南京农业大学学报  2020, Vol. 43 Issue (3): 387-391   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.202003100
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郑小英, 吴瑜, 张东京, 洪晓月, 奚志勇
ZHENG Xiaoying, WU Yu, ZHANG Dongjing, HONG Xiaoyue, XI Zhiyong
沃尔巴克氏体(Wolbachia)结合昆虫绝育技术控制白纹伊蚊种群
Combining Wolbachia-based approach and sterile insect techniques eliminate Aedes albopictus population in field
南京农业大学学报, 2020, 43(3): 387-391
Journal of Nanjing Agricultural University, 2020, 43(3): 387-391.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.202003100

文章历史

收稿日期: 2020-03-12
沃尔巴克氏体(Wolbachia)结合昆虫绝育技术控制白纹伊蚊种群
郑小英1 , 吴瑜1 , 张东京1 , 洪晓月2 , 奚志勇3,4     
1. 中山大学热带病防治研究教育部重点实验室,广东 广州 510080;
2. 南京农业大学植物保护学院,江苏 南京 210095;
3. 威佰昆生物科技有限公司,广东 广州 510663;
4. 密歇根州立大学,美国 东兰辛 MI48824
摘要:白纹伊蚊(Aedes albopictus)是全球范围最具有侵略性的入侵物种之一, 是中国大陆登革病毒和寨卡病毒等病原体的主要传播媒介。传统的蚊媒控制方法对白纹伊蚊的控制效果不理想。我们通过显微胚胎注射建立了携带三型沃尔巴克氏体(Wolbachia)菌型(wAlbA、wAlbB和wPip)的白纹伊蚊HC蚊株, 应用昆虫不相容技术结合昆虫绝育技术(IIT-SIT), 在选定的2个试验现场进行持续释放大规模生产的HC雄蚊, 以压制目标区域的白纹伊蚊种群。研究结果显示:在2个试验现场基本清除白纹伊蚊的种群, 证明IIT-SIT是一种高效、绿色环保的蚊媒控制工具, 应用于登革热、寨卡病毒病等蚊媒疾病的传播控制切实可行,
关键词昆虫绝育技术   昆虫不相容技术   沃尔巴克氏体   白纹伊蚊   
Combining Wolbachia-based approach and sterile insect techniques eliminate Aedes albopictus population in field
ZHENG Xiaoying1, WU Yu1, ZHANG Dongjing1, HONG Xiaoyue2 , XI Zhiyong3,4    
1. Key Laboratory of Tropical Disease Control, Ministry of Education, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China;
2. College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
3. Guangzhou Wolbaki Biotech Co., Ltd., Guangzhou 510663, China;
4. Department of Microbiologyand Molecular Gentis, Michigan State University, East Lansing, MI 48824,USA)
Abstract: Aedes albopictus is one of the most invasive mosquitos globally.It is the mainvector of Dengue and Zika viruses over the main land of China and traditional approaches are not effective in Ae.albopictus control.We created atriple-Wolbachia infection (the artificially transinfected wPip, native wAlbA and wAlbB) HC line of Ae.albopictus and releasing HC males that were factory-reared in two field sites by using combining incompatible and sterile insect technique (IIT-SIT).Results showed that IIT-SIT enabled near elimination of field populations of Ae.albopictus at two field sites.This successful field trial demonstrated the feasibility of using IIT-SIT as a new effective and green-environment friendly mosquito-borne control tool in blocking of denguefever, Zika virus and other mosquito-borne diseases transmission.Our research provides a new idea for mosquito vector control.
Keywords: sterile insect technique (SIT)    incompatible insect technique (IIT)    Wolbachia    Aedes albopictus   

昆虫不育技术(sterile insect technique,SIT)是指通过释放经辐射绝育的雄虫与野生雌虫交配,使其没有子代,从而降低靶标害虫的种群数量。SIT技术已经在多种农业和畜牧业重要害虫的控制中成功应用[1],然而在媒介蚊虫控制领域却没有获得成功。其原因是通过辐射绝育的雄蚊显著降低了交配竞争力和生存力。沃尔巴克氏体(Wolbachia)是一种母系遗传的胞内共生菌,当携菌雄蚊与野外未携菌雌蚊交配后,所产的卵不孵化,这种现象称为胞质不相容(cytoplasmic incompatibility,CI);通过释放携带Wolbachia雄虫来控制靶标昆虫的技术也被称为昆虫不相容技术(incompatible insect technique,IIT)。与SIT相比,IIT的优势是以Wolbachia为基础的昆虫绝育技术对于雄蚊的交配竞争力和生存力的影响极小。Curtis等[2]提出IIT-SIT相结合的理念来控制蚊虫,即利用低剂量辐射使混在雄蚊中的少部分残存雌蚊完全绝育,而不影响雄蚊的交配竞争力和存活力,但该方法的可行性一直未获得现场试验的证实。近10年来,由于在蚊宿主间人工转染Wolbachia技术的成功突破,IIT再度引起人们的兴趣。

白纹伊蚊(Aedes albopictus)是全球范围最具有侵略性的入侵物种之一,是中国大陆登革病毒和寨卡病毒等病原体的主要传播媒介,传统的蚊媒控制方法对白纹伊蚊的控制效果不佳。白纹伊蚊天然携带2种Wolbachia菌型(wAlbA和wAlbB),使建立基于Wolbachia的蚊虫种群压制策略更复杂。本文报道了通过人工转染建立和鉴定了携带3种Wolbachia菌型的(wAlbA、wAlbB和wPip)白纹伊蚊HC蚊株,应用昆虫不相容技术结合昆虫绝育技术(IIT-SIT),将大规模生产的大量雄性白纹伊蚊成蚊在开放式试验场进行释放试验。结果显示,经过2~3年持续释放HC雄蚊,基本在2个试验现场清除了白纹伊蚊的种群数量,并且没有种群替换发生(图 1)。

图 1 IIT-SIT技术控制登革病毒媒介白纹伊蚊 Fig. 1 Developing IIT-SIT approach to control Aedes albopictus, the vector of Dengue virus
1 应用于IIT-SIT技术的白纹伊蚊HC蚊株的建立及特性鉴定

应用于昆虫不相容技术的蚊株,其体内携带的Wolbachia必须满足以下条件:1)靶标菌株能在宿主体内诱导高水平的胞质不相容性,这样使野外雌蚊绝育的效率才符合要求;2)靶标菌株要有高效的母系遗传能力,以便大规模生产携带靶标菌株的雄蚊;3)靶标菌株对宿主蚊的生存能力影响极小,以保证释放的雄蚊具有足够的交配竞争能力,可以与野外雄蚊竞争野外雌蚊的交配权。另外,从虫媒病传播阻断安全的角度考虑,释放的携带Wolbachia菌的蚊虫对病原体传播的媒介效能应该低于野外同类种群。

我们通过胚胎显微注射技术,将库蚊体内的Wolbachia wPip转移到白纹伊蚊体内,建立了可适用于IIT的携带3株Wolbachia菌型的白纹伊蚊HC蚊株(wAlbA、wAlbB和wPip)。实验室双向杂交试验显示,HC雄蚊与白纹伊蚊广州野生株(GUA)雌蚊交配后,GUA雌蚊产下的7578个蚊卵全部不能孵化,证明HC雄蚊可使野生雌蚊发生单向完全CI。而HC雌蚊不论与HC雄蚊还是GUA雄蚊交配,都没有发生CI现象。

通过荧光定量PCR和原位杂交技术(FISH),发现HC雌蚊卵巢中Wolbachia密度明显高于GUA雌蚊,这保证了Wolbachia在HC蚊株的子代能够维持100%的母系遗传。同时发现,wPip的共生轻微降低了HC雄蚊的交配竞争力,但对蚊虫其他种群适应性没有明显影响[4]。另外,wPip对HC雌蚊横向和垂直传播登革热病毒和寨卡病毒都有显著的抑制作用。这些结果提示,白纹伊蚊HC蚊株符合IIT控制蚊虫的要求。

为了验证wPip在野生白纹伊蚊种群传播产生种群替换的能力, 我们在饲养有GUA种群的实验室蚊笼中释放不同比例HC雌蚊, 发现超过一定阈值时, wPip可以侵入野生种群;而同时释放HC雄蚊, 可进一步加速种群替换的发生.这些结果提示利用HC雄蚊控制野生种群时, 如果意外释放HC雌蚊, 会导致wPip侵入目标种群的风险, 而且随着HC雄蚊的释放这种风险会增加.而后, 我们在"模拟现场"(半现场)测试了低剂量射线对防止意外释放HC雌蚊而导致种群替换的效果[5].首先在半现场大蚊笼中人工建立起稳定的野生GUA种群, 随后, 辐射HC(IHC)雄蚊的释放数量按照IHC与GUA的比例为5:1进行释放, IHC雌蚊则模拟在IHC雄蚊中2%的混雌率.在我们前期的研究中, 这个辐射剂量足以使HC雌蚊完全绝育,但对HC雄蚊的交配竞争能力几乎无影响.在半现场中, 通过释放经辐射的HC雄蚊, 可以成功根除野生GUA种群数量, 并且没有发生种群替换.进一步利用数学模型模拟了半现场中目标种群的动态, 结果支持IHC和GUA为5:1的释放量足以有效压制目标种群数量, 甚至达到根除目的。

2 应用IIT-SIT压制白纹伊蚊种群的现场试验

前期的研究结果和理论分析提示应用HC蚊株开展IIT-SIT技术具有根除白纹伊蚊野生种群的可能性,而且可以预防由于释放极少量HC雌蚊而导致非计划性的种群替换发生。在获得中国农业部田间试验许可后,我们优化了HC雄蚊大规模生产流程,在中国登革热主要流行地广州的2个独立岛的居民居住区域,开展了开放式田间试验。

释放HC雄蚊前,先在测试区域开展了1年的野外蚊媒本底调查。在蚊媒孳生季节(3月至11月),在释放区域和对照区域使用诱蚊诱卵器(Ovitrap)每周采集蚊卵,结果显示释放区域和对照区域的野生白纹伊蚊的蚊卵孵化率和幼虫数量都没有明显差异,确认了对照区域的合适性。

在现场试验期间,于蚊虫繁殖季节(3月至11月)每一个现场试验点多点持续释放HC雄蚊,每周2~3次(试验点1每周释放3次,试验点2每周释放2次),每周用诱卵器和BG-Sentinel成蚊诱捕器监测野外白纹伊蚊种群数量的变化。

2015年,在现场试验刚开始时,仅在试验点1释放,试验开始时只有IIT,没有射线介入。由于混雌主要靠人工检查,生产的HC雄蚊数量有限(仅有IIT,无SIT)。诱卵器采集的蚊卵孵化率反映HC雄蚊与野外白纹伊蚊雌蚊交配所产生的细胞质不相容性所导致的胚胎死亡情况。2015年3月12日至5月21日,根据每个诱卵器蚊卵孵化的数据,在现场试验点释放HC雄蚊压制野外白纹伊蚊种群的效率达到55%。然而这个效果在5月末白纹伊蚊高峰季节到来后却未能维持,HC雄蚊对野外白纹伊蚊雄蚊的比例持续降低。在6月16日增加释放HC雄蚊数量后,试验点1的野外白纹伊蚊种群开始下降。从幼虫和成蚊监测效果来看,和对照点相比较,2015年试验点1的白纹伊蚊种群数量分别下降62%和65%。

2016至2017年,在HC雄蚊的蚊蛹阶段用射线绝育混杂的少数雌蚊代替人工检雌,即IIT结合SIT。这样HC雄蚊的产量增高,可以在试验点1和试验点2高密度释放。在2个试验点,捕获的成蚊和蚊卵数明显下降。2016至2017年,我们比较试验点和对照点,每个诱卵器诱捕到的蚊卵数年均下降了94%,而且连续13周诱卵器中没有活卵。成蚊诱捕器捕获到的野生白纹伊蚊成蚊年下降率为83%~94%,且连续6周没有监测到成蚊。而且,蚊卵孵化率下降与捕获到的蚊卵和成蚊数量下降一致,说明持续的胞质不相容发生导致白纹伊蚊种群数量下降,而不是其他因素的影响。

我们对释放点不同区域种群压制效果进行了空间动态分析。在被植被包围、交通不便的独立区域如试验点1的12~19区,试验点2的1~3区域,观察到高压制效率。而在交通要道、独立性不好的区域,如试验点1的10和11区附近正在建1座桥,20~22区邻近轮渡码头;在试验点2的7和8区摩托交通频繁,压制效率相对较低,提示人类活动强化了外围蚊虫迁移到释放区域,影响了根除白纹伊蚊的效率。

释放HC雄蚊数量与野生雄蚊数量的比例对于种群压制效果至关重要,根据数学模型和半现场释放的数据,我们将释放的HC雄蚊和野外白纹伊蚊雄蚊的比例设定为5:1。通过监测现场捕获的白纹伊蚊雄蚊中wPip,我们估算实时HC和GUA的比例,并动态调整HC雄蚊释放量使HC与GUA的比例达到5:1以上。2015年,释放的HC雄蚊数量偏少故压制效果偏弱,HC和GUA的平均释放比例是4.4:1。2016-2017年,HC和GUA的年平均释放比例为8.7~15.8,雄蚊释放量增加则种群压制效果明显。

释放HC雄蚊对野生雄蚊的交配竞争能力可以通过诱卵器采集到的蚊卵孵化率来推算。2015年,释放的雄蚊未经过射线处理,实验室研究显示,HC株雄蚊和野生雄蚊的交配竞争能力没有显著差异,试验点蚊卵孵化率和预期一致。然而在2016和2017年,释放的HC雄蚊在蛹期经过射线处理,试验点观察到的蚊卵孵化率比预期高1.5~2.1倍。结合其他实验室蚊笼试验结果,提示经过放射处理的HC雄蚊交配竞争力下降,是野生雄蚊的0.5~0.7。下降的HC雄蚊交配竞争力可以通过增加雄蚊的释放量来补偿。

由于HC雌蚊的偶然释放可能会导致非计划的种群替换,进一步可导致种群压制的失效,特别是随着种群压制策略的推进,携带wPip的雌蚊对野外雌蚊的比例增加,因此在释放前和释放后,必须非常细致地监测携带wPip的雌蚊数量。2016-2017年,释放HC雄蚊时平均混雌率为(0.24±0.03)%,这个数据远低于半现场大蚊笼种群替换的混雌比例临界数据。在半现场模拟释放试验中,释放HC雄蚊的混雌率在2%以下可以成功防止种群替换的发生。在射线介入下,即使释放2%的混雌也不会发生种群替换。

在释放现场,监测到携带wPip的雌蚊比例有时比释放前检测时的混雌率要高,这可能是不同性别的HC蚊在死亡率和诱捕器捕获率上有差异。释放前的HC雄蚊混雌率与现场试验点2捕获的携带wPip的雌蚊比例一致,但与现场试验点1并不一致。这提示在当时捕获的携带wPip的雌蚊是我们释放的,而不是野外繁殖产生的。如果是野外建立了携带wPip的种群,那么种群压制策略在早期有效后,随后预期白纹伊蚊种群数量会增加,并伴随着胞质不相容(CI)水平的下降(即雄蚊和携带wPip的HC雌蚊相容性交配会增加)。然而,无论采集到的卵还是成蚊(包括野生白纹伊蚊和携带wPip的白纹伊蚊)的数量都没有在一段时间内增加。同时蚊卵孵化率也没有因为相容性杂交而增加。另外,捕获的蚊卵孵化的幼虫几乎都是wPip阴性。在监测期间共放置1844个诱卵器,其中在14个分散场所的16个诱卵器监测到携带wPip阳性的幼虫孵出,说明偶然释放的混在大量雄蚊中的雌蚊,只有极少数雌蚊有后代。是否长期混雌的雄蚊释放会导致种群替换的发生还不能确定。但是,射线的使用防止了HC雌蚊的偶尔释放,而且射线处理过的雄蚊也能使混杂的雌蚊绝育,进一步减少种群替换的风险。

种群压制的成功也增加了社区对现场试验的支持度。对社区居民访问调查的结果显示,释放前13.0%居民支持,76.4%中立,10.6%不支持。随着种群压制的成功,居民态度有显著改变,54.3%的居民在访问中表示支持,可能是与白纹伊蚊的叮咬率减少有关。

进一步的人工诱捕雌蚊法证明白纹伊蚊种群压制的有效性,以及在阻断蚊媒病传播方面的重要性。试验点的叮咬率与对照点相比,试验点1和试验点2平均分别下降了96.6%和88.7%。叮咬率的下降,进一步提升了居民对控蚊试验的支持。

3 IIT-SIT技术在蚊媒控制领域的应用前景

在2年的现场试验期间,应用IIT-SIT技术在2个试验点几乎清除了白纹伊蚊野生种群。在现场试验点少数区域(交通要道),残留的少量白纹伊蚊可能是从试验区外围迁移的,种群遗传学分析也证明了这种可能性。种群替换的可能性要求释放的蚊虫传播蚊媒病原体的媒介效能必须比野生种群低。本文结果显示,与野生的天然携带wAlbA和wAlbB比较,wPip显著降低了蚊媒病毒的传播。因此如果释放雄蚊时偶尔混雌导致种群替换发生,原先具有传病能力的种群被破坏,被对病原体有抑制作用的种群替代,在长期或短期内都是有益的。然而,种群压制更可取,公众更容易接受。因为种群压制可以减少蚊虫骚扰和叮咬。

IIT-SIT技术是一种环境友好、低成本、安全有效的蚊虫控制方法,因为释放的雄蚊会主动寻找雌蚊,故适宜在传统蚊媒控制方法不能处理的复杂环境进行蚊媒控制;相比于单独使用IIT,IIT-SIT技术雄蚊产量高,可以释放更多的雄蚊,同时阻止偶尔释放的雌蚊。区域性应用IIT-SIT技术将促进该技术的发展,特别是扩大雄蚊的生产量可使大规模雄蚊释放更有效。

研究成果以题为"Incompatible and sterile insect techniques combined eliminate mosquitoes"的长文在Nature发表。

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