南京农业大学学报  2020, Vol. 43 Issue (2): 238-246   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201905042
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文章信息

李沛曈, 迟天华, 刘颖鑫, 范宏虹, 王海滨, 管志勇, 房伟民, 陈发棣, 张飞
LI Peitong, CHI Tianhua, LIU Yingxin, FAN Honghong, WANG Haibin, GUAN Zhiyong, FANG Weimin, CHEN Fadi, ZHANG Fei
异色菊×菊花脑种间杂交F1代SSR遗传多态性分析、耐旱性鉴定及关联分析
Genetic polymorphism analysis, evaluation of drought tolerance and association analysis using SSR markers in the interspecific Chrysanthemum dichrum×C.nankingense F1 hybrids
南京农业大学学报, 2020, 43(2): 238-246
Journal of Nanjing Agricultural University, 2020, 43(2): 238-246.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201905042

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收稿日期: 2019-05-16
引用本文
李沛曈, 迟天华, 刘颖鑫, 等. 异色菊×菊花脑种间杂交F1代SSR遗传多态性分析、耐旱性鉴定及关联分析[J]. 南京农业大学学报, 2020, 43(2): 238-246.
LI Peitong, CHI Tianhua, LIU Yingxin, et al. Genetic polymorphism analysis, evaluation of drought tolerance and association analysis using SSR markers in the interspecific Chrysanthemum dichrum×C.nankingense F1 hybrids[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2020, 43(2): 238-246.  DOI: 10.7685/jnau.201905042
异色菊×菊花脑种间杂交F1代SSR遗传多态性分析、耐旱性鉴定及关联分析
李沛曈 , 迟天华 , 刘颖鑫 , 范宏虹 , 王海滨 , 管志勇 , 房伟民 , 陈发棣 , 张飞     
南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/园艺学院, 江苏 南京 210095
收稿日期：2019-05-16
基金项目：国家自然科学基金项目（31870306）；江苏省优势学科建设工程项目
作者简介：李沛曈, 硕士研究生
通信作者：张飞, 副教授, 硕导, 主要从事菊花遗传育种研究, E-mail:zhangfei@njau.edu.cn.
摘要：[目的]本文旨在评价二倍体异色菊和菊花脑种间杂交F1代的耐旱性和遗传多态性，为育种材料筛选提供参考依据。[方法]通过盆栽模拟干旱处理测定异色菊×菊花脑种间杂交F1代的萎蔫指数、叶片相对含水量、株高、根长、地下部鲜质量、地下部干质量、地上部鲜质量、地上部干质量、鲜质量根冠比和干质量根冠比等10个形态指标，通过主成分分析和隶属函数法鉴定耐旱性，利用SSR分子标记研究其遗传多态性，并实施关联分析。[结果]干旱胁迫下异色菊×菊花脑种间杂交F1代群体数量性状表现差异较大，变异系数为10.99%~59.84%。主成分分析将10个形态指标归纳为4个主成分，可以解释67.57%的表型变异，其中地上部干质量、地下部干质量、地上部鲜质量、地下部鲜质量、萎焉指数和干质量根冠比的权重较大，说明与耐旱性密切相关；基于这6个耐旱相关指标平均隶属函数值的聚类分析将供试材料分为强抗旱、抗旱、低抗旱和不抗旱4类，平均隶属函数值为0.61、0.46、0.36和0.27。33对EST-SSR引物共扩增出198条带，其中多态性带170条，多态性比率为85.8%，相似系数为0.45~0.86，平均值为0.7；基于多位点关联分析方法挖掘到4个SSR位点与地上部干质量、地下部鲜质量和萎焉指数3个耐旱相关指标显著关联（LOD>2.5），表型变异解释率为4.03%~15.11%。[结论]初步明确了异色菊×菊花脑种间杂交F1代群体耐旱性和遗传多态性水平，获得一批优异耐旱种质，将为菊花耐旱性遗传改良提供重要材料。
关键词：菊花近缘种   遗传多态性   耐旱性   分子标记   
Genetic polymorphism analysis, evaluation of drought tolerance and association analysis using SSR markers in the interspecific Chrysanthemum dichrum×C.nankingense F1 hybrids
LI Peitong, CHI Tianhua, LIU Yingxin, FAN Honghong, WANG Haibin, GUAN Zhiyong, FANG Weimin, CHEN Fadi, ZHANG Fei    
State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement/College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] In order to obtain valuable breeding materials, drought tolerance and genetic diversity in the intersepecific F1 hybrids between diploid species Chrysanthemum dichrum and C.nankingense were investigated. [Methods] The 10 morphological traits, including the fresh and dry weight of shoot and root, root length, wilting index, relative water content, dry root-shoot ratio, and fresh root-shoot ratio under drought stress, in the interspecific C.dichrum×C.nankingense F1 hybrids were measured by potted simulated drought treatment. Their phenotypic values were used to evaluare drought tolerance using principal component analysis and membership function method. Their SSR marker informations were used to investigate the genetic polymorphism, and all the above data were used to conduct multi-locus association studies for drought tolerance. [Results] The results showed that all the traits under study had a moderate high variation under drought tress, with the coefficient of variation from 10.99% to 59.84%. Four principal components explained 65.57% of the total phenotypic variation, in which the fresh and dry weight of shoot and root, wilting index and dry root-shoot ratio were significantly correlated with drought tolerance. The above six drought tolerance-related traits were used to conduct membership analysis. As a result, these individuals were clustered into four groups, being strong drought tolerance, moderate drought tolerance, low drought tolerance and no drought tolerance, and their average membership function values were 0.61, 0.46, 0.36 and 0.27, respectively. Thirty-three pairs of EST-SSR primers yielded a total of 198 amplified bands, of which 170 were polymorphic bands. The polymorphic ratio was 85.8%, and the similarity coefficient ranged from 0.45 to 0.86 with the average of 0.7. Multi-locus genome-wide association studies identified 4 SSR markers that were significantly associated with drought-tolerance related traits(LOD>2.5), including shoot dry weight, root fresh weigh and wilting index. The explained phenotypic variation ranged form 4.03% to 15.11%. [Conclusions] This study preliminarily defined the drought tolerance and genetic polymorphism of interspecific C.dichrum×C.nankingense F1 hybrids, and the excellent drought-tolerant germplasm identified here will provide important materials for future chrysanthemum breeding works targeting drought tolerance.
Keywords: Chrysanthemum related species    genetic polymorphism    drought tolerance    molecular markers   

干旱是影响植物生长发育和产量的重要非生物逆境因子, 随着温室气体排放导致的全球变暖, 干旱持续期和发生地域也将进一步延长或扩大[1-2]。

菊花(Chrysanthemum morifolium)是我国传统名花和世界重要切花之一, 具有很高的观赏和经济价值。干旱缺水的环境条件常常导致菊花观赏品质和产量降低, 并且在切花菊上表现尤为明显[3-4]。研究表明, 受到干旱胁迫时菊花叶片微结构[5]和生理指标[6]均会发生明显变化。Li等[7]评价了切花菊品种资源的耐旱性, 并通过关联分析挖掘了部分耐旱性分子标记。另外, 有关菊花耐旱性相关基因的研究也取得了良好进展[8-10]。我国有丰富的菊花近缘野生种属植物, 且具有较强的抗逆性。这些近缘野生资源的挖掘和有效利用将有助于抗逆性状的遗传机制研究和优异基因挖掘, 为栽培品种的抗逆性改良奠定基础。Sun等[11]将耐旱性较强的野菊与耐旱性较差的观赏菊杂交, 证明远缘杂交可以获得强耐旱性的后代群体。虽然关于菊花耐旱性研究已有相关报道, 但是菊花耐旱育种进展仍比较滞后。

本研究拟通过盆栽模拟干旱处理和隶属函数法评价菊花二倍体近缘种异色菊(强抗旱)、菊花脑(低抗旱)及其种间F1杂交群体耐旱性的遗传变异, 并利用SSR分子标记分析该种间F1群体的遗传多态性, 以期挖掘优异耐旱育种中间材料, 为菊花耐旱性连锁作图和遗传改良提供参考依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

供试材料为菊花二倍体近缘种异色菊(Chrysanthemum dichrum)和菊花脑(C.nankingense), 保存于南京农业大学中国菊花种质资源保存中心。2015年秋, 以异色菊为母本、菊花脑为父本, 采用人工辅助授粉方式进行杂交, 次年3月穴盘播种, 共获得87个株系的F1代分离群体。2016年5月, 将杂交亲本及其F1代进行扦插, 生根后定植于南京农业大学湖熟花卉基地, 常规大田管理。

1.2 耐旱性鉴定

2017年6月, 将亲本和87个杂交株系的插穗扦插于口径6 cm、高度11 cm的穴盘中, 基质为蛭石和营养土(体积比3:1), 插穗生根后长至10叶龄时停止浇水进行自然干旱处理, 对照处理为正常浇水。干旱处理20 d后调查植株萎蔫情况, 包括萎蔫指数(WI)、叶片相对含水量(RWC)、株高(PH)、根长(RL)、地下部鲜质量(RFW)、地下部干质量(RDW)、地上部鲜质量(SFW)、地上部干质量(SDW)、鲜质量根冠比(FRSR)和干质量根冠比(DRSR)共10个抗旱相关性状。试验采用完全随机区组设计, 干旱处理共2个重复, 每个重复6株幼苗。

1.2.1 萎焉指数

采用6级标准观察记录萎蔫情况。1级:植株挺直, 叶片自然伸展, 基本没有出现萎蔫; 2级:植株基本挺直, 植株叶片的1/4下垂; 3级:植株叶片的1/2萎蔫; 4级:植株叶片的3/4下垂; 5级:植株顶端萎蔫弯曲, 所有叶片皱缩萎蔫; 6级:植株干枯, 叶片发黄。

1.2.2 叶片相对含水量

对照和处理的幼苗, 每株采取2片成熟、无病虫害的叶片, 首先用天平测其鲜质量, 然后将叶片用纸包好放入有水的穴盘孔中, 浸泡一夜, 次日将叶片用纸吸干水分测量其饱和质量; 最后将叶片置于80 ℃烘箱内48 h, 测其干质量。相对含水量(RWC)=(mf-md)/(mt-md)× 100%。式中:mf为叶片鲜质量; md为叶片干质量; mt为叶片充分吸水12 h后的饱和质量。叶片均为植株上部第3~4片完全叶。

1.2.3 干旱胁迫指数

采用王艳慧等[12]的方法, 各指标均采用胁迫指数的方法表示, 单项指标的胁迫指数=处理测定值/对照测定值×100%。

1.2.4 隶属函数法

采用隶属函数法求出每个指标的隶属函数值。计算公式为:若该指标数据与抗旱性是正相关关系, 则Xi=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin); 若该指标数据与抗旱性是负相关关系, 则Xi=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)。式中:X为某个基因型(株系)某个指标的测定值; Xmin和Xmax为所有株系该指标的最小值和最大值。通过主成分分析筛选耐旱相关指标, 并对各材料所有耐旱相关指标的平均隶属函数值进行聚类分析。

1.2.5 相关性分析

利用SPSS 20.0分析耐旱相关指标间的Pearson相关性。

1.3 基因组DNA提取及检测

采取新鲜嫩叶, 采用Porebski等[13]的方法提取基因组DNA。用核酸仪检测DNA的浓度和纯度, 采用8 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。读取样品浓度后用ddH2O稀释至50 ng·μL-1, -20 ℃保存备用。

1.4 SSR分子标记

EST-SSR引物设计采用Wang等[14]的方法, 并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。先选取异色菊和菊花脑2个亲本进行第1轮引物筛选, 再从杂交后代中随机选取4个株系连同亲本完成第2轮引物筛选, 最后利用筛选出的33对引物(表 1)对亲本及其87株杂交后代进行全基因组分子扫描。SSR-PCR体系为:10×PCR Buffer 2.5 μL, Mg2+ 1.50 mmol·L-1, dNTPs 0.20 mmol·L-1, 正、反向引物各4 μL, Taq DNA聚合酶1.0 U, 模板DNA 35 ng。所用试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司。

表 1 33对SSR引物序列 Table 1 Sequence of the 33 pairs of SSR primer used in this study
引物序号Primer code 正向引物Forward primer(5′→3′) 反向引物Reverse primer(5′→3′) 重复碱基Repeat motif
8 CGTCACCCTTGGCTGTTAAT GGTTGAAAGCAAATAGGGCA TGA
17 TCATCTCTCAACCCACTATACCAA GTTTCTGTGGTGGTGGTGGT AC
18 TATCCCACTATGCCCACCAC CACGAATTGGGTCTTTCTGG CAC
23 CAATCTCATCATCCCCATCC GTGGCGTGTTGTAGGTGTTG CAA
32 TAACTACGCCGTTGACCCTT CGGCCTCTGAGTCGTAGAAG AAG
34 CCTAGTATCAAAGCTGCGAACA CAATCGCGTTATCGTGTACC AGATGG
37 CCACCACCTTCCTTCTTTGA ATGGAAGTGCCCATGAGTTC AC
50 TGTGGTCCCAATGAAAGTGA CTCCATCAAATGGCGAAAAG CCT
53 TCGAAGACAATCAGCACCTG TAAGTGTTCTTCCAGCGCCT ATG
76 TACACCACCTGCCTACCCTC GATGTTACACGGCGAGACCT AAGA
88 AAGGTTACATCGCTCCATCG CACGAGTGTAGTCTTTCCACAA TAT
99 ACGTTAGACCCGCGTTAAAA CGTTTCAAAAGGCGTACAAA TAATGG
104 AGACGAGAGGAGGGGATTGT TCTTCGAAACCTCAGCCTGT AAC
123 ATTTCCCATTGGTTCCTTCC GGTTTTTGGGTGCAAAAGAA GAAAGA
130 TTGATATGGAGGTTGGAGTGG GGACGATTTAGTTCCGGTGA TAA
140 TCCCTTCTCTATCTCCTCCTCC GCAGGATGCATATGTGTTGG ACC
149 CCTAGTATCAAAGCTGCGAACA CAATCGCGTTATCGTGTACC ATC
155 ACCTGTTTAGAAAACCGGGG ATTTTGAATCGTGTCCGCTC CTC
162 GCACCTCCACCACTACCACT GTCCAGATCTACTCGGCCTG CT
166 CATGTCACTTCCACGTCACC TTCTTTTCTGCCTTTGGTGC CA
170 GCCTTGAGGTGGTTGTTCTG GGCAAGTCCGCGTAGTAGAA TTGATT
179 GGTTCTTTGGATGGGAATGA TCAAGACTCCCCCTCACATC AATGGG
180 GGTTTTTGGATTGGCGACTA AACTTGGCGTGTTTGATTCC ACGT
185 GTTCAGCATCCTAGCCAAGC CCACGATACCCCATGCTTAC CA
187 TAGGCGAACGAGTGTCAAGA GCCATCAGTCTCTCCCTCAG CA
193 AACCATTTCCTTCACCCCTC TTTCGAACTTTGCAGTCGTG AT
200 CCCAGAGAAGCGTGAGATTT TCCCCTGCTACTACCACCAC GGT
205 TGTCGATCATCCCAAGTTTC TTTAAGCCCTGGTACATCGG CAA
206 TCCTGCTTTACCCACCATTT GGTTGGTTACAATTCCGGTG AACA
212 GGAAGAGGAGGAAGAGGACG CGTTTAGGGCTGCTTCTTTG AAGAGG
214 TGTCAAGCACAAATCGAGGA GTTGGCAACCGAAATTCAAC GA
231 TATAGGGGCCCCATCTTTTC CACATGGAAAAAGAGCAGCA CT
234 AAAACAAGGGAGAAGTGGGG GCCGCCAATTCAAGATTTTA TG
表选项

根据SSR-PCR扩增产物的电泳结果, 在100~750 bp某个相同迁移率位置上有DNA条带的记为“1”, 没有DNA条带的记为“0”, 因不同原因造成带型不清或数据缺失的记为N(在后续软件分析中根据不同软件的录入数据要求转换成相应的记录形式)。

1.5 关联分析

利用多位点关联分析软件包mrMLM[15-16]中的FASTmrEMMA、FASTmrMLM、ISIS EM-BLASSO、mrMLM、pKWmEB和pLARmEB 6种模型, 对耐旱相关性状进行关联检测。若阈值LOD>2.5则认为该标记位点与耐旱性有显著关联, 并计算该标记位点的表型解释率和表型效应值。

2 结果与分析 2.1 异色菊×菊花脑种间杂交F1代形态指标的干旱胁迫指数

由表 2可知:各性状的干旱胁迫指数差异较大, 变异系数为10.99%~59.84%, 其中根长和株高的干旱胁迫指数变异系数较小, 分别为10.99%和18.99%;其他性状干旱胁迫指数变异系数较大, 为23.19%~59.84%。各性状的干旱胁迫指数呈连续性分布, 其中地上部干质量、地下部干质量、萎蔫指数和株高近似正态分布, 其他性状呈偏态分布(表 2, 图 1)。

表 2 异色菊×菊花脑种间杂交F1代形态指标的干旱胁迫指数 Table 2 Summary of drought stress index of morphological indicators of the interspecificChrysanthemum dichrum×C.nankingense F1 hybrids
指标
Index		 最小值
Minimum		 最大值
Maximum		 平均值
Mean		 标准差
SD		 变异系数/%
CV		 偏度
Skewness		 峰度
Kurtosis		 正态性检验
P-value
SDW 0.31 0.99 0.69 0.16 23.19 -0.07 -0.57 0.20
RDW 0.07 1.62 0.83 0.28 33.73 0.36 0.18 0.20
SRW 0.04 1.26 0.48 0.20 41.67 1.19 2.13 0.01
RFW 0.02 1.36 0.46 0.22 47.83 1.50 3.50 0.01
RL 0.61 1.17 0.91 0.10 10.99 0.12 0.62 0.16
WI 0.16 1.00 0.60 0.21 35.00 -0.21 -0.75 0.20
PH 0.34 1.09 0.79 0.15 18.99 -0.55 0.55 0.20
RWC 0.01 2.04 0.54 0.31 57.41 1.38 4.76 0.00
DRSR 0.11 6.84 1.22 0.73 59.84 5.35 40.22 0.00
FRSR 0.01 2.46 0.99 0.37 37.37 0.78 3.44 0.17
  注:1)SDW:地上部干质量(g)Shoot dry weight; RDW:地下部干质量(g)Root dry weight; SRW:地上部鲜质量(g)Shoot fresh weight; RFW:地下部鲜质量(g)Root fresh weight; RL:根长(cm)Root length; WI:萎蔫指数Wilting index; PH:株高(cm)Plant height; RWC:叶片相对含水量Relative water content; DRSR:干质量根冠比Dry root-shoot ratio; FRSR:鲜质量根冠比Fresh root-shoot ratio. 2)P-value>0.05视为符合正态分布。P-value>0.05 indicates a normal distribution.下同。The same as follows.
表选项
图 1 异色菊×菊花脑种间F1代群体形态指标干旱胁迫指数的频次分布 Fig. 1 Frequency of drought stress indices of morphological indicators ofthe interspecific C.dichrum×C.nankingense F1 hybrids
图选项
2.2 异色菊×菊花脑种间F1代群体形态指标耐旱胁迫指数的相关分析

相关性分析结果表明, 不同抗旱指标之间存在相关性(表 3)。其中9对抗旱指标间存在极显著相关性(P < 0.01)。例如, 地上部干质量与地下部干质量、地上部鲜质量、地下部鲜质量极显著正相关; 地下部干质量与地上部鲜质量、地下部鲜质量极显著正相关; 地上部鲜质量与地下部鲜质量极显著正相关。

表 3 异色菊×菊花脑种间F1代群体形态指标耐旱胁迫指数之间的相关系数 Table 3 Correlation coefficients between drought stress indices of morphological indicators ofthe interspecific C.dichrum×C.nankingense F1 hybrids
指标Index SDW RDW SFW RFW RL WI PH RWC DRSR
RDW 0.466**
SFW 0.404** 0.419**
RFW 0.383** 0.445** 0.643**
RL 0.013 0.054 0.038 0.134
WI 0.180 0.014 0.179 0.204 -0.001
PH 0.207 0.234* 0.268* 0.208 -0.116 -0.020
RWC 0.127 0.148 0.268* 0.359** 0.118 0.499** 0.117
DRSR -0.213* 0.124 -0.103 0.028 0.202 0.072 -0.022 0.184
FRSR -0.006 0.113 -0.077 0.559** 0.143 -0.049 -0.066 0.106 0.156
  Note:*P < 0.05, ** P < 0.01.
表选项
2.3 主成分分析与聚类分析

根据主成分分析方差大于1的原则, 筛选4个主成分为抗旱性评价的综合指标, 4个主成分的累计贡献率为67.57%(表 4)。由表 4和表 5可知:第1主成分解释了28.49%的表型变异, 其中负载量大于0.6的因子为地下部干质量(0.67)、地上部鲜质量(0.76)和地下部鲜质量(0.85);第2主成分解释了15.95%的表型变异, 其中负载量大于0.6的因子为干质量根冠比(0.65)和鲜质量根冠比(0.60);第3主成分的贡献率为12.96%, 其负载量较大的因子是萎焉指数(0.76);第4主成分的贡献率为10.17%, 其负载量较大的因子是干质量根冠比(0.60)。

表 4 前4个主成分的特征根、贡献率和累计贡献率 Table 4 Eigenvalues, contribution rates, and cumulative contribution rates of the loading four principal components
主成分
Principal component		 方差
Variance		 贡献率/%
Contribution rate		 累计贡献率/%
Cumulative contributive rate
1 2.85 28.49 28.49
2 1.60 15.95 44.44
3 1.30 12.96 57.40
4 1.01 10.17 67.57
表选项
表 5 前4个主成分的特征向量 Table 5 Eigenvectors of the leading four principal components
指标
Index		 第1主成分
The first principal component		 第2主成分
The second principal component		 第3主成分
The third principal component		 第4主成分
The fourth principal component
RL 0.14 0.50 -0.19 0.26
PH 0.38 -0.37 -0.03 0.44
SDW 0.64 -0.39 -0.03 -0.09
RDW 0.67 -0.14 -0.25 0.32
SFW 0.76 -0.28 0.00 0.04
RFW 0.85 0.18 -0.26 -0.25
WI 0.38 0.19 0.76 -0.22
DRSR 0.04 0.65 0.06 0.60
FRSR 0.29 0.60 -0.50 -0.42
RWC 0.55 0.37 0.54 0.01
表选项

根据主成分分析筛选出的抗旱指标, 得到平均隶属函数值的变异范围为0.20~0.65, 变异系数为25.64%(图 2)。基于耐旱平均隶属函数值的聚类分析将异色菊、菊花脑及其杂交后代聚为4大类(表 6):第Ⅰ类为不抗旱, 共14个株系, 平均隶属函数值为0.27;第Ⅱ类为低抗旱, 共43个株系, 平均隶属函数值为0.36;第Ⅲ类为抗旱, 共24个株系, 平均隶属函数值为0.46;第Ⅳ类为强抗旱, 共8个株系, 平均隶属函数值为0.61;异色菊抗旱性隶属函数值为0.62, 表现为强耐旱, 菊花脑抗旱性隶属函数值为0.39, 表现为低抗旱。抗旱性最强的为57号株系, 平均隶属函数值为0.65, 抗旱性最差为60号株系, 平均隶属函数值为0.20。

图 2 菊花脑、异色菊及其F1代群体耐旱性平均隶属函数值的频次分布 Fig. 2 Frequency distribution of the average membership function value for drought tolerance ofC.dichrum, C.nankingense and their interspecific F1 hybrids
图选项
表 6 菊花脑、异色菊及其F1代群体耐旱性的K-means聚类结果 Table 6 Results of K-means' cluster analysis of drought tolerance of C.dichrum, C.nankingenseand their interspecific F1 hybrids
类型
Type		 亲本及F1代编号
Code of parents and the F1 hybrids		 份数
Number		 变异幅度
Range		 均值
Average
不抗旱
No drought tolerance		 60、11、230、210、139、160、242、207、105、88、197、31、39、151 14 0.20~0.30 0.27
低抗旱
Low drought tolerance		 126、79、162、10、5、190、145、41、184、36、154、166、220、234、131、14、21、19、206、202、136、250、178、123、30、198、180、171、107、137、111、158、29、244、140、176、菊花脑C.dichrum、191、94、147、164、224、218 43 0.31~0.41 0.36
抗旱
Moderate drought tolerance		 149、175、56、46、238、117、236、214、148、192、228、246、200、18、174、194、208、144、130、129、113、170、15、109 24 0.41~0.52 0.46
强抗旱
Strong drought tolerance		 195、108、248、146、异色菊C.nankingense、227、75、57 8 0.55~0.65 0.61
表选项
2.4 SSR分子标记多态性分析

33对SSR引物组合在异色菊、菊花脑及其87个杂交后代中共扩增得到198条带, 其中多态性条带170条, 多态性比率为85.8%, 平均每对引物扩增出5条多态性条带。相似系数为0.45~0.86, 平均值为0.7。说明供试亲本及其杂种在DNA水平上存在一定的遗传差异。

2.5 耐旱相关性状的多位点关联分析

利用mrMLM界面包中的6种模型分别对相关耐旱性状进行关联分析, 结果(表 7)显示:当阈值LOD>2.5时, 共检测到4个SSR位点与3个数量性状(地上部干质量、地下部鲜质量和萎焉指数)显著关联。从地上部干质量性状看, 5种模型共关联到2个位点, 其中mrMLM和pLARmEB模型均检测到SSR-23-208位点, 其余模型则检测到SSR-8-329位点。对于地下部鲜质量, FASTmrMLM、FASTmrEMMA、pLARmEB和pKWmEB这4种模型具有较强的一致性, 均只检测到SSR-166-469位点。pKWmEB模型在萎蔫指数性状上检测到了1个显著位点SSR-179-355。4个关联位点的表型变异解释率为4.03%~15.11%。

表 7 与耐旱相关性状显著关联的SSR位点及其表型变异解释率 Table 7 The SSR markers significantly associated with drought tolerance-related traitsand their explained phenotypic variation
性状Trait 模型Model 标记Marker LOD ai r2
SDW mrMLM SSR-23-208 2.55 0.080 11.83
FASTmrMLM SSR-8-329 2.69 0.052 4.03
pLARmEB SSR-8-329 3.24 0.053 4.18
pLARmEB SSR-23-208 2.59 0.051 4.82
pKWmEB SSR-8-329 2.69 0.052 11.32
ISIS EM-BLASSO SSR-8-329 2.69 0.052 4.12
RFW FASTmrMLM SSR-166-469 3.08 0.050 8.96
FASTmrEMMA SSR-166-469 3.08 0.097 7.98
pLARmEB SSR-166-469 5.49 0.055 10.82
pKWmEB SSR-166-469 3.97 0.049 15.11
WI pKWmEB SSR-179-355 2.97 -0.049 7.69
  注:LOD:阈值Threshold; ai:QTN效应QTN effect; r2:表型变异解释率Explained phenotypic variation.
表选项
3 讨论与结论

干旱是影响菊花生长最重要的非生物逆境之一。减少干旱对菊花生产造成的损失, 最有效的途径是选育和推广耐旱品种, 因此, 充分发掘其耐旱种质、选育耐旱优良品种是目前国内外菊花育种的重要目标。近年来, 国内外学者以不同作物为研究对象, 从不同角度提出了更加全面的耐旱性鉴定方法, 普遍认为采用多指标多方法相结合的方式评价植物耐旱性更科学、客观, 各指标权重和综合评价是耐旱评价的关键。王宝祥等[17]以91份国内外水稻资源为材料, 采用水作和旱作2种栽培模式考察不同水稻资源抽穗期和成熟期耐旱性差异, 并根据各项指标胁迫系数的隶属函数值将供试品种分为3类:强耐旱、耐旱和敏感; 洪双等[18]利用隶属函数值法评价了107份甘蓝型油菜微核心种质耐旱性, 并筛选出2份高耐旱种质; 孙静[19]和翟丽丽等[20]通过盆栽模拟自然干旱的方法, 利用根冠比、株高、叶绿素相对含量以及地上部和地下部生物量等相关性状的胁迫指数和隶属函数法评价了菊花品种的抗旱性, 发现不同品种的抗旱性差异较大。本试验通过对抗旱性有关的10个指标进行主成分分析, 筛选出地上部干质量、地下部干质量、地上部鲜质量、地下部鲜质量、萎焉指数和干质量根冠比等指标与抗旱性密切相关, 基于平均隶属函数值的聚类分析将异色菊×菊花脑种间杂交F1代群体抗旱性分为不抗旱、低抗旱、抗旱和强抗旱4类。

种间远缘杂交是实现优良农艺性状从一个物种向另一个物种转移的有效途径, 也是作物遗传改良的重要途径[21]。Li等[22]通过远缘杂交成功将野生小麦具有的强适应型和抗条锈病特性导入栽培小麦中。Chen等[23]利用远缘杂交成功开发新的耐盐水稻Spartina种质。在菊花栽培品种的遗传改良研究中, 通过远缘杂交把野生种质资源特有的优良性状进行遗传重组, 育成系列高抗(耐)性菊花新品种, 在抗蚜虫性、花期及株型等育种方面取得了突破性进展[24]。本研究通过将强抗旱的异色菊和低抗旱的菊花脑进行种间远缘杂交, 87个杂交后代发生广泛的性状分离, 鉴定获得7个强抗旱株系和24个抗旱株系。这些强抗旱和抗旱F1株系可作为优异耐旱育种中间材料用于后期菊花耐旱性改良。

分子标记已成为作物育种的重要辅助选择手段, 被广泛应用于作物群体遗传连锁图谱的构建、品种鉴定、基因定位和遗传多样性分析中[25]。黄金凤等[26]通过SSR标记分析‘寒富’ב岳帅’杂交后代的遗传多样性, 20条SSR引物共扩增出54条带, 其中多态性条带49条, 多态性比率为90.7%, 表明杂交组合发生基因分离重组; 李玮瑜等[27]通过SSR标记探讨了亲本及后代群体间的遗传特性和亲缘关系; 杨旭等[28]利用SSR分子标记技术成功鉴别野生茄和栽培茄杂交后代。本研究中, 利用33对SSR引物组合在异色菊、菊花脑及其87个杂交F1代株系中共扩增得到170多态性条带, 多态性比率为85.8%, 说明该种间杂交群体的遗传多样性水平较高。

本研究中, 通过mrMLM软件中6种多位点关联分析方法共检测到4个SSR标记与地上部干质量、地上部鲜质量和萎蔫指数等耐旱相关性状显著关联。耐旱关联标记较少的原因主要是由于多态性SSR分子标记数据样本偏小, 而且多位点关联分析进行多基因背景控制, 降低了假阳性。在今后研究中, 将进一步通过基于高通量SNP分子标记的多位点关联分析挖掘耐旱性相关的优异等位变异。

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