南京农业大学学报  2019, Vol. 42 Issue (6): 1067-1072   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201905019
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文章信息

王馨蔷, 张文圣, 陈兆杰, 朱椿元, 熊伟宏, 杨红
WANG Xinqiang, ZHANG Wensheng, CHEN Zhaojie, ZHU Chunyuan, XIONG Weihong, YANG Hong
线硫醚在水、土壤及2种蔬菜中的残留检测方法
Determination method of exianliumi residues in water, soil and two kinds of vegetables
南京农业大学学报, 2019, 42(6): 1067-1072
Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(6): 1067-1072.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201905019

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收稿日期: 2019-05-13
线硫醚在水、土壤及2种蔬菜中的残留检测方法
王馨蔷 , 张文圣 , 陈兆杰 , 朱椿元 , 熊伟宏 , 杨红     
南京农业大学理学院/江苏省农药学重点实验室, 江苏 南京 210095
摘要[目的]本文旨在建立线硫醚在水、土壤、黄瓜和辣椒中的残留检测方法。[方法]水样中线硫醚用LC-18固相萃取小柱提取、富集;土壤样品采用丙酮和水(体积比为3:1)超声提取,LC-18固相萃取小柱净化;辣椒样品匀浆后用丙酮超声提取,石油醚萃取净化;黄瓜样品匀浆后用丙酮超声提取时加微量甲酸,石油醚萃取,50 mg N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)净化。经前处理的所有样品均采用高效液相色谱-紫外检测器进行定量检测。[结果]高效液相色谱法检测线硫醚,在0.01~10.00 mg·L-1内线性关系良好,相关系数(R2)为0.999 8,仪器最低检出限为0.01 mg·L-1。在试验添加浓度范围内,水中线硫醚的平均添加回收率为97.38%~100.25%,相对标准偏差(RSD)为1.22%~2.40%;土壤中线硫醚的加标平均回收率为92.73%~103.87%,RSD为2.21%~5.63%;黄瓜中线硫醚的加标平均回收率为91.83%~103.91%,RSD为1.11%~6.24%;辣椒中线硫醚的加标平均回收率为91.06%~106.29%,RSD为0.72%~6.76%。[结论]建立的环境介质和2种蔬菜中线硫醚的残留检测方法,其准确度和精密度均能满足环境中农药残留分析的要求。
关键词线硫醚   残留检测   高效液相色谱   样品净化   
Determination method of exianliumi residues in water, soil and two kinds of vegetables
WANG Xinqiang, ZHANG Wensheng, CHEN Zhaojie, ZHU Chunyuan, XIONG Weihong, YANG Hong    
College of Sciences/Jiangsu Key Laboratory of Pesticide Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] The purpose of this study was to report the analytical method of exianliumi residues in water, soil, cucumbers and hot peppers. [Methods] Exianliumi residue in water was extracted, preconcentrated and purified by LC-18 solid phase extraction(SPE). Soil was extracted by acetone-water(3:1, V/V), and purified by LC-18 SPE. Hot pepper samples were extracted with acetone and purified by petroleum ether. Cucumber samples were extracted with acetone added with a little of fomic acid, petroleum ether and then purified by adding 50 mg primary secondary amine(PSA). Exianliumi residues in four different kinds of samples were detected by high performance liquid chromatography with ultraviolet detector(HPLC-UVD). [Results] Exianliumi was determined by HPLC in the range of 0.01 to 10.00 mg·L-1, with the correlation coefficients(R2)being 0.999 8 respectively. The minimum detection limit of the instrument is 0.01 mg·L-1. The spiked recoveries of exianliumi in water ranged from 97.38% to 100.25% with the relative standard deviations(RSD)of 1.22%-2.40%, the soil sample from 92.73% to 103.87% with RSD of 2.21%-5.63%, the cucumber sample from 91.83% to 103.91% with RSD of 1.11%-6.24%, and the hot pepper sample from 91.06% to 106.29% with RSD of 0.72%-6.76%. [Conclusions] The analytical method of exianliumi residues in environmental media and two kinds of vegetables has the accuracy and precision to meet the requirements of pesticide residue analysis in the environment.
Keywords: exianliumi    residue determination    HPLC    sample purification   

随着社会的进步和人民生活水平的提高, 食品安全和环境保护越来越受到重视[1-2], 农药残留是否超标倍受关注, 因此农药残留检测方法被广泛研究[3]。目前, 色谱技术在农药残留检测方面应用程度较高, 通过其独有的色谱检测法, 可以将环境中或果蔬中的农药组分进行分离, 从而定量检测各种基质中的农药含量, 具有较高的灵敏度和准确度[4-5]。高效液相色谱法广泛用于环境及蔬菜等农产品中农药残留的检测[6-8]线硫醚是一种新型抗菌和杀线虫的高效低风险小分子药剂, 可用于控制植物细菌性疾病和根结线虫[9]。目前, 国内外未见有关线硫醚在水环境、土壤及食品中残留检测方法的报道。因此, 为了监控评价线硫醚在环境和食品中的残留动态情况, 建立该农药在环境和食品中的残留检测方法十分必要。本研究建立了线硫醚在水、土壤及2种蔬菜中的残留检测方法。

1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂 1.1.1 主要仪器

万分之一分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司), KH-500型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司), WD-35旋转蒸发浓缩仪(瑞士步琦公司), DLSB-5/20低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司), TD-1型固相萃取仪(美国安捷伦公司), SupelcleanTMLC-18固相萃取柱(美国色谱科公司), HPLC(Waters 2489紫外/可见检测器, 515定量输液泵, 77251定量进样阀), C18反相色谱柱(美国赛默飞公司, 250 mm×4.6 mm, 5 μm), 0.22 μm有机滤器NYLON6(天津市科亿隆实验设备有限公司), TD5A-WS台式低速离心机(湘仪集团), UV-2600紫外光谱仪(日本, 岛津), WH-3微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)。

1.1.2 试剂

线硫醚(纯度98.9%)由贵州大学提供, 丙酮(分析纯, 上海凌峰化学试剂有限公司), 石油醚(60~90 ℃分析纯, 南京化学试剂有限公司), 甲醇(分析纯, 南京化学试剂有限公司), 甲醇(色谱纯, 美国TEDIA公司), 水为超纯水, N-丙基乙二胺(primary secondary amine, PSA, 上海安普科技股份有限公司)。

1.2 试验方法 1.2.1 标准溶液配制

精确称取线硫醚0.050 6 g标准品于100 mL容量瓶中, 用色谱甲醇溶解并定容至刻度, 配制成质量浓度为500 mg·L-1的标准样品储备液。HPLC采用色谱甲醇配制成质量浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5和10 mg·L-1线硫醚系列标准溶液。

1.2.2 高效液相色谱检测条件

C18色谱柱; 流动相为甲醇和水溶液(体积比为75:25);流速0.6 mL·min-1; 检测波长为227 nm; 检测温度为室温; 进样量为20 μL。

1.2.3 水样前处理方法

预活化LC-18固相萃取小柱, 5 mL甲醇活化, 10 mL去离子水淋洗, 负压抽干。将20 mL水样注入小柱, 控制流速为1 mL·min-1, 弃流出液, 加大真空抽干剩余水分。用2 mL色谱甲醇洗脱, 收集洗脱液, 过0.22 μm有机滤膜, 待HPLC检测。

1.2.4 土样前处理方法

称取10 g土壤于50 mL具塞离心管中, 加入20 mL丙酮和水溶液(体积比为3:1)提取液, 超声提取30 min, 4 000 g离心5 min, 将上清液过滤于平底烧瓶中。土样再用提取液超声提取2次, 每次15 mL, 4 000 g离心5 min, 合并提取液于平底烧瓶中, 45 ℃旋转蒸发除去丙酮, 残留液待净化。

预活化LC-18固相萃取小柱, 5 mL甲醇活化, 10 mL去离子水淋洗。将除去丙酮的残留液过LC-18固相萃取小柱, 控制流速为1 mL·min-1, 弃流出液, 加大真空抽干剩余液体, 用2 mL色谱甲醇洗脱, 收集洗脱液, 过0.22 μm有机滤膜, 待HPLC检测。

1.2.5 黄瓜前处理方法

将黄瓜用粉碎机粉碎至匀浆, 称取10 g样品于50 mL具塞离心管中。依次加入15、10、10 mL丙酮超声提取3次, 每次30 min, 4 000 g离心10 min, 合并提取液于平底烧瓶中, 45 ℃旋转蒸发除去丙酮, 残留液待净化。

残留液分别用15、10和10 mL石油醚萃取3次, 弃水相, 有机相合并于圆底烧瓶中, 旋转浓缩仪蒸干, 加入2 mL HPLC流动相超声溶解, 加入50 mg PSA涡旋30 s, 4 000 g离心5 min, 离心后上清液过0.22 μm滤膜, 待HPLC检测。

1.2.6 辣椒前处理方法

将辣椒粉碎至匀浆, 称取10 g样品于50 mL具塞离心管中。丙酮为提取液, 超声提取3次, 每次30 min, 每次提取液体积分别为15、10和10 mL。提取后离心, 合并提取液, 旋转浓缩仪蒸去丙酮, 残留液待净化。

残留液用15、10和10 mL石油醚分3次萃取, 保留有机相并合并于圆底烧瓶中。旋转浓缩仪旋干石油醚, 加入2 mL流动相超声溶解, 待HPLC检测。

1.2.7 加标回收率测定

取未使用线硫醚的南京田间水、黄棕壤, 以及市场上的黄瓜和辣椒, 添加线硫醚标准溶液, 使水样中线硫醚的添加浓度为0.05、0.5和1 mg·L-1; 土样、黄瓜和辣椒中线硫醚的添加水平均为0.1、1和2 mg·kg-1。分别按照1.2.3至1.2.6节方法提取和净化样品。用1.2.2节方法定量检测。每个添加浓度重复3次。

2 结果与分析 2.1 色谱检测方法和标准曲线的绘制

高效液相色谱所用检测器为紫外/可见检测器, 当检测波长约为农药最大紫外吸收波长时, 能最大限度地提高仪器的检测灵敏度。溶于甲醇中的线硫醚经紫外全波长扫描后, 波长为227 nm时为最大吸收波长, 即选定227 nm为线硫醚HPLC的检测波长(图 1-A)。

图 1 线硫醚紫外全波长光谱图(A)和线硫醚标准样品(5 mg·L-1)的高效液相色谱图(B) Fig. 1 UV-visible spectrogram of exianliumi at full wavelength(A)and HPLC chromatogram of exianliumi standard samples(5 mg·L-1)(B)

流动相的选择需考虑农药的极性和与样品杂质峰的分离程度等因素。由于线硫醚的极性较小, 当以甲醇与水的混合溶液(体积比为80:20)为流动相时, 保留时间为9.128 min左右, 由于时间过短可能会与样品中的杂质峰相叠; 当以甲醇与水的混合溶液(体积比为65:35)为流动相时, 保留时间为31.153 min左右, 出峰时间又过长。最后确定线硫醚HPLC检测时以甲醇与水的体积比为75:25的混合溶液为流动相。

采用1.2.2节中高效液相色谱条件, 线硫醚出峰时间为11.643 min, 标准样品色谱图见图 1-B。以标准样品的质量浓度为横坐标, 相应的峰面积为纵坐标, 绘制标准曲线。结果表明:在线硫醚质量浓度为0.01~10 mg·L-1时, 质量浓度与峰面积之间呈良好的线性关系, 相关系数为0.999 8, 线性方程为y=973 688.462 2x-27 366.825 74;以信噪比(S/N)=3时所检测出线硫醚的量为最低检出限, 仪器最小检出量为0.2 ng。

2.2 添加回收率 2.2.1 水的添加回收率

水样上样至LC-18固相萃取小柱, 依次用1、1和2 mL甲醇洗脱, 分段收集, 在最后接收的2 mL甲醇洗脱液中未检测到线硫醚, 因此确定甲醇的洗脱体积为2 mL。选用LC-18固相萃取小柱可将提取、富集和净化同步完成, 且方法简单, 杂质较少, 并可与样品峰完全分离, 且回收率符合农药残留检测标准。空白水样和添加线硫醚水样的高效液相色谱图见图 2, 添加回收率结果见表 1。结果显示:水中添加0.05、0.5和1.0 mg·L-1线硫醚时, 平均添加回收率为97.38%~100.25%, RSD为1.22%~2.40%, 符合农药残留定量检测的要求。以所测空白基质响应为标准, 以S/N=3和S/N=10测出线硫醚在水中的检测限和定量限分别为1和5 μg·L-1

图 2 空白水样(a)及添加线硫醚(0.5 mg·L-1)水样(b)的HPLC色谱图 Fig. 2 Chromatograms of blank water(a)and water spiked with exianliumi(0.5 mg·L-1)(b)
表 1 线硫醚在不同样品中的添加回收率及相对标准偏差(n=3) Table 1 Recoveries and the relative standard deviations(RSD)of exianliumi in various samples(n=3)
样品
Sample
添加水平
Fortified level
平均回收率/%
Average recovery
相对标准偏差/%
RSD

Water
1.0 mg·L-1
0.5 mg·L-1
0.05 mg·L-1
100.25
97.47
97.38
1.55
2.40
1.22
土壤
Soil
2.0 mg·kg-1
1.0 mg·kg-1
0.1 mg·kg-1
103.87
92.73
102.60
2.79
5.63
2.21
黄瓜
Cucumber
2.0 mg·kg-1
1.0 mg·kg-1
0.1 mg·kg-1
93.67
91.83
103.91
6.24
2.47
1.11
辣椒
Hot pepper
2.0 mg·kg-1
1.0 mg·kg-1
0.1 mg·kg-1
91.06
94.85
106.29
0.72
6.76
2.56
2.2.2 土壤的添加回收率

为消除土壤中共提杂质对待测农药线硫醚的干扰, 土壤样品经超声提取后, 采用石油醚和二氯甲烷作为萃取溶剂的液-液萃取, 以及LC-18固相萃取小柱2种净化方法去除土壤杂质。结果发现, 以二氯甲烷为萃取剂, 虽样品色谱图中无杂质峰干扰, 但是回收率偏低; 以石油醚为萃取剂回收率较高, 但受个别共提组分影响重现性较差。采用LC-18固相萃取的方法, 能有效消除土壤中杂质的干扰, 且回收率较高。洗脱剂甲醇用量的确定方法同2.2.1节。从图 3可以看出:土壤中的杂质并不干扰待测组分的定量分析。当土壤线硫醚添加水平分别为0.1、1.0和2.0 mg·kg-1时, 平均添加回收率为92.73%~103.87%, RSD为2.21%~5.63%(表 1), 满足农药残留分析的要求。以土壤空白基质响应为标准, 以S/N=3和S/N=10测出线硫醚在土壤中的检测限和定量限分别为0.03和0.05 mg·kg-1

图 3 空白土样(a)及添加线硫醚(1.0 mg·kg-1)土样(b)的HPLC色谱图 Fig. 3 Chromatograms of blank soil(a)and soil sample spiked with exianliumi(1.0 mg·kg-1)(b)
2.2.3 黄瓜的添加回收率

线硫醚易溶于丙酮和二氯甲烷等有机溶剂, 所以样品中提取线硫醚的提取液多选择纯有机溶剂或有机溶剂比例较高的溶液。当采用二氯甲烷提取时回收率较低, 仅为39.05%;当加入2滴甲酸后回收率提升, 为55.07%。溶剂乙腈的极性较大, 采用乙腈作为提取液, 回收率可达79.57%。当采用丙酮为提取液时, 回收率提高, 为84.86%。故尝试在丙酮中加入一定配比的水和加入2滴甲酸作为提取液的2种方法, 其中用纯丙酮加入2滴甲酸的方法回收率最高, 可达到91.83%(图 4), 符合农药残留检测标准, 因此选用此种提取剂提取黄瓜样品。

图 4 不同提取液对黄瓜中线硫醚回收率的影响 Fig. 4 Effect of different extracts on the recovery of exianliumi in cucumber(n=3) 1.二氯甲烷Dichloromethane; 2.二氯甲烷和2滴甲酸Dichloromethane and 2 drops of formic acid; 3.丙酮/水(4:1)Acetone/water(4:1);4.丙酮Acetone; 5.丙酮和2滴甲酸Acetone and 2 drops of formic acid; 6.乙腈Acetonitrile.

净化方法采用石油醚和二氯甲烷作为萃取溶剂的液-液萃取法和LC-18固相萃取小柱法。结果表明:固相萃取净化后仍受杂质干扰, 线硫醚回收率过高; 用二氯甲烷进行液-液萃取回收率偏低; 而用石油醚作为萃取剂净化后的色谱图中杂质峰较少且回收率较高(图 5)。

图 5 不同净化方法对黄瓜中线硫醚回收率的影响 Fig. 5 Effect of different purification methods on the recovery of exianliumi in cucumber(n=3) 1. LC-18固相萃取小柱LC-18 solid phase extraction column; 2.石油醚萃取Petroleum ether extraction; 3.二氯甲烷萃取Dichloromethane extraction.

在石油醚反萃结束后, 经旋转蒸发有机相并定容上样后发现, 在样品峰附近有杂质峰, 其分离效果不太理想, 故拟采取加入净化剂的方法进一步除杂。分别试用了石墨化炭黑(graphitized carbon black, GCB)、C18和PSA 3种净化剂, 每种分别称取20和50 mg, 单独添加到2 mL同浓度的线硫醚标准溶液中, 涡旋30 s, 离心后取上清液过滤膜, 滤液用HPLC检测。结果发现, 20 mg GCB会对线硫醚造成19.93%的吸附, 50 mg GCB造成46.68%的吸附, C18和PSA均不会对线硫醚产生吸附。故在样品净化时分别试用C18和PSA, 根据两者的除杂效果最终选用加入50 mg PSA进一步净化。

空白黄瓜样品和添加待测农药的黄瓜样品的高效液相色谱图见图 6。从图中可以看出, 黄瓜中可共提的杂质峰与线硫醚的分离效果较好。当黄瓜中分别添加0.1、1.0和2.0 mg·kg-1线硫醚时, 平均添加回收率为91.83%~103.91%, RSD为1.11%~6.24%(表 1), 此检测方法可对黄瓜中线硫醚进行定性定量测定。以黄瓜空白基质响应为标准, 以S/N=3和S/N=10测出线硫醚在黄瓜样品中的检测限和定量限分别为0.016和0.05 mg·kg-1

图 6 空白黄瓜(a)及添加线硫醚(2.0 mg·kg-1)黄瓜(b)的HPLC色谱图 Fig. 6 Chromatograms of blank cucumber(a) and cucumber sample spiked with exianliumi(2.0 mg·kg-1)(b)
2.2.4 辣椒的添加回收率

因辣椒中色素较多, 为消除其对样品峰的影响选用石油醚作为萃取剂, 石油醚极性小, 对极性色素的溶解度较小, 可以起到富集和净化作用, 并且不用加PSA就能达到净化目的。从空白辣椒样品和添加线硫醚的辣椒样品的高效液相色谱图(图 7)可以看出, 辣椒中共提物质虽多, 但不影响待测组分的定量检测。当辣椒中分别添加0.1、1.0和2.0 mg·kg-1线硫醚时, 平均添加回收率为91.06%~106.29%, RSD为0.72%~6.76%(表 1), 此方法对辣椒中线硫醚的定量分析满足农药残留分析的标准。以辣椒空白基质响应为标准, 以S/N=3和S/N=10测出线硫醚在辣椒样品中的检测限和定量限分别为0.02和0.05 mg·kg-1

图 7 空白辣椒(a)及添加线硫醚(1.0 mg·kg-1)辣椒(b)的HPLC色谱图 Fig. 7 Chromatograms of blank hot pepper(a)and hot pepper sample spiked with exianliumi (1.0 mg·kg-1)(b)
2.2.5 实际样品的测定

应用所建立的土壤检测方法, 研究线硫醚在土壤中的光降解动态, 第10天时其残留量为0.327 mg·kg-1, 降解率为67.3%, 空白土壤中未检测出该农药(图 8)。

图 8 空白土壤(a)及含有线硫醚的土壤(b)经光照10 d后的HPLC色谱图 Fig. 8 Chromatogram of blank soil(a)and soil sample containing exianliumi(b)after 10 days of illumination
3 结论

建立了水、土壤、黄瓜和辣椒中线硫醚的残留检测方法。水样和土壤样采用LC-18固相萃取小柱净化, 黄瓜和辣椒采用石油醚萃取, HPLC定量检测。结果表明:该检测方法前处理方法简单, 线硫醚与杂质分离完全, 结果重现性好, 准确度和灵敏度均符合农药残留分析要求, 可用于水、土、黄瓜和辣椒4种基质中线硫醚残留量的检测。

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