文章信息
- 王敏, 王玮, 吕青骎, 徐幸莲, 周光宏, 李春保
- WANG Min, WANG Wei, LÜ Qingqin, XU Xinglian, ZHOU Guanghong, LI Chunbao
- 间接竞争ELISA方法快速检测猪肉组织中的氯丙嗪
- Rapid detection of chlorpromazine in pork tissue by indirect competitive ELISA
- 南京农业大学学报, 2020, 43(1): 172-177
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2020, 43(1): 172-177.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201812051
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文章历史
- 收稿日期: 2018-12-29
兽药残留作为动物性食品中最重要的污染源之一, 与动物性食品安全息息相关。氯丙嗪(CPZ)属于一种典型的吩噻嗪类抗精神病药物, 主要应用于治疗精神疾病[1-3], 因其较强的镇静和止吐作用也被用于兽医临床[4-5]。农场动物的饲料中添加CPZ可起到镇静催眠、增重催肥、缩短出栏时间的作用, 同时可降低动物的应激反应和维持生命体征的稳定, 减少动物长途运输过程中的失重和死亡率, 防止肉品质降低[6-7]。但是CPZ残留于动物产品中, 会导致食用者发生黄疸病、白细胞减少症和粒细胞缺乏症等不良反应, 对人类健康产生不利影响[8-11]。欧洲药品评估局和联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会在1991年建议CPZ不得用于食用性动物中。欧盟早在1997年颁布的法令(EC)NO.17/97就已明令禁止在饲料中添加CPZ。日本也明确规定CPZ不得在动物源食品中检出。2002年, 我国《动物性食品中兽药最高残留限量》(农业部第235号公告)附录3规定, CPZ药物允许用作治疗, 但不得在动物性食品中检出。可是仍有不法商贩为谋求利益, 在食用动物饲料中非法添加CPZ, 因此, 亟需建立一种简单、快速、有效的CPZ残留检测方法。
目前, 相比其他抗精神病药物, CPZ的残留检测方法仍处于初步应用阶段[12], 其检测方法主要分为2大类。一类为仪器法, 如液相微萃取-液相色谱法[13]、液相色谱-库伦检测法[14]、高效液相色谱法[15]、液相色谱-质谱法[16]、气相色谱-质谱法等[17]。这些方法需要在专业实验室内进行, 且样品前处理繁琐, 检测时间长, 仪器设备昂贵, 需要专业人员操作, 一次只能分析少量样品, 因此这类方法不适合筛选测试。另一类是以抗体、抗原的特异性反应为基本原理建立起来的免疫学快速分析方法, 此类方法具有速度快、方便快捷、高灵敏度和低检测限等优点。酶联免疫吸附法(ELISA)是目前应用最多且最经典的免疫学方法, 特别适用于分析检测大量样品, 由于特异性强, 灵敏度高, 操作简单, 使得该技术在药物残留检测领域得到广泛应用[18-20]。本研究旨在建立一种简便、快速、准确检测猪肉中CPZ的间接竞争ELISA方法, 为畜禽肉中CPZ快速检测提供试验基础, 并应用于动物源食品药物残留的检测。
1 材料与方法 1.1 材料和试剂生鲜猪肉购于南京某超市, 经超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析为CPZ阴性样品。
盐酸氯丙嗪(CPZ)、盐酸异丙嗪(PMZ)、盐酸硫利哒嗪(TDZ)、乙酰丙嗪马来酸盐(APZ)、奋乃静(PCZ)、氟哌啶醇(Hal)和盐酸氟奋乃静(FPZ)均购于德国Dr. Ehrenstorfer公司; 氯丙嗪-牛血清蛋白完全抗原(CPZ-BSA)、鼠抗CPZ单克隆抗体, 均由本中心的实验室自制; 辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠免疫球蛋白(IgG)、四甲基联苯胺(TMB)显色液和终止液均购于美国Cell Signaling Technology公司; 其他试剂均为国产分析纯。
1.2 鼠抗CPZ单克隆抗体的鉴定纯度鉴定:利用SDS-PAGE电泳检测纯化后的鼠抗CPZ单克隆抗体, 然后进行蛋白质条带灰度扫描, 并用Quantity One 4.6凝胶分析软件进行纯度鉴定。
交叉性测定:采用间接竞争ELISA法。将PMZ、TDZ、APZ、PCZ、HAL和FPZ分别包被在酶标板上, 将鼠抗CPZ单克隆抗体作为一抗, 分别以PBS缓冲液(0.01 mol·L-1, pH7.4)和CPZ标准品作为阴性对照和阳性对照, 用HRP标记羊抗鼠IgG为二抗, 室温孵育1 h, 洗涤后用TMB试剂显色, 于酶标仪(美国Bio-Tek公司)450 nm处测定吸光值, 计算交叉反应率(CR)。CR=IC50(CPZ)/IC50(结构类似物)×100%, 其中IC50为半抑制浓度。
1.3 间接竞争ELISA方法的建立1) 抗原包被:在96孔板中每孔加入100 μL稀释好的CPZ-BSA完全抗原, 37 ℃包被2 h后, 弃包被液, PBST(含0.05% Tween-20的PBS缓冲液)洗涤3次, 拍干。2)封闭:每孔加入封闭液(1% BSA)200 μL, 37 ℃孵育2 h后, 弃封闭液, PBST洗涤3次, 拍干。3)竞争结合:先将不同浓度的CPZ标准品溶液依次加入酶标板中, 每孔100 μL, 再加入鼠抗CPZ单克隆抗体, 每孔100 μL, 37 ℃孵育1 h后弃溶液, PBST洗涤3次, 拍干。4)加酶标二抗:每孔加入100 μL稀释至工作浓度的HRP标记羊抗鼠IgG, 37 ℃孵育1 h后弃溶液, PBST洗涤3次, 拍干。5)显色:加入TMB试剂, 每孔100 μL, 室温避光显色15 min; 加终止液(2 mol·L-1 H2SO4溶液), 每孔50 μL, 室温反应5 min, 用酶标仪测定各孔的D450值。
1.4 间接竞争ELISA方法检测条件的优化1) 最佳抗原包被稀释倍数和抗体稀释浓度的确定:采用棋盘滴定法。抗原包被稀释倍数分别为1 : 250、1 : 500、1 : 1 000、1 : 2 000、1 : 5 000、1 : 10 000、1 : 20 000, 抗体稀释浓度分别为10.00、5.00、2.00、1.00、0.50、0.25、0.125和0 μg·mL-1。按照1.2节的步骤操作后测定吸光值, 以D450值为1.0左右时对应的抗原包被稀释倍数和抗体稀释浓度为最佳工作条件。
2) 酶标二抗稀释倍数的确定:在确定的最佳抗原包被稀释倍数和抗体稀释浓度基础上, 将HRP标记羊抗鼠IgG以1 : 500、1 : 1 000、1 : 2 000、1 : 4 000的稀释倍数进行对比试验, 选择D450值在1.0左右的酶标二抗稀释倍数为最佳稀释倍数。
1.5 标准曲线的制作及线性范围的确定将CPZ标准品稀释成10倍系列浓度梯度(0~1 000 ng·mL-1), 在上述最佳条件下, 进行间接竞争ELISA方法测定, 并制作标准曲线。以lgX为横坐标(X为竞争抗原浓度), 以各浓度孔的D450值为纵坐标绘制标准曲线。选择标准曲线呈明显相关的区段, 以lgX为横坐标, 以抑制率为纵坐标绘制标准曲线计算IC50并确定线性范围。抑制率=D/D0×100%, 其中D为加CPZ时的吸光值, D0为空白孔的吸光值。
1.6 方法评价1) 灵敏度测定:灵敏度以检测限(limit of detection, LOD)表示, 按1.2节的检测步骤, 于96孔ELISA酶标板随机选择10个孔进行零标准品测试, 计算D450值的平均值(D0)和标准差(SD)。按照公式LOD=D0+3SD计算, 在标准曲线上算出对应的CPZ质量浓度为此方法的检测下限, 即灵敏度。2)精密度测定:以孔间变异系数及板间变异系数表示该方法的精确度。选择低、中、高3种浓度(1.25、5.00、20.00 ng·mL-1)的CPZ标准品溶液, 同一样品测定2个批次, 每个批次重复测定32次, 计算批内和批间变异系数(CV)。CV=标准差(SD)/平均值(x)×100%。3)准确度测定:以加标回收率来表示该方法的准确度。将不同浓度(1.0、2.0、5.0、10.0 ng·mL-1)的CPZ标准品溶液添加至阴性猪肉糜中, 作为待测样品, 参照1.2节方法检测待测样品中CPZ浓度, 并根据公式计算回收率。回收率=测量质量浓度/实际质量浓度×100%, 以阴性猪肉糜作为空白对照。
2 结果与分析 2.1 鼠抗CPZ单克隆抗体的纯度鉴定将纯化后的鼠抗CPZ单克隆抗体进行SDS-PAGE电泳, 结果(图 1)显示, 纯化后的抗体纯度较高, 能达到95%以上。纯化的CPZ单克隆抗体有2个条带, 一条是蛋白质相对分子质量约为25×103的轻链, 另一条是相对分子质量约为55×103的重链。
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图 1 氯丙嗪(CPZ)单克隆抗体SDS-PAGE电泳图 Fig. 1 Analysis of chlorpromazine(CPZ)monoclonal antibody by SDS-PAGE 1.蛋白质相对分子质量标准Protein molecular weight marker; 2.鼠抗CPZ单克隆抗体Mouse anti-CPZ monoclonal antibody. |
通过间接竞争ELISA方法, 检测鼠抗CPZ单克隆抗体与6种其他结构类似物的交叉反应情况。结果(表 1)显示, 该抗体仅与奋乃静有轻微交叉反应, 交叉反应率为5.74%, 与其他5种结构类似物的交叉反应率均小于0.77%, 说明检测中不容易出现交叉反应。
| 反应标准品 Reaction standard |
半抑制浓度(IC50)/(ng·mL-1)
Half maximal inhibitory concentration |
交叉反应率/%
Cross reaction rate |
| 氯丙嗪Chlorpromazine | 15.38 | 100.00 |
| 奋乃静Prochlorperazine | 267.90 | 5.74 |
| 乙酰丙嗪马来酸盐Acepromazine maleate salt | >2 000 | < 0.77 |
| 盐酸硫利达嗪Thioridazine hydrochloride | >2 000 | < 0.77 |
| 盐酸异丙嗪Promethazine hydrochloride | >2 000 | < 0.77 |
| 氟哌啶醇Haloperidol | >2 000 | < 0.77 |
| 盐酸氟奋乃静Fluphenazine hydrochlorid | >2 000 | < 0.77 |
由表 2可知:当抗原包被稀释倍数和抗体稀释浓度增大时, 吸光值表现为降低趋势。确定抗原包被(CPZ-BSA)的最佳稀释倍数为1 : 10 000, 对应的抗体最佳稀释浓度为1 μg·mL-1。
| 抗体稀释浓度/(μg·mL-1)
Antibody dilution concentration |
抗原稀释倍数Dilution multiple of antigen coating | ||||||
| 1:250 | 1:500 | 1:1 000 | 1:2 000 | 1:5 000 | 1:10 000 | 1:20 000 | |
| 10.00 | 2.865 | 2.658 | 2.557 | 2.086 | 1.797 | 1.528 | 1.142 |
| 5.00 | 2.871 | 2.615 | 2.643 | 1.924 | 1.610 | 1.421 | 1.103 |
| 2.00 | 2.832 | 2.703 | 2.615 | 2.039 | 1.762 | 1.201 | 1.146 |
| 1.00 | 2.890 | 2.681 | 2.586 | 1.818 | 1.294 | 1.026 | 1.115 |
| 0.50 | 2.853 | 2.626 | 2.541 | 1.976 | 1.352 | 1.218 | 0.911 |
| 0.25 | 2.831 | 2.607 | 2.624 | 2.031 | 1.225 | 0.865 | 0.649 |
| 0.125 | 2.847 | 2.631 | 2.645 | 1.502 | 1.143 | 0.774 | 0.485 |
| 0 | 0.106 | 0.076 | 0.059 | 0.044 | 0.027 | 0.015 | 0.011 |
当HRP标记羊抗鼠IgG进行不同稀释倍数稀释时, 随着酶标二抗稀释倍数的增加, D450值由1.647逐渐减小至0.425。当酶标二抗以1 : 1 000稀释时, D450值为1.012, 即为酶标二抗的最佳稀释倍数。
2.4 间接竞争ELISA标准曲线及线性范围的确定由图 2可见:当竞争抗原CPZ的浓度为1.37~111.11 ng·mL-1时, 标准曲线中呈良好的线性关系, IC50为15.38 ng·mL-1。
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图 2 CPZ间接竞争ELISA标准曲线 Fig. 2 Standard curve of indirect competitive ELISA for CPZ |
由表 3可见: D0为0.994, SD为0.002, 计算得出LOD为0.51 ng·mL-1, 即灵敏度为0.51 ng·mL-1。
| 指标 Index |
CPZ零标准品CPZ zero standard | D0 | SD | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |||
| D450 | 0.992 | 0.994 | 0.996 | 0.993 | 0.999 | 0.992 | 0.997 | 0.991 | 0.994 | 0.995 | 0.994 | 0.002 |
由表 4可计算得出:间接竞争ELISA方法第1批次批内CV平均为6.58%, 第2批次批内CV平均为7.35%, 总的批内CV平均为6.97%, 总的批间CV平均为7.01%。本检测方法批内与批间的变异系数均小于10%, 说明该方法精密度较高, 重复性较好。
| ρ(CPZ)/(ng·mL-1) | 第1批(n=32)The first group | 第2批(n=32)The second group | |||||
| 平均值/(ng·mL-1) Mean value |
标准差 SD |
变异系数/% CV |
平均值/(ng·mL-1) Mean value |
标准差SD | 变异系数/% CV |
||
| 20.00 | 19.07 | 1.31 | 6.89 | 19.53 | 1.36 | 6.98 | |
| 5.00 | 5.35 | 0.41 | 7.61 | 5.35 | 0.37 | 6.91 | |
| 1.25 | 1.22 | 0.06 | 5.24 | 1.20 | 0.10 | 8.17 | |
由表 5可见:添加CPZ的质量浓度为1.0~10.0 ng·mL-1时, 回收率为96.90%~118.79%, 说明该方法的准度高, 稳定性好。随样品中CPZ质量浓度的增加, 回收率变异系数减小, 精确度提高, 表明本试验的间接竞争ELISA方法能够满足检测要求。
| 加标质量浓度/(ng·mL-1) Added concentration |
检出值/(ng·mL-1) Founded concentration |
回收率/% Recovery |
变异系数/% CV |
| 1.0 | 1.19 | 118.79 | 8.86 |
| 2.0 | 2.04 | 102.01 | 8.89 |
| 5.0 | 5.22 | 104.34 | 8.11 |
| 10.0 | 9.69 | 96.90 | 7.22 |
目前, 对CPZ残留的检测主要集中在食用性动物领域, 其中猪肉最为广泛。因此, 各国针对CPZ残留制定了相应的标准, 尽管我国食品安全抽检从未放松对CPZ的监测, 但近年来在猪肉中检测出CPZ残留的现象仍屡禁不止[21]。ELISA方法现已成为兽药残留最理想的检测技术之一, 而建立高灵敏ELISA方法的关键在于制备出高效价、高特异性的CPZ单克隆抗体。本研究在已制备的CPZ-BSA和鼠抗CPZ单克隆抗体的基础上, 鉴定抗体纯度能达到95%以上, 即可去除微量杂蛋白的干扰, 使ELISA方法的定量结果更准确。且与盐酸异丙嗪等6种CPZ结构类似物均无明显交叉反应, 说明制备的鼠抗CPZ单克隆抗体的特异性良好。
ELISA方法的检测效果除受抗体特异性影响外, 还受酶标板吸附性能、抗原和抗体的工作浓度等因素的影响, 其中抗体浓度升高会提高测量信号值, 同时会降低方法的检测限, 而包被抗原浓度降低会提高相应浓度竞争物的抑制率, 从而影响结果的准确性[22]。因此, 本研究在制备好抗体的基础上, 采用棋盘滴定法, 确定了抗原包被的最佳稀释倍数为1 : 10 000, 鼠抗CPZ单克隆抗体质量浓度为1 μg·mL-1, 酶标二抗的最佳稀释倍数为1 : 1 000。拟合线性回归方程为y=-1.252 6x+2.853 2(R2=0.986 6), 其检测的线性范围为1.37~111.11 ng·mL-1, 最低检测限为0.51 ng·mL-1, 总的批内CV为6.97%, 总的批间CV为7.01%, 回收率为96.90~118.79%。该方法的检测限远低于文献[23]的50 ng·mL-1, 且基本达到现行有效检测方法[24]中的0.50 ng·mL-1。表明该方法特异性强、灵敏度高、检测限低、稳定性好、重现性好, 且线性范围较宽, 可满足猪肉样本的快速定量检测需求, 而且此方法前处理过程简单, 操作简便, 可同时检测多个样品, 无需昂贵的设备仪器。因此, 本方法的建立有助于解决猪肉中痕量CPZ残留现场快速定量检测的技术难题, 同时也为开展其他药物残留检测技术研究提供新的技术思路。
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