文章信息
- 刘婷, 文涛, 赵梦丽, 张媛, 张超, 袁军, 沈其荣
- LIU Ting, WEN Tao, ZHAO Mengli, ZHANG Yuan, ZHANG Chao, YUAN Jun, SHEN Qirong
- 番茄根际代谢物抵御茄科劳尔氏菌入侵机制研究
- The mechanisms of tomato rhizosphere metabolites resistance to Ralstonia solanacearum invasion
- 南京农业大学学报, 2020, 43(3): 460-467
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2020, 43(3): 460-467.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201905051
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文章历史
- 收稿日期: 2019-05-29
番茄是一种经济价值和营养价值高、种植面积大的蔬菜作物, 也是植物遗传、发育和生理研究的重要模式植物[1]。青枯病是一种常见的番茄土传细菌病害, 高温、高湿条件下极易在连作田块中发生, 在发病早期, 植株地上部分会出现萎垂症状但叶片仍保持绿色, 随着病情蔓延, 它会造成番茄植株大片萎焉和番茄产量大幅下降[2]。番茄青枯病的病原菌为茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum), 茄科劳尔氏菌可以通过植株根系侵入植株木质部导管大量增殖而导致植物死亡[3]。茄科劳尔氏菌的寄主范围非常广泛, 可以侵染200多种单子叶和多子叶植物[4]。目前, 生产上防治青枯病的主要措施是土壤熏蒸、短期轮作、抗病品种的培育、嫁接、化学农药或生物有机肥的应用等[5]。各种防治措施各有利弊, 但在农业实际生产中仍达不到令人满意的效果[6]。
根际代谢物包括根系分泌物和经根际土壤微生物代谢后产生的小分子物质[7]。根际代谢物在植物-微生物互作过程中发挥重要的作用, 根际代谢物中富含的糖类、氨基酸及维生素等为根际微生物的生长和繁殖提供了充足的营养[8]。根际代谢物对病原微生物的作用方式包括直接作用和间接作用。直接作用是指根际代谢物促进或抑制病原微生物, 如抗病品种的根际代谢物会抑制病原菌的孢子萌发和菌丝生长[9]; 花生根系分泌物中的月桂酸、豆蔻酸、油酸等会促进根腐镰刀菌的生长[10]; 番茄根系分泌物中的柠檬酸、甘氨酸、半乳糖作为营养碳源促进青枯病菌生长和在根部的定殖[11]。间接作用指植物可以通过根际代谢物塑造自身根际微生物的组成, 从而影响病原微生物, 如拟南芥根部分泌的三羧酸循环中间体L-苹果酸可以选择性地以剂量依赖性的方式发出信号并募集有益菌枯草芽胞杆菌FB17[12]; 黄瓜根系分泌物中的柠檬酸可以吸引有益菌SQR9并诱导其生物膜的形成[13]; 香蕉分泌物中的富马酸也可以吸引有益菌并诱导其生物膜的形成[13]。
代谢组学是一种基于对代谢产物全面分析的基础上, 用于识别不同处理间差异根际代谢物的方法, 它可以帮助研究者了解植物根际代谢物的组成特征以及识别差异代谢物, 而且具有髙通量的特点[14]。代谢组学的研究内容为样品的收集与制备(水培收集、土培收集、基质培养收集和连续性根系分泌物收集系统)、样品的仪器分析(高效液相色谱、色谱-质谱联用技术)、数据处理等[15]。在代谢组学仪器分析方法中, 气相色谱-质谱分析(GC-MS)技术具有快速、高灵敏度和高分辨率的特点, 它拥有标准的谱库可以检索, 能够快速定性所检测到的代谢物, 因此, GC-MS技术成为代谢组分析的首要选择方法[16]。
本试验通过气相色谱-质谱分析技术(GC-MS)比较健康和发病番茄根际代谢物之间的组分差异, 并研究番茄差异根际代谢物对茄科劳尔氏菌生长及根表定殖的影响, 为防控番茄青枯病提供理论依据和关键技术。
1 材料与方法 1.1 供试植物与菌株番茄品种为‘合作903’, 种子购于江苏明天种业科技有限公司。茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum, RS)是从南京东郊麒麟镇后村蔬菜种植基地采集发病番茄根际土中分离纯化得到的, 其代号为QL-Rs1115[5]。红色荧光蛋白(RFP)标记的茄科劳尔氏菌(RFP-RS)是用分离纯化的RS标记的[17]。菌株均由本实验室保存。
1.2 培养基与试剂NA液体培养基:葡萄糖10 g · L-1、蛋白胨5 g · L-1、牛肉膏3 g · L-1、酵母粉0.5 g · L-1, pH7.0。
NA固体培养基:配方同NA液体培养基, 琼脂加入量为20 g · L-1。
TTC固体培养基:配方同NA固体培养基。倒平板前, 每300 mL培养基加入如下抗生素:3 mL 10 g · L-1 (质量体积比)多黏菌素、3 mL 10 g · L-1放线菌酮、0.15 mL 10 g · L-1青霉素、0.15 mL 10 g · L-1氯霉素、0.75 mL 10 g · L-1杆菌肽、0.75 mL 20 g · L-1 2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑(TTC)、0.15 mL 10 g · L-1结晶紫, 其中, 放线菌酮和氯霉素需溶于无水乙醇, 抗生素需过0.22 μm滤膜。
无机盐培养基:葡萄糖20 g · L-1、(NH4)2SO4 2.0 g · L-1、MgSO4 · 7H2O 0.2 g · L-1、CaCl2 · 2H2O 0.01 g · L-1、FeSO4 · 7H2O 0.001 g · L-1、Na2HPO4 · 12H2O 1.5 g · L-1、KH2PO41.5 g · L-1。
LB固体培养基:蛋白胨10 g · L-1、酵母粉5 g · L-1、NaCl 10 g · L-1, 琼脂加入量为20 g · L-1。
番茄营养液:大量元素母液(200倍)5 mL · L-1、微量元素母液(200倍)5 mL · L-1、硝酸钙母液(400倍)2.5 mL · L-1。其中, 大量元素母液成分为:KNO3 60.6 g · L-1、KH2PO4 40.8 g · L-1、MgSO4 · 7H2O 49.4 g · L-1、(NH4)2SO4 6.6 g · L-1、K2SO4 43.6 g · L-1; 微量元素母液成分为:EDTANa2Fe 4 g · L-1、H3BO3 0.572 g · L-1、MnSO4 · H2O 0.42 g · L-1、ZnSO4 · 7H2O 0.044 g · L-1、CuSO4 · 5H2O 0.016 g · L-1、(NH4)6MO7O24 · 4H2O 0.004 g · L-1; 硝酸钙母液成分为:Ca(NO3)2 · 4H2O 354.4 g · L-1。
蔗糖、蜜二糖、果糖等均购于南京辉亚生物科技有限公司。
1.3 番茄根际土壤样品的采集番茄根际土壤样品采集于江苏省南京市蔬菜研究所番茄试验田, 番茄品种为‘合作903’, 试验田人为划分为3个小区, 从每个小区随机取3份发病植株样和3份健康植株样(发病植株是自然发病的, 小区中导致植株发病的病原菌与文中采用的病原菌相同)。用铁铲挖取番茄整棵植株, 将番茄根系带土一起收集于自封袋中带回实验室; 将与根系结合松散的土壤抖落, 并将番茄根剪成2~3 cm小段, 放在装有200 mL无菌水的组培瓶中, 170 r · min-1振荡30 min; 再进行超声波破碎10 min(20 ℃, 强度为100 W · cm-2)。用无菌镊子将番茄根系移除, 土壤悬液转移至50 mL无菌离心管中, 进行冷冻干燥后即为根际土壤样品[18]。
1.4 根际土壤代谢物组分GC-MS分析 1.4.1 萃取与衍生化称取同一土壤样品2份(每份0.5 g), 在其中1份样本中加入0.5 mL 75%甲醇(体积分数)提取液和24 μL 1 mg · mL-1核糖醇, 45 Hz研磨仪处理4 min, 超声波破碎5 min(冰水浴), 重复5次, 然后4 ℃、13 000 r · min-1离心15 min, 获取0.4 mL上清液; 向沉淀中加入0.5 mL乙酸乙酯提取液, 处理方法同上, 同样获取0.4 mL上清液。另1份样品操作相同, 但乙酸乙酯和75%甲醇顺序颠倒。将收集的4份上清液混匀, 并在真空浓缩仪中进行干燥, 干燥后加入30 μL甲氧胺盐试剂, 轻轻混匀后, 放入烘箱中80 ℃孵育30 min, 随后迅速加入40 μL硅烷化试剂(BSTFA), 70 ℃孵育1.5 h, 最后随机上机检测。
1.4.2 上机检测组分分析采用Agilent 7890气相色谱-飞行时间质谱联用仪, 具体分析条件如下:进样量为1 μL, 不分流模式; 载气为氦气; 前进样口流速为3 mL · min-1; 柱流速为1 mL · min-1; 柱温为50 ℃保持1 min, 310 ℃保持8 min; 前进样口温度为280 ℃; 传输线温度为270 ℃; 离子源温度为220 ℃; 电离电压为-70 eV; 扫描方式为50~500 m/z; 扫描速率为20 spectra · s-1; 溶剂延迟时间为6.27 min。
1.4.3 数据分析使用ChromaTOF软件(V 4.3x, LECO)对质谱数据进行峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析。在物质定性工作中, 使用LECO-Fiehn Rtx5数据库, 包括质谱匹配及保留时间指数匹配[19]。
1.5 茄科劳尔氏菌菌液的制备种子液制备:将RS菌从-80 ℃保存的甘油管活化到TTC平板上, 置于28 ℃恒温培养箱中培养2~3 d, 待平板长出单菌落后, 挑取单菌落并接种于NA液体培养基中, 28 ℃、170 r · min-1培养24 h, 得到茄科劳尔氏菌种子液。如果活化RFP-RS, 需用含30 μg · mL-1庆大霉素的NA培养基[17]。
扩大培养:向NA液体培养基中加入3%~5%(体积分数)RS种子液, 28 ℃、170 r · min-1培养36~40 h, 此时菌液浓度达到109 CFU · mL-1, D600值为1.5。将菌液用无菌水离心重悬(20~25 ℃, 6 000 r · min-1, 10 min), 并浓缩菌液至原体积的60%, 同时稀释涂布菌液, 确定菌液浓度是否符合要求。
1.6 差异根际代谢物作为辅助碳源对茄科劳尔氏菌生长的影响将果糖、蔗糖及蜜二糖配制成母液, 并作为辅助碳源分别添加到含基础碳源葡萄糖的无机盐培养基中, 每种物质终浓度设置为1、10和100 mmol · L-1, 并加入用无菌水重悬的1%RS种子液(重悬后菌液浓度为108CFU · mL-1), 混合后分装于96孔板, 每孔装200 μL, 空白对照为无菌水, 每个处理6个重复(为排除边缘效应, 96孔板四周边缘的孔不添加); 28 ℃、170 r · min-1振荡培养8 h, 每隔1~2 h用酶标仪检测D600值, 并绘制茄科劳尔氏菌的生长曲线。
1.7 差异根际代谢物作为唯一基础碳源对茄科劳尔氏菌生长的影响将果糖、蔗糖及蜜二糖配制成母液, 并作为唯一基础碳源分别添加到不含基础碳源葡萄糖的无机盐培养基中, 使物质终浓度为10 mmol · L-1, 加入用无菌水重悬的1%RS种子液(重悬后菌液浓度为108 CFU · mL-1), 混合后分装于96孔板, 每孔装200 μL, 对照为添加终浓度为10 mmol · L-1的葡萄糖处理和空白对照(无菌水), 每个处理10个重复(为排除边缘效应, 96孔板四周边缘的孔不添加); 28 ℃、170 r · min-1振荡培养8 h, 每隔1~2 h用酶标仪检测D600值, 并绘制茄科劳尔氏菌的生长曲线。
1.8 番茄苗培育番茄种子先用75%乙醇消毒30 s, 水洗3次, 再用5%次氯酸钠溶液消毒10 min, 水洗5次。将消毒后的番茄种子均匀分散地置于装有无菌滤纸的平板上, 用无菌水湿润平板底部, 封上保鲜膜, 放入28 ℃恒温培养箱中避光培养3 d后, 将发芽的番茄种子移入50孔穴盘(每穴的穴深为5 cm, 口径为4.5 cm, 底部为2 cm), 于温室培养(温度为25~28 ℃, 光照时间为16 h)。每周浇1次1/4浓度的番茄营养液, 当培养4周后, 番茄苗长出2片真叶且足够大时, 可以用于后续试验[20]。
1.9 差异根际代谢物对茄科劳尔氏菌在根际定殖及根际总细菌数量的影响将培育好的番茄苗移栽到32孔穴盘中(每穴穴深为5 cm, 口径为6 cm, 底部为3 cm), 健康菜园土壤(采自南京农业大学卫岗校区牌楼菜园地)和蛭石按质量比为1 : 1混合后, 向每穴加入50 g混合好的土壤, 并用水浇透, 置于温室(温度为25~28 ℃, 光照时间为16 h); 移栽后4 d, 向每穴番茄根际添加5 mL 109 CFU · mL-1 RFP-RS菌液, 换算得出土壤中菌液终浓度为108 CFU · g-1。同时向每穴加入5 mL 100 mmol · L-1的蔗糖、果糖和蜜二糖等浓度混合溶液, 换算得出每种处理物质终浓度均为10 mmol · kg-1[21]。对照为添加5 mL 100 mmol · L-1葡萄糖处理和空白对照(无菌水)。每个处理设置5个重复, 每个重复3棵苗。每隔3 d向各处理番茄根际添加1次相应物质溶液, 物质添加量和添加浓度不变, 共添加2次。移栽后14 d, 收取番茄根系样品, 称量、磨根, 用于稀释涂布(TTC培养基涂布RFP-RS菌, LB培养基涂布总细菌)后, 置于30 ℃恒温培养箱培养, 2 d后进行平板计数。
1.10 数据统计与分析采用Excel 2016软件和R语言软件进行数据的处理和绘图。采用SPPS 25.0统计软件通过单因素方差分析(ANOVA)进行数据比较, 利用Duncan ’ s新复极差法检验处理间差异的显著性水平。
2 结果与分析 2.1 健康和发病番茄根际代谢物的差异分析从图 1可知:健康和发病样品组内差异小, 组间差异大, 健康和发病番茄根际代谢物在总体组成上存在显著差异。为了找到对上述区分做出主要贡献的根际代谢物, 对健康和发病番茄根际代谢物进行t检验差异分析。由图 2可知:健康和发病番茄之间存在显著差异的根际代谢物(P < 0.05), 健康番茄样品的皮质醇、四氢皮质酮、明串珠菌二糖、2, 3-二甲基琥珀酸、角鲨烯、葡萄糖酸的相对含量显著低于发病番茄样品, 而果糖、蔗糖、肌醇半乳糖苷、蜜二糖、龙胆二糖的相对含量显著高于发病番茄样品。蔗糖、果糖和蜜二糖在健康番茄根际富集, 且这3种物质易溶于水, 纯品易得, 试验操作可行性高。因此, 本研究选蔗糖、果糖和蜜二糖分别作为辅助碳源和唯一碳源进一步探究其对茄科劳尔氏菌生长的影响。
2.2 差异根际代谢物作为辅助碳源对茄科劳尔氏菌生长的影响由图 3可知:当果糖、蔗糖、蜜二糖作为辅助碳源时, 与空白对照相比, 1、10和100 mmol · L-1果糖促进茄科劳尔氏菌生长, 3种浓度处理差异不大; 1、10和100 mmol · L-1蔗糖在前16 h促进茄科劳尔氏菌生长, 而在16 h后抑制其生长, 3种浓度处理差异不大; 1和10 mmol · L-1蜜二糖促进茄科劳尔氏菌生长; 100 mmol · L-1蜜二糖在前18 h促进茄科劳尔氏菌生长, 而在18 h后抑制其生长。这说明蔗糖、果糖和蜜二糖作为辅助碳源添加到无机盐培养基中不会显著抑制茄科劳尔氏菌的生长, 但对其生长的促进效果并不显著。
2.3 差异根际代谢物作为唯一基础碳源对茄科劳尔氏菌生长的影响由图 4可知:相对于空白对照, 10 mmol · L-1葡萄糖作为唯一基础碳源, 可以供茄科劳尔氏菌生长; 茄科劳尔氏菌在10 mmol · L-1果糖、蜜二糖作为唯一基础碳源时无法生长; 在10 mmol · L-1蔗糖作为唯一基础碳源时, 茄科劳尔氏菌生长不明显。这说明茄科劳尔氏菌无法直接利用10 mmol · L-1蔗糖、蜜二糖、果糖作为唯一基础碳源。
2.4 差异根际代谢物对茄科劳尔氏菌在根部定殖及根部总细菌数量的影响由图 5可知:与空白对照处理和葡萄糖处理相比, 10 mmol · kg-1蔗糖、果糖和蜜二糖等浓度混合的溶液处理不仅显著减少茄科劳尔氏菌在番茄根部定殖的数量, 还显著提高番茄根部总细菌的数量。
3 讨论利用代谢组学方法(如GC-MS分析)可以分析植物抗、感病品种对病原菌侵染的代谢水平差异, 这有助于发现重要的生物标志物, 为进一步解析植物抗病机制提供重要的技术支撑[22]。本文通过GC-MS分析发现健康和发病番茄的根际代谢物组分存在显著差异。Sade等[23]通过GC-MS分析发现番茄黄叶卷曲病抗病和感病品种的根际代谢物组成存在显著差异, 如氨基酸、多胺、酚类和吲哚类代谢产物, 且这些代谢产物与番茄抗病性相关。邱文龙[24]通过GC-MS分析发现烟草根际代谢物的组成和含量因烟草品种抗性不同而存在差异, 这说明植物根际代谢物组分与植株抗性有关, 与本文结果相符。Gu等[25]研究发现番茄根系受茄科劳尔氏菌侵染后番茄根际分泌物中酚类物质的含量增加, 并且酚类物质中的咖啡酸可以直接抑制茄科劳尔氏菌的生长。由此推测, 健康和发病番茄之间的差异根际代谢物可能与番茄根系抵御茄科劳尔氏菌入侵有关。本研究发现, 蔗糖、果糖、蜜二糖在健康番茄根际的含量明显高于发病番茄; 而吴玉香等[26]研究发现, 抗病棉花品种根系分泌物中的葡萄糖、果糖和蔗糖含量低于感病棉花品种, 这与本文的结果不同, 可能是因为作物种类以及所涉及的病原菌不同导致植物根际代谢物的组成存在差异[27]。
根际微生物之间存在激烈的竞争, 如针对生态位和营养等[28]。茄科劳尔氏菌对番茄根际分泌物有很强的趋化性, 能够快速利用番茄根系分泌物中的大部分碳源物质, 从而在植物根际快速增殖[11]。本研究发现, 健康番茄根际显著富集的代谢物蔗糖、果糖和蜜二糖在纯培养条件下作为辅助碳源虽然不会显著抑制茄科劳尔氏菌生长, 但是不能作为唯一基础碳源被茄科劳尔氏菌利用, 向番茄根际土壤添加这3种物质组合后可以减少茄科劳尔氏菌根部定殖的数量, 并增加番茄根部细菌的数量, 这说明健康番茄根际富集的蔗糖、果糖和蜜二糖可能通过大量培育其他根际微生物的生长来抵御茄科劳尔氏菌的定殖。寿森炎等[29]发现, 喷施壳聚糖可以降低番茄青枯病的发病率, 与本文有相似的结论。这预示糖类物质在防治植物病害方面有很大的应用前景, 因为糖类物质容易被微生物降解, 不会污染环境[29]。董月[30]的研究表明, 解淀粉芽胞杆菌T-5与茄科劳尔氏菌QL-RFP相比虽然在碳源竞争方面没有优势, 但是T-5菌能够利用番茄根系分泌物中的碳源产生相应的拮抗物质来抑制茄科劳尔氏菌QL-RFP的生长。由此推测, 本文中茄科劳尔氏菌无法利用这3种糖类物质, 但根际土壤中应该存在大量能够利用这3种物质的微生物, 其他微生物的增殖会挤占病原菌的生存空间, 从而达到抑制病原菌生长的目的。
与空白对照相比, 葡萄糖处理组的病原菌数量显著下降, 其原因可能是葡萄糖虽然能被茄科劳尔氏菌利用, 也能被其他土壤微生物利用, 由此产生了竞争作用, 导致茄科劳尔氏菌数量下降。与空白对照相比, 葡萄糖处理组的总细菌数量未增加的原因可能是空白对照和葡萄糖处理的根际病原菌数量比3种物质组合处理的高, 导致空白对照和葡萄糖处理的植株根系生长受影响, 使两者的根际总细菌数量比3种物质组合处理的少。
综上所述, 本研究通过GC-MS分析发现健康和发病番茄根际代谢物的组分显著不同, 推测某些差异根际代谢物与番茄根系抵御茄科劳尔氏菌入侵有关。进一步研究发现, 蔗糖、果糖和蜜二糖作为辅助碳源不会显著抑制茄科劳尔氏菌生长, 茄科劳尔氏菌也无法直接利用这3种物质作为唯一基础碳源。向根际土壤中添加这3种物质能够显著降低茄科劳尔氏菌在番茄根部定殖的数量, 同时增加番茄根部总细菌的数量。说明健康番茄可能通过增加某些不被病原菌利用的碳源来促进其他土壤微生物的增殖, 从而抵御病原菌的定殖。番茄植株的抑病性与根际微生态环境密切相关, 因此, 探究番茄根际代谢物在茄科劳尔氏菌入侵根系的过程中发挥的作用, 可以为农业生产实践中防控青枯病提供理论依据。
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