。
关键词甜瓜   蔓枯病   circRNA   靶基因   
Identification of circRNA and their target genes related to resistance to gummy stem blight in melon
CHEN Jing1, LU Xiumei1, REN Qinqin1, SUN Yating1, BAO Weihong2, CHEN Wenqian2, QIAN Chuntao1    
1. College of Horticulture/State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. Haimen Agricultural Science Research Institute, Nantong 226100, China
Abstract: [Objective] The purpose of this article was to investigate the role of circRNA involved in the resistance of melon to gummy stem blight through the study of circRNA and screening of target genes before and after the inoculation of Didymella bryoniae. [Methods] The circRNA libraries were constructed by sampling the susceptible variety 'Baipicui' and disease-resistant material PI420145 before and after inoculation, respectively. The RNA-Seq, real-time PCR and gene structure analysis were combined to explore the role of circRNA in the resistance to gummy stem blight. [Results] A total of 3 136 circRNA were identified from 12 libraries, and 1 511 circRNA were resultantly obtained after filtering. Through cluster analysis, it was concluded that the types and expression of circRNA were various among different cultivars and could be changed by the inoculation of D.bryoniae. Before and after inoculation, 4 and 3 differentially expressed circRNA were screened in PI420145 and 'Baipicui', respectively, and one of which was differentially expressed in both materials. The results of domain analysis and RT-qPCR of the 6 target genes showed that the genes of MELO3C022310, MELO3C002560 and MELO3C010763 were related to resistance of melon gummy stem blight. [Conclusion] The circRNA was involved in the defense response of melon source PI420145 to the invasion of D.bryoniae.
Keywords: melon    gummy stem blight    circRNA    target genes   

circRNA(circular RNA)是生物体内广泛存在的环状非编码RNA, 由外显子或内含子序列剪切产生, 大量存在于真核细胞的细胞质中[1]。近年来研究表明, 在生物体内, circRNA可以作为竞争性内源RNA(ceRNA)结合miRNA, 剪接和转录的调节因子以及亲本基因表达的修饰因子在细胞分化和发育的过程中发挥重要作用[2]。在动物中, 研究发现circRNA在疾病发生[3]、细胞分化[4]等方面具有重要作用。在植物上的研究主要围绕组织特异性[5]、果实发育[6]等方面, 且大多集中在拟南芥[7]、水稻[8]等模式植物。

在植物抗病育种方面, Ghorbani等[9]认为玉米接种伊朗花叶病毒前、后差异表达的circRNA可能影响植物的代谢和发育。Wang等[10]研究表明猕猴桃circRNA的表达具有组织特异性和物种特异性, 并在植物免疫应答中发挥重要作用。Wang等[10]在番茄黄叶卷曲病毒侵染前、后的番茄植株中分别筛选出32个和83个特异表达的circRNA, 认为其靶基因沉默导致番茄黄叶卷曲病毒积累减少。李冰冰等[12]在泡桐中鉴定出50个circRNA, 且在健康泡桐苗和感丛枝病泡桐苗中差异表达, 表明circRNA在泡桐抗丛枝病中发挥重要作用。

蔓枯病是甜瓜主要病害之一, 其严重影响甜瓜的产量及品质。目前, 关于甜瓜抗蔓枯病的研究主要集中于分子标记的筛选和等位性检测[13]等方面, 而在非编码RNA的转录调控水平方面尚未见报道。本研究以抗病材料PI420145和感病品种‘白皮脆’自交系作为材料, 在接种蔓枯病菌前、后取样, 构建circRNA库, 对其进行双端测序, 筛选差异表达的circRNA, 并进行抗蔓枯病基因验证及靶基因结构域分析, 以获得甜瓜抗蔓枯病相关circRNA, 揭示circRNA在甜瓜抗蔓枯病中的作用, 旨在为甜瓜抗病育种研究提供新的思路。

1 材料与方法 1.1 试验材料

蔓枯病抗性材料PI420145(A)由南京农业大学葫芦科作物遗传育种与种质创新实验室提供; 蔓枯病感病品种‘白皮脆’(B)由新疆农业科学院提供, 经本实验室连续多代自交留种。

蔓枯病菌采用A型菌株, 由本实验室提供。采用李英等[14]的方法分离纯化菌株, 采用PDA培养基在(25±1)℃黑暗条件下培养7 d, 然后在紫外条件(光照/黑暗时间为12 h/12 h)下培养4 d, 使其产生大量分生孢子。

1.2 蔓枯病菌分生孢子悬浮液配制和蔓枯病接种

在显微镜下利用血球计数板将分生孢子配成浓度为5×105 mL-1的孢子悬浮液, 加乳酸将pH值调至3.5~4.0, 再加入20滴Tween 20增加表面活性。参照Zhang等[15]的方法, 待植株长至3叶1心时, 使用手持喷雾器, 进行人工喷雾接种, 茎部及叶片正、反面均喷到滴水为止。接种后置于相对湿度和相对温度分别为95%和28 ℃左右的人工气候室中。

1.3 RNA文库构建和测序

在接种蔓枯病菌前(0 d)和接种后(2 d)对PI420145和‘白皮脆’取样, 取植株全部完全展开的功能叶, 每个样品3次重复。采用Trizol试剂法提取叶片总RNA。根据说明书, 取5 μg Ribo-Zero rRNA Removal Kit(Epicentre)移除核糖体RNA, Rnase R(Epicentre)移除线性RNA, TRIzol Reagent(Invitrogen)纯化RNA, 使用NEBNext® Ultra Directional RNA Library Prep Kit(NEB)构建RNA文库。Agencourt AMPure XP Magnetic Beads(Beckman)筛选长度为350~550 bp的片段, 在Hiseq X10平台上机测序, 策略为PE150, 即双端测序(pair-end)测序模式, 即从最左端测150 bp, 再从最右端测150 bp。

1.4 circRNA的鉴定

使用inhouse Perl脚本过滤fastq格式的原始reads, 以删除包含adapter或ploy-N和低质量的reads。将所得到的reads利用TopHat算法比对到甜瓜参考基因组DHL92(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Cucumis_melo/)。使用CIRCexplorer识别circRNA, 并对其中没有比对到基因组的reads用TopHat-Fusion再次比对, 寻找back-spliced reads, 最后将比对到相同位置的read count>2的junction reads作为新鉴定的circRNA。

1.5 差异表达circRNA的筛选及分析

使用TPM(Transcripts PerMillion)对circRNA的表达进行归一化。差异表达circRNA的输入数据为readcount数据。使用基于负二项分布的DESeq2分析带有生物重复的样本。

利用火山图推断差异表达circRNA的分布。通过评估差异倍数(fold change)和校正后的显著水平(padj)2个方面来筛选差异表达的circRNA。对于有生物重复的样本, 筛选条件为padj < 0.05。对差异表达的circRNA进行聚类分析。

1.6 circRNA靶基因的富集分析

根据circRNA与其靶基因间的对应关系, 对每组差异表达circRNA的靶基因集合分别进行Gene Ontology和KEGG富集分析。其中GO富集分析方法为GOseq, 经校正后统计GO注释的候选靶基因数, 并以柱状图的形式展示。根据KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/)对靶基因进行注释, 将P值小于0.05的Pathway定义为在候选靶基因中显著富集的Pathway。

1.7 靶基因的筛选及分析验证

筛选差异表达的circRNA, 利用NCBI Conserved Domain Search Service(CD Search)平台(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)进行靶基因保守结构域的预测。

使用Primer Premier 5.0设计引物, SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)试剂盒及CFX 96荧光定量PCR仪(Bio-Rad)进行Real-time PCR。总反应体系为20 μL, 其中Template cDNA 1 μL, SYBR(-20 ℃)10 μL, 前引物0.5 μL, 后引物0.5 μL, ddH2O 8 μL。反应程序为:95 ℃30 s, 95 ℃5 s, 55 ℃30 s, 72 ℃30 s, 共40个循环。每个样品3次重复。以甜瓜Actin基因为内参基因, 采用2-ΔΔCT方法计算基因的相对表达量, 并根据单因素方差分析法进行差异显著分析。引物见表 1

表 1 本研究所用引物序列 Table 1 Primer sequence used in this study
基因Genes 引物序列Primer sequences(5′→3′)
Actin GTGATGGTGTGAGTCACACTGTTC/GGCAGTGGTGGTGAACATG
gene22730 CTGGAGAAAGCTGCAATCA/CCCAACCCTAGACACTCTAAGA
MELO3C022310 ACAAAACGAATTACTACCGAA/CTCCAAAACAAAAAACAAAGA
MELO3C002560 TAGGAAAAGATCAGCAAGGTT/TGGAGTAGGGGAGATAGAAAG
MELO3C010763 TATCTGTAAGCAATAGCACGA/ATCAGTTTCAAATCAAAGCAC
MELO3C004378 TGATTTTTCCACTGTCCGAGA/GATTACCCCTTTGAAGCCCAT
MELO3C019790 ATTCATCTATCCGTCCTTTGG/AAATTAGACATCGGCAGTCAA
2 结果与分析 2.1 甜瓜抗性表型鉴定

图 1可见:接种蔓枯病菌后3 d, 抗病材料PI420145无明显症状, 而感病品种‘白皮脆’表现典型的蔓枯病感染症状, 即接种叶片已经出现褪绿变黄, 病斑中心出现轮纹状病斑, 所以选择接种后2 d的无病症叶片用于文库制备和RNA测序。

图 1 接种蔓枯病菌后3 d PI420145和‘白皮脆’叶片表型鉴定 Fig. 1 Phenotype identification of PI420145 and'Baipicui'leaves after inoculation ofDidymella bryoniae for 3 days
2.2 甜瓜circRNA的鉴定

经过滤, PI420145接种蔓枯病菌前(A0)和接种后(A2)分别得到102 710 802和92 350 890条clean reads; ‘白皮脆’接种前(B0)和接种后(B2)分别得到105 019 117和95 093 825条clean reads。同时, A0、A2、B0和B2分别保留了30.81、27.71、31.51和28.52 Gb的clean bases。本试验共鉴定出来自12个文库的1 511个circRNA。在A0和B0中分别鉴定出626个和609个circRNA, 在A2和B2中分别鉴定出499个和374个circRNA。在A0和B0中, 相同的circRNA有158个; 在A2和B2中, 相同的circRNA有105个(图 2)。与A0相比, A2的circRNA数量减少20.29%;与B0相比, B2的circRNA数量减少38.59%。

图 2 接种蔓枯病菌前、后PI420145和‘白皮脆’鉴定的circRNA维恩图 Fig. 2 Vene diagram of circRNA identified in PI420145 and'Baipicui'before and afterinoculation of D.bryoniae A0和A2分别代表PI420145接种前、后; B0和B2表示‘白皮脆’接种前、后。下同。 A0 and A2 represent PI420145 before and after inoculation, respectively; B0 and B2 represent'Baipicui'before and after inoculation. The same as follows.
2.3 甜瓜差异表达circRNA的筛选及分析

在PI420145和‘白皮脆’接种蔓枯病菌前、后的12个文库中筛选差异表达的circRNA并进行聚类分析, 结果(图 3)发现A0和B0共鉴定出64个差异表达的circRNA, 其中21个表达上调, 43个表达下调, 表明circRNA在不同品种中存在明显差异。A2和A0中有30个差异表达circRNA, 4个circRNA表达上调, 26个circRNA表达下调, 只有2个circRNA在两者中均有表达; B2和B0中有47个差异表达的circRNA, 其中3个表达上调, 44个表达下调, 在两者间都有表达的circRNA只有3个, 说明接种蔓枯病会引起甜瓜circRNA的变化, 但在抗感品种中的反应有差异。A2和B2有9个差异表达circRNA, 其中4个表达上调、5个表达下调, 只有1个circRNA都有表达, 说明在甜瓜不同品种中, 病害的侵染会引起circRNA不同的表达。

图 3 差异表达circRNA的聚类分析 Fig. 3 Cluster analysis of differentially expressed circRNA 本图为整体层次聚类图, 以lg(TPM+1)值进行聚类。红色表示高表达circRNA, 蓝色表示低表达circRNA。 The figure is an overall hierarchical clustering graph, clustering with lg(TPM+1)value. The red indicates high expression of circRNA, and the blue indicates low expression of circRNA.
2.4 差异表达circRNA靶基因的功能分析

对接种蔓枯病菌前、后差异表达的circRNA的靶基因进行GO富集和基因数统计。结果显示, 在A0 vs B0中, 共发现38个差异表达的circRNA靶基因, 这些靶基因主要富集于3-羟基酰基辅酶α脱氢酶、氧化还原酶、钙调蛋白结合和络合物合酶等条目, 其中分子功能(molecular function)类型中富集于氧化还原酶活性调控的基因数最多。在A2 vs A0中, 共获得48个差异表达circRNA的靶基因, 主要功能涉及应激反应、小分子代谢、脂肪酸代谢、钙调蛋白结合以及络合物合酶和氧化还原酶活性调控, 其中在生物学过程(biological process)类别中响应刺激的基因数最多。B2 vs B0中, 有53个差异表达circRNA的靶基因被富集到芳香族氨基酸生物合成代谢、双糖生物合成、络合酶活性调控、异构酶活性调控和催化活性调控等条目, 其中催化活性调控的基因数最多。在A2 vs B2中, 共发现45个差异表达的circRNA靶基因, 这些靶基因的主要功能与芳香氨基化合物的生物合成、信号转导、有机环化合物的生物合成、细胞通路、细胞对刺激的反应以及生物和细胞的调控相关(图 4)。

图 4 候选靶基因GO富集图(A2 vs B2) Fig. 4 GO enriched map of candidate target gene(A2 vs B2)

进一步用KEGG信号通路对circRNA的靶基因进行注释分类, 发现在A0 vs B0中, 差异表达的circRNA靶基因富集在20个通路中, 主要体现在次生代谢产物合成, 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成, 甘油磷脂代谢, 氨基酸生物合成和代谢途径。在A2 vs A0中, 只有在植物激素信号转导通路中富集。B2 vs B0中有4条通路富集, 分别为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成, 氨基酸的生物合成, 次生代谢物的生物合成和代谢途径。在A2 vs B2中, 差异circRNA靶基因在5个通路中富集(表 2)。

表 2 候选靶基因的KEGG信号通路分析(A2 vs B2) Table 2 KEGG signaling pathway analysis of candidate target gene(A2 vs B2)
功能注释Function annotation 基因数Number of genes PP-value
苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis 1 0.024 5
氨基酸的生物合成Biosynthesis of amino acids 1 0.109 8
植物激素信号转导Plant hormone signal transduction 1 0.129 6
次生代谢产物生物合成Biosynthesis of secondary metabolites 1 0.426 0
代谢途径Metabolic pathways 1 0.639 9
2.5 靶基因筛选及分析验证 2.5.1 靶基因筛选

通过比对发现, 在PI420145中4个circRNA在接种蔓枯病菌前低表达或不表达, 而在接种后表达上调(图 3)。这些circRNA在基因组上的ID分别为NC_015983.1:137297-138107:-、NW_007546319.1:719750-720112:+、NW_007546268.1:4337793-4338189:-和NW_007546281.1:654424:+, 分别位于0、11、12和3号染色体上。NC_015983.1:137297-138107:-为新鉴定的circRNA, 其靶基因命名为gene22730, 基因序列如图 5所示, 位于叶绿体基因组。同时, ‘白皮脆’中有3个circRNA在接种前低表达或不表达, 而在接种后表达上调(图 3), 分别为NW_007546268.1:4337793-4338189:-、NW_007546270.1-6727758:+和NW_007546307.1:176799-177080:+, 分别位于12、5和3号染色体上。ID为NW_007546268.1:4337793-4338189:-的circRNA在PI420145和‘白皮脆’接种后都有表达(表 3)。

图 5 NC_015983.1:137297-138107:-基因组序列 Fig. 5 The genome sequence of NC_015983.1:137297-138107:-
表 3 PI420145和‘白皮脆’接种蔓枯病菌前、后特异表达的circRNA Table 3 The circRNA of differential expression in PI420145 and'Baipicui'before and after inoculation of D.bryoniae
类型
Type
染色体
Chromosome
circRNA编号
ID of circRNA
靶基因
Target genes
A2 vs A0 0 NC_015983.1:137297-138107:- gene22730
11 NW_007546319.1:719750-720112:+ MELO3C022310
12 NW_007546268.1:4337793-4338189:- MELO3C002560
3 NW_007546281.1:654098-654424:+ MELO3C010763
B2 vs B0 12 NW_007546268.1:4337793-4338189:- MELO3C002560
5 NW_007546270.1:6727341-6727758:+ MELO3C004378
3 NW_007546307.1:176799-177080:+ MELO3C019790
注:加粗内容为接种前、后2种材料中都存在差异表达的circRNA及其靶基因。
Note:The bold contents are circRNA of differential expression and their target genes in both materials before and after inoculation.
2.5.2 基于RT-qPCR的靶基因验证

图 6可知:在PI4201245中, 靶基因gene22730MELO3C022310MELO3C002560MELO3C019790在接种蔓枯病菌前低表达, 接种后表达上调, 其中基因gene22730MELO3C022310MELO3C002560均显著上调。在‘白皮脆’中, 靶基因MELO3C002560MELO3C004378MELO3C010763在接种前低表达, 接种后表达上调, 其中基因MELO3C004378MELO3C010763显著上调, 这与测序结果一致, 说明测序结果可靠。由于circRNA的表达与靶基因呈线性相关, 因此基因gene22730MELO3C022310MELO3C002560MELO3C010763可能为甜瓜PI420145抗蔓枯病相关基因。

图 6 接种蔓枯病菌前、后PI420145和‘白皮脆’靶标基因的相对表达量 Fig. 6 Relative expression levels of PI420145 and'Baipicui'target genes before and afterinoculation of D.bryoniae 不同字母表示差异显著(P < 0.05)。 Different letters indicate significant difference at 0.05 level.
2.5.3 基于保守结构域的靶基因验证

利用NCBI conserved domain在线预测保守结构域, 发现基因MELO3C022310编码组氨酸激酶, 在516~803和1 073~1 606核苷酸处有CHASE家族结构域, 该结构域是存在于受体样蛋白的胞外部分, 编码丝氨酸/苏氨酸激酶和腺苷酸环化酶等酶; 在2 349~2 402核苷酸处存在HisKA结构域, 其与信号转导、反应调节相关; 在3 477~3 758核苷酸处有HATPase家族, 包含组氨酸激酶样ATP酶(HATPase)结构域, 同样与信号转导有关。靶基因MELO3C002560编码棉纤维表达蛋白, 存在DUF761结构域。基因MELO3C010763编码液泡加工酶样蛋白, 在268~321、2 431~2 805、3 432~3 533这3个核苷酸区域含有CASc家族, 该家族编码半胱氨酸依赖的天冬氨酸导向蛋白酶。MELO3C019790基因编码分支酸合酶, 该酶与芳香族氨基酸的合成有关。

3 讨论

本研究发现2种材料接种蔓枯病菌后circRNA的数量均比接种前减少, 且‘白皮脆’中的circRNA变化更大, 这与Xiang等[16]的研究结果一致。聚类分析发现, 接种前、后PI420145和‘白皮脆’中均产生种类和数量存在差异的circRNA, 其中PI420145中差异表达的circRNA数少于‘白皮脆’, 但上调表达的circRNA较多, 说明二者的防御机制不同, 这与番茄接种晚疫病病菌后相关circRNA的变化一致[17]

差异表达circRNA靶基因功能分析的结果说明, PI420145可以激活更多的有效途径来应对蔓枯病菌的侵入。A2 vs A0中, 靶基因MELO3C022310MELO3C010763参与响应外界刺激、植物激素信号转导途径, 其中MELO3C022310基因的KEGG富集通路显示与玉米素的生物合成有关, 这与高粱感染炭疽病的代谢组学研究结果一致[18]。在B2 vs B0中, MELO3C004378基因与DNA和RNA的合成相关。研究表明, MELO3C022310基因中保守结构域与植物抗病过程中信号转导有关[19]MELO3C002560基因的DUF761结构域编码的DUF蛋白在拟南芥中参与植物的防御反应[20]MELO3C010763基因编码的蛋白酶介导细胞程序性死亡[21]MELO3C019790基因与芳香族氨基酸的合成有关, 而芳香族氨基酸与植物抗病过程相关[22]。NC_015983.1:137297-138107:-的靶基因gene22730定位于甜瓜叶绿体基因组上, 拟南芥叶绿体基因组转录产生的circRNA含量较高, 可能是circRNA产生的热区之一。根据现有研究还不能判断其是否与蔓枯病抗性有关, 还需要对其合成过程、发挥位点及作用进一步研究。

本研究中, circRNA在调控甜瓜PI420145对蔓枯病侵入的防御反应过程中发挥重要的作用。借鉴番茄芝麻斑病侵染过程的研究[23], 推测蔓枯病菌侵染后, 甜瓜的第1道防线是物理防御, 即蜡质层; 当蔓枯病菌穿透蜡质层后, PI420145中的circRNA启动响应外界刺激的基因, 激活茉莉酸和水杨酸介导的防御信号和相关途径[24], 促进芳香族氨基酸化合物合成。尽管蔓枯病菌侵入时, ‘白皮脆’和PI420145都启动了防御反应, 但可能PI420145对蔓枯病的识别时间更短, 防御反应更迅速持久, 避免进一步的伤害; 而‘白皮脆’对蔓枯病的识别反应较慢, 信号较弱, 从而导致蔓枯病菌的繁殖和转移, 最终使植株坏死。下一步研究将在PI420145对蔓枯病抗性基因克隆和表达分析的基础上, 从组织解剖结构学、转录组学、代谢组学和蛋白组学等不同层面, 系统地研究甜瓜PI420145对蔓枯病的防御特征, 准确揭示其抗性形成机制。

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